אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

שיטה זו יכולה לעזור לענות על אחת משאלות המפתח בתחום הרבייה, כלומר כיצד ומתי תהליכים מווסתים גנטית משפיעים על גודל השמורה השחלתית שאנו יודעים שמשפיעים על נקבות, אריכות ימים רבייתית פרוטוקול זה ניתן לאמץ למחקרים בקנה מידה גדול תוך שימוש באותן טכניקות עבור שחלות שלמות משלבים התפתחותיים שונים. הוא מייצר נתונים הניתנים לייצור על ידי מתן כימות יעיל של תאי נבט. שיטה זו המיושמת על בעלי חיים מגוונים מבחינה גנטית מאותו המין יכולה לספק תובנה לגבי הגורמים הגנטיים ישירות להתפתחות תאי נבט ושחלות ואיברי התפתחות אחרים.

המדגים את ההליך יהיה נתנאל בוחט, מתמחה מחקר מהמעבדה שלי כדי להתחיל עם שלב השפע ולאבטח את העכברה הנשית המורדמת על גבה על ידי הצמדה עדינה של כל הרגליים דרך כריות הכפות בתנוחה רגועה על לוח. כדי לפתוח את חלל החזה של העכבר, חותכים בזהירות את הצלעות משני צידי עצם החזה ממש מתחת לעצם השכמה, תוך הימנעות מניקוב הריאות תופסות את העור או דשי הצלעות עם המלקחיים ומצמידים את הדשים כדי לחשוף את האיברים הפנימיים משתמשים במספריים של דיסקציה כדי לחתוך את האטריום הימני של הלב ולשחרר דם מהמערכת. לאחר מכן על ידי החזקת הלב עם מלקחיים להכניס מחט פרפוזיה לתוך החדר השמאלי ולשאוב 10 מיליליטרים של PBS בלחץ עדין וקבוע.

כאשר הרקמות כגון כליות הכבד ומערכת הרבייה הפכו מוורוד ללבן החליפו את ה- PBS ב- 1% paraformaldehyde או PFA שזה עתה נוצרו וממשיכים לזלוף עם כ -10 מיליליטרים של PFA. לאחר מכן אתרו את כרית השומן עם השחלות מתחת לכליה ונתחו בעדינות את כל מערכת הרבייה כולל השחלות של כרית השומן וקרני הרחם כדי להניח אותה בבקבוקון עם 4% PFA. תקן את השחלות בטמפרטורת החדר במשך 16 עד 24 שעות לפני שתחליף את ה- 4% PFA ב- 70% אתנול.

ביום הכתם לקצץ את השחלות לפני שממשיכים עם הכתם החיסוני. ביום הראשון של פרוטוקול הכתמת החיסון פיפטה מיליליטר אחד של PBS לכל באר לתוך מספר הבארות הרצוי בצלחת נקייה של 24 בארות. חתכו את קצהו של קצה פיפטה 1000 מיקרוליטר כדי ליצור פתח רחב והשתמשו בקצה הרחב כדי להעביר בעדינות את השחלות ההתבגרותיות מבקבוקונים עם 70% אתנול לתוך הבארות, ואז החליפו את PBS בבאר עם 0.8 מיליליטר טריים של PBS למחרת שאפתו PBS מהבארות כדי להחליף אותו ב-0.8 מיליליטר של חיץ החדירה לכל באר.

לאחר דגירה של הצלחות על השייקר בטמפרטורת החדר במשך ארבע שעות החליפו את מאגר החדירה בחיץ חסימה ביום השלישי, הכינו את הנוגדנים העיקריים על ידי דילול במאגר החסימה. כדי לדמיין את הביציות הדגירה של השחלות הטרום לידתיות והקדם-פוברטליות עם סמני הביציות. ביום השמיני שוטפים את הדגימות עם מאגר כביסה טרי למשך שעתיים ואז מחליפים את מאגר הכביסה ב-0.5 מיליליטר של תערובות הנוגדנים המשניות המדוללות במאגר חוסם.

אטמו את הצלחת בפרפילם כדי למנוע אידוי ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר בחושך במשך שלושה ימים. ביום ה-11 לאחר שטיפת הכתם החיסוני, שאפו את מאגר הכביסה ודגרו את הדגימות עם 0.8 מיליליטר של תמיסת תמיסה אחת מעוקב בקנה מידה של 37 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים בחושך. שינוי קנה המידה של פתרון אחד מעוקב אחד מדי יום.

ביום ה-15, שטפו את הדגימות שלוש פעמים במשך 10 דקות ו-0.8 מיליליטר של PBS בטמפרטורת החדר עם טלטולים עדינים. לאחר מכן החליפו את ה-PBS ב-0.8 מיליליטרים של 20% סוכרוז מגז טרי עם PBS ולאחר מכן רעידות עדינות בטמפרטורת החדר. לאחר שעה אחת להחליף את תמיסת 20% סוכרוז לטיפול בדגימות עם 0.8 מיליליטר של תמיסת שניים מעוקב בקנה מידה במשך ארבעה עד חמישה ימים, כפי שהוסבר קודם לכן.

כדי להכין מערך דגימה, השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר עם חתך הקצה כדי להעביר את השחלות ההתבגרותיות עם 15 עד 20 מיקרוליטרים של תמיסה מעוקב שתיים בקנה מידה גדול לאמצע באר ההדבקה. לאחר העברת השחלות לבאר הבודדת עם טיפה של תמיסת ניקוי הניחו בעדינות כיסוי על באר הדבק ולחצו כדי ליצור אטם הכרוך בדגימות ותמיסת ניקוי בין שני תלושי כיסוי. למקום ההדמיה, כריך החלקת הכיסוי בשקופית מתאם מיקרוסקופ מודפסת בתלת-ממד.

הגדר את הפרמטרים לרכישת תמונה בהתאם לליבות המיקרוסקופיה או מפרט היצרן. אם היא זמינה, השתמש ברכישת תמונה דו-כיוונית כדי לקצר את זמן הסריקה ולשפר את היעילות. התאם את ממוצע הקווים, ממוצע המסגרות וצבירת המסגרות בתוכנה.

הגדר את מחסנית Z על ידי זיהוי מיקום ההתחלה והסוף, ולאחר מכן בחר גודל צעד Z של שני מיקרומטרים עבור שחלות פרה-פוברטליות וחמישה מיקרומטרים עבור השחלות המתבגרות. לאחר מכן הפעל את תכונת הפיצוי Z ואת רווח העירור. הגדר את פיצוי Z עבור החלק התחתון והחלק העליון של הדגימה על ידי בחירת עוצמת לייזר עבור שניהם.

השתמש במצב ריצוף עבור דגימות גדולות יותר שלא ניתן ללכוד בשדה ראייה יחיד. הפעל את נווט התמונה וציין את מספר האריחים הדרושים ללכידת הדגימה כולה באמצעות כלי הסימון המלבני. לאחר סיום ההגדרה, התחל ברכישת התמונה עבור התמונות עם אריחים מרובים, התחל ברכישת תמונה עם הנווט כדי ללכוד את כל האריחים.

לאחר רכישת התמונה, שמור את כל התמונות. ואם נרכשו אריחים מרובים, הפעל את הכלי הממוזג בפסיפס כדי למזג את האריחים לתמונה אחת. כדי לקבוע את גודל הביציות, פתח את התמונה ובחר באפשרות פרוסה כדי לפתוח את תמונת מחסנית Zs.

בחר את אפשרות הקו ואת לוח המדידה ומדוד את המרחק על ידי ציור קו מקצה אחד של ביצית או סמן לקצה השני בנקודה הרחבה ביותר כדי לקבוע את קוטר X Y של הביצית. לעבור דרך הערימה ולקבל את טווח הקטרים עבור מספר ביציות מאותו סוג. השתמש באורך הקצר ביותר כאשר קריטריון בחירת הגודל עבור ביציות נחשב.

לאחר מכן, באפשרות תצוגה תלת-ממדית, בחר את תכונת הנקודות. בחלונית הסצנה הפעל את פונקציית הוספת הכתמים החדשים כדי לפתוח את לוח האלגוריתם. לאחר מכן בטל את הבחירה בכל הגדרות האלגוריתם כמסנן בחירת הגודל עם גודל הביציות שהתקבל קודם לכן.

לחץ על החץ קדימה של הערוץ כדי לעבור לערוץ המקור. לאחר מכן בחר את הערוץ עם הסמן המועדף והקלד את הקוטר הנרכש בקוטר המשוער X, Y. לאחר בחירת הגודל הפעל את התארכות ה- PSF של הדגם וחיסור הרקע אשר נקבעים באופן אוטומטי.

לאחר מכן, בחר את החץ הבודד קדימה כדי לעבור לחלונית כתמי המסנן והוסף את מסנן האיכות כדי לקבוע סף. כדי להבטיח את ההערכה המדויקת של מספרי הביציות להגדיל את התמונה. מאוחר יותר, לחץ על החץ הכפול כדי לסיים ספירות אוטומטיות.

השתמש בכרטיסיית העריכה כדי לבחור באופן ידני ביציות שהוחמצו או לבטל את הבחירה בחלקיקים שאינם קוציצים שנבחרו על ידי הסף האוטומטי. בסיום, רשום את הנתונים בכרטיסייה נתונים סטטיסטיים תחת הכרטיסייה הכוללת לניתוח נוסף. כדי להעריך את מספרי הביציות הכוללים ואת השחלות הפגומות, פתחו תמונות של השחלות השלמות עם MRS ובחרו את תכונת המסגרת.

תחת הגדרות המסגרת, בחר את סימני הסימון של רשת התיבה וגישה לתוויות. במיקום XYZ הכרטיסייה בחר 200 microme כדי ליצור סימני תקתוק עם 200 מרחבי מיקרומטר בכל מיקומי XYZ. באמצעות סימני קרציות של 200 מיקרומטר, בחר ביציות שנופלות בטווח של 50% מנפח כל שחלה.

לחץ על תכונת הכתמים ובחר את תוויות העריכה כדי לסווג את הביציות שנמצאות באזור 50% לפי צבע. בתמונות האפורות הייצוגיות, מרובות הפוטונים, של השחלות שאינן מחוררות וחדורות, ניתן היה לראות את הביציות הקטנות בזקיקים קדמוניים עם השכבה הדקה של צביעת DDX4 ציטופלסמית. בנוסף, נצפו הביציות הגדולות יותר בתוך הזקיקים הגדלים.

ההדמיות התלת-ממדיות מהתמונות הרב-פוטוניות של השחלות הטרום-לידתיות והשחלות שלאחר הלידה נחקרו. ביום שלאחר הלידה 28, השחלה מהנקבה הלא מוקרנת הכילה אוכלוסייה גדולה של ביציות קטנות בזקיקים הראשוניים. לעומת זאת, השחלות של הנקבה המוקרנת עם 0.5 אפור של קרינת הגמא היו נטולות לחלוטין של ביציות קטנות בזקיקים הראשוניים.

אבל ביציות גדולות יותר עדיין היו קיימות. לצורך כימות הביציות, תמונות הפוטונים הרב-ממדיות התלת-ממדיות עובדו בתוכנת MRS באמצעות המסנן הגוציאני והביציות בגדלים קטנים וגדולים זוהו וכומתו באמצעות תכונת הכתם. לאחר מכן, האחוז הממוצע של הביציות חושב בכל שלב בהשוואה למספר הממוצע הנוכחי בשלב המוקדם ביותר E 15.5 מספרי הביציות ירדו בחדות בין E 15.5 ל- E 18.5 ה- E 15.5 ו- E 18.5 ביציות עובריות ביטאו קו אחד אוF אחד P כפי שניתן לראות בתמונות מרובות הפוטונים.

ניתוח העוצמה הראה ביטויים גבוהים יותר של קו 1 או P אחד לכל ביצית ב-E 18.5 מאשר E 15.5. השחלות עם נזק קטן יכול לשמש לניתוח. המספרים הכוללים של הביציות נקבעים באמצעות תיקון חישובי.

המודל הייצוגי מראה ביציות חיוביות G CNA בשחלה E 15.5 עם חמישה אזורים של 10% המודגשים בשחלה שלמה. באופן דומה, נוצרה שחלה מדומה עם 10% אזורים מצטברים שחסרים בה עד 50% מהשחלה. מספרי הביציות הכוללים והשחלות המדומות הושוו לשחלות השלמות המקוריות.

וההבדל הוצג כסטיית האחוזים פרפוזיה טובה מביאה לאיכות תמונה טובה. לכן ודאו שכל הרקמות מנוקות באמצעות PBS לפני המעבר ל-PFA. יש לוודא כי השחלות חשופות לחלוטין על ידי חיתוך הרקמה הנוספת.

הפרוטוקול מאפשר ניתוח יעיל של מספר רב של דגימות, נתונים כמותיים המתקבלים מאוכלוסיות ייחוס גנטיות כגון תפוקה צולבת או גיוון שיתופית יסייעו בזיהוי משנים גנטיים של התפתחות ביציות ומספרי ביציות.