Name: שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: למד שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים. הטכניקות הפשוטות משתמשות בחומרי מעבדה נפוצים לבידוד אמין של מגירות תת-תאיות לחקר תהליכים פיזיולוגיים במצבים בריאים וחולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט EY12155, EY027193, ו EY027387 ל- JC. אנו מודים לד"ר ספירידון מיכלקיס (קלטק, פסדינה, ארה"ב) ולנטלי צ'ן (USC, לוס אנג'לס, ארה"ב) על הגהת כתב היד. ברצוננו גם להודות לד"ר סת' ראפינס (USC, לוס אנג'לס, ארה"ב) וד"ר יאנוס פטי-פיטרדי (USC, לוס אנג'לס, ארה"ב) על שסיפקו את הציוד הדרוש לאיסוף צילומי המחבר שסופקו. חומר מ: Kasey Rose ואח ', הפרדה של תאי קולטן פוטורצפטור ברשתית העכבר לניתוח חלבון, ניוון עצבי מולקולרי, פורסם [2017], [טבע ספרינגר].

<ol><li>Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+proteins+and+phototransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">G proteins and phototransduction.</a> Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).</li>
<li>Molday, R. S., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors at a glance.</a> Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).</li>
<li>Koch, K. W., Dell'Orco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+signaling+networks+in+vertebrate+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67(2015).</li>
<li>Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+light+intensity+threshold+for+retinal+damage+in+albino+rats+raised+under+6+lx%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx.</a> Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).</li>
<li>Brann, M. R., Cohen, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+expression+of+transducin+mRNA+and+translocation+of+transducin+in+rods+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina.</a> Science. 235 (4788), 585-587 (1987).</li>
<li>Philp, N. J., Chang, W., Long, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-stimulated+protein+movement+in+rod+photoreceptor+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina.</a> FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).</li>
<li>Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+induced+shift+and+binding+of+S-antigen+in+retinal+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods.</a> Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).</li>
<li>Roof, D. J., Heth, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transducin+in+retinal+rod+photoreceptor+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments.</a> Science. 241 (4867), 845-847 (1988).</li>
<li>Sokolov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+light-driven+translocation+of+transducin+between+the+two+major+compartments+of+rod+cells%3A+a+novel+mechanism+of+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation.</a> Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).</li>
<li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+translocation+is+induced+at+a+critical+threshold+of+visual+signaling+and+is+superstoichiometric+to+bleached+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).</li>
<li>Nair, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-dependent+redistribution+of+arrestin+in+vertebrate+rods+is+an+energy-independent+process+governed+by+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions.</a> Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).</li>
<li>Strissel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recoverin+undergoes+light-dependent+intracellular+translocation+in+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).</li>
<li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).</li>
<li>Majumder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+contributes+to+rod+survival+and+enhances+synaptic+transmission+from+rods+to+rod+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).</li>
<li>Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+photoreceptors+die+%28and+why+they+don%27t%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Why photoreceptors die (and why they don't).</a> BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).</li>
<li>Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+susceptibility+to+light+damage+in+an+arrestin+knockout+mouse+model+of+Oguchi+disease+%28stationary+night+blindness%29%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness).</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).</li>
<li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-1+expression+level+in+rods%3A+balancing+functional+performance+and+photoreceptor+health%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health.</a> Neuroscience. 174, 37-49 (2011).</li>
<li>McConnell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+retinal+outer+segment+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The isolation of retinal outer segment fragments.</a> The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).</li>
<li>Tsang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+target+enzyme+in+deactivation+of+photoreceptor+G+protein+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo.</a> Science. 282 (5386), 117-121 (1998).</li>
<li>Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recordings+of+retinal+bipolar+cells+in+response+to+extracellular+electrical+stimulation+in+wholemount+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).</li>
<li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research.+Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li>
<li>Hayashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+by+cyclin-dependent+protein+kinase+5+of+the+regulatory+subunit+of+retinal+cGMP+phosphodiesterase.+II.+Its+role+in+the+turnoff+of+phosphodiesterase+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).</li>
<li>Wolbring, G., Cook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+and+characterization+of+protein+kinase+C+from+bovine+retinal+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments.</a> European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).</li>
<li>Williams, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein+kinase+C+in+photoreceptor+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments.</a> Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).</li>
<li>Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+form+of+the+G+protein+beta+subunit+Gbeta5+is+specifically+expressed+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).</li>
<li>Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GTPase+activating+factor+for+transducin+in+rod+photoreceptors+is+the+complex+between+RGS9+and+type+5+G+protein+beta+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).</li>
<li>Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+rhodopsin%2Farrestin+complex+leads+to+retinal+degeneration+in+a+transgenic+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).</li>
<li>Chen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+photoresponses+and+light-induced+apoptosis+in+rods+lacking+rhodopsin+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mistrafficking+of+prenylated+proteins+causes+retinitis+pigmentosa+2%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2.</a> FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).</li>
<li>Weiss, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+differences+in+expression+of+G-protein-coupled+receptor+kinase+%28GRK%29+7+and+GRK1+in+mammalian+cone+photoreceptor+cells%3A+implications+for+cone+cell+phototransduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).</li>
<li>Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+forms+of+human+rhodopsin+kinase+%28GRK1%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1).</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).</li>
<li>Newton, A. C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+phosphorylation+of+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).</li>
<li>Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+protein+kinase+C+isoforms+are+required+for+rod+photoreceptor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).</li>
<li>Sokal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+kinase+C+isozymes+responsible+for+the+phosphorylation+of+photoreceptor-specific+RGS9-1+at+Ser475%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).</li>
<li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28(2017).</li>
<li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+degeneration%3A+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

מחלות רשתית רבות משפיעות על תאי קולטני המוט, מה שמוביל למוות מוט, ובסופו של דבר, אובדן ראייה מלא37. חלק ניכר מהמקורות הגנטיים והמכניסטיים של ניוון הרשתית האנושית שוחזרו בהצלחה במודלים רבים של עכברים לאורך השנים. בהקשר זה, היכולת להפריד בקלות ובאופן סלקטיבי תאים תת-תאיים של מוט בודדים מרשתית העכבר הקטנה תשפר מאוד את הבנתנו את היסודות הביוכימיים והמולקולריים המקומיים של מחלות רשתית. יתר על כן, האופי השכבות של הרשתית העצבית, בשילוב עם הסידור הייחודי והמקוטב מאוד של קולטני מוט, מאפשר בידוד של תאי מוט ...

תאי קולטני אור מוט, ארוזים היטב בשכבה החיצונית ביותר של הרשתית העצבית, הם חלק בלתי נפרד מראיית אור עמום. כדי לתפקד כמוני פוטון נאמנים, מוטות משתמשים במסלול איתות מבוסס חלבון G, המכונה פוטו-טרנסדוקציה, כדי ליצור תגובות מהירות, מוגברות וניתנות לשחזור ללכידת פוטון יחיד. תגובה זו לאור בסופו של דבר מפעילה שינוי בזרם בקרום הפלזמה ולאחר מכן מאותתת לשאר מערכת הראייה1. כפי ששמם מרמז, לכל תא מוט יש צורה ייחודית דמוית מוט והוא מציג מורפולוגיה תאית מקוטבת מאוד, המורכבת מקטע חיצוני (OS), קטע פנימי (IS), גוף התא (CB) ומסוף סינפטי (ST). לכל תא תת-תאי יש מכונות חלבון ספציפיות (קשורות ממברנה ומסיסות), תכונות ביו-מולקולריות ומתחמי חלבון הממלאים תפקידים מכריעים כגון פוטו-טרנסדוקציה חזותית, משק בית כללי וסינתזת חלבונים, והעברה סינפטית 2,3.
לפני יותר מ -30 שנה, התנועה ההדדית התלויה באור של חלבונים תת-תאיים, במיוחד טרנסדוצין (הרחק ממערכת ההפעלה) ו arrestin (לכיוון מערכת ההפעלה), נצפתה לראשונה4,5,5,6,7. בשלב מוקדם, תופעה נצפתה זו התקבלה בספקנות, בין היתר בשל הפגיעות של אימונוהיסטוכימיה למסכת אפיטופה8. בתחילת שנות ה -2000, טרנסלוקציה חלבון תלוי גירוי אושרה באמצעות טכניקת חתך פיזית קפדנית ומפרכת9. חתך משיק סדרתי של רשתית מכרסמים שטוחה קפואה ואחריו חיסונים גילה כי transducin9,10, arrestin11,12, ו recoverin13 כל לעבור הפצה מחדש תת תאית בתגובה לאור. הוא האמין כי טרנסלוקציה מונחית אור של חלבוני איתות מפתח אלה לא רק מווסת את הרגישות של מפל phototransduction9,14,15, אלא גם עשוי להיות neuroprotective מפני נזק אור16,17,18. מכיוון שהעברת חלבונים מונחית אור במוטות נראית משמעותית מאוד לביולוגיה ופיזיולוגיה של תאי מוט, טכניקות המאפשרות בידוד של תאים תת-תאיים שונים כדי לקבוע את התפלגות החלבון הן כלי מחקר יקרי ערך.
נכון לעכשיו, ישנן מספר שיטות שמטרתן לבודד את התאים התת-תאיים מוט. עם זאת, שיטות אלה יכולות להיות ארוכות וקשה להתרבות, או לדרוש כמות ניכרת של בידוד רשתית. תכשירי קטע חיצוני מוט (ROS) באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות19, למשל, משמש בדרך כלל כדי להפריד את ROS מן הומוגנט רשתית. שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב עבור כתם מערבי, אבל ההליך הוא זמן רב מאוד דורש מינימום של 8-12 retinae murine20. מצד שני, חתך משיק סדרתי של מורין קפוא ורשתית חולדה יושם בהצלחה בבידוד מערכת ההפעלה, IS, CB, ו ST9,11,13. עם זאת, שיטה זו מאתגרת מבחינה טכנית בשל הצורך של שיטוח מלא של רשתית מורין קטנה ומעוקלת מאוד כדי ליישר את שכבות הרשתית לפני חתך משיק. מכיוון שיש שפע של מודלים של עכברים ועכברים מהונדסים המסכמים מחלות של מערכת הראייה, יצירת טכניקה המפרידה באופן אמין, מהיר וקל מפריד בין תאי מוט בודדים מחזיקה בהבטחה בחשיפת התהליכים הפיזיולוגיים המתרחשים בכל תא מיוחד ואת המנגנונים העומדים בבסיס תהליכים חזותיים בבריאות ובמחלות.
כדי להקל על חקירות אלה, אנו מתארים שתי שיטות פילינג המבודדות תאים תת-תאיים מוט בקלות רבה יותר מהפרוטוקולים הנוכחיים. שיטת הפילינג הראשונה, המותאמת מטכניקה לחשיפת תאים דו-קוטביים בעלי תווית פלואורסצנטית להקלטת מהדק תיקון21, משתמשת בנייר סינון תאית כדי להסיר ברצף את ה- ROS מרשתית מורין חיה ומבודדת (איור 1). השיטה השנייה, המותאמת מהליך המבודד את שלוש שכבות תאי הרשתית העיקריות מרשתית אפרוח 22 וצפרדע23, משתמשת בסרט הדבקה כדי להסיר את החלק הפנימי ROS והמוט (RIS) מרשתית ליופילית (איור 2). ניתן להשלים את שני ההליכים תוך שעה אחת והם ידידותיים במידה ניכרת למשתמש. אנו מספקים אימות של האפקטיביות של שני פרוטוקולי הפרדה אלה עבור כתם מערבי על ידי שימוש ברשתית כהה מותאמת אור חשוף אור מעכברי C57BL / 6J כדי להדגים טרנסלוקציה הנגרמת על ידי אור של transducin מוט (GNAT1) ו arrestin (ARR1). יתר על כן, באמצעות שיטת פילינג הקלטת, אנו מספקים ראיות נוספות לכך שניתן להשתמש בטכניקה שלנו כדי לבחון ולטפל בחוסר עקביות בין נתוני לוקליזציה של חלבונים שנרכשו על ידי אימונוציטוכימיה (ICC) וכתמים מערביים. באופן ספציפי, הטכניקה שלנו הראתה כי: 1) חלבון קינאז C-אלפא (PKCα) איזופורם קיים לא רק בתאים דו קוטביים, אלא גם מורין ROS ו RIS, אם כי בריכוזים נמוכים24,25, ו 2) rhodopsin קינאז (GRK1) נמצא בעיקר במדגם מערכת ההפעלה המבודדת. נתונים אלה מדגימים את האפקטיביות של שתי טכניקות הפילינג שלנו להפרדה וכימות של חלבוני מוט ורשתית ספציפיים.

<table><tbody><tr><td>בקבוק מעבדה או מדיה של 100 מ"ל מצויד במתאם מכסה צינורות</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>100% O2 מיכל</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1000 מ"ל מסנן עליון לבקבוק, חומר מסנן PES, 0.22 &mu; m</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-235</td><td></td></tr><tr><td>4X SDS מאגר דגימה</td><td>Millipore Sigma</td><td>70607-3</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור פלקון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>95% O2 ו-5% CO2 tank</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>איימס' בינוני עם L-גלוטמין, ללא ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (99%, דיהידרט)</td><td>Sigma</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Drierite (סידן גופרתי נטול מים, >98% CaSO4, >2% CoCl2)</td><td>WA Hammond Drierite Co Ltd</td><td>21005</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Easy-Grip Petri Plate (פוליסטירן, 35 x 10 מ"מ)</td><td>Falcon-Corning</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות פלקון קלה לאחיזה (60 x 15 מ"מ)</td><td>אזמל נוצות פלקון-קורנינג</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>(מס' 10, 40 מ"מ)</td><td>VWR</td><td>100499-578</td><td></td></tr><tr><td>אזמל נוצות (מס' 11, 40 מ"מ)</td><td>VWT</td><td>100499-580</td><td></td></tr><tr><td>KCl (99%)</td><td>סיגמא</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>עלי גלולה קימבל קונטס</td><td>סיגמא</td><td>z359971</td><td></td></tr><tr><td>Labconco Fast-Freeze Flasks</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LN2 (חנקן נוזלי) + בקבוק Dewar או בקבוק ואקום דומה</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q/מים נטולי יונים</td><td>EMD Millipore</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (אבקה)</td><td>J.T. Baker</td><td>4062-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (קריסטל)</td><td>EMD Millipore</td><td>Sx0420-3</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Amresco</td><td>0865</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur EDTA</td><td>EMD</td><td>4005</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur HEPES, חומצה חופשית</td><td>EMD</td><td>5320</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>עטיפת ריינולדס רדיד אלומיניום</td><td>Reynolds Brands</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>סקוטש מג'יק טייפ (12.7 מ"מ x 32.9 מ')</td> <td>Scotch-3M</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D67501</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרפוגה מיני צנטריפוגה</td><td>Labnet International, Inc</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>תא דגירה של רקמות (נרכש או מיוצר בהתאמה אישית)</td> <td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>J.T.Baker</td><td>4103-02</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Signma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>VirTis Benchtop 2K Lyophilizer או מכונה מקבילה</td><td>SP Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VWR כיתה 413 נייר תיוק (קוטר 5.5 ס"מ, גודל נקבוביות 5 &mu; m)</td> <td>VWR</td><td>28310-015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 1 נייר סינון איכותי (קוטר 9 ס"מ, גודל נקבוביות 11 &mu; m)</td> <td>Whatman/GE Healthcare</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>צינור העברת קדח רחב, Global Scientific</td><td>VWR</td><td>76285-362</td><td></td></tr></tbody></table>

שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

קולטני אור מוט הם נוירונים חושיים מקוטבים מאוד עם תאים נפרדים. מוטות העכבר ארוכים (~ 80 מיקרומטר) ודקים (~ 2 מיקרומטר) והם ארוזים לרוחב בשכבה החיצונית ביותר של הרשתית, שכבת קולטן האור, וכתוצאה מכך יישור של תאים תת-תאיים אנלוגיים. באופן מסורתי, חתך משיק של הרשתית השטוחה הקפואה שימש לחקר התנועה והלוקליזציה של חלבונים בתוך תאי מוט שונים. עם זאת, העקמומיות הגבוהה של רשתית העכבר הדומיננטית מוט עושה חתך משיק מאתגר. מונע על ידי המחקר של הובלת חלבון בין תאים, פיתחנו שתי שיטות פילינג לבודד באופן אמין את החלק החיצוני מוט (ROS) ותאים תת תאיים אחרים עבור כתמים מערביים. הטכניקות המהירות והפשוטות יחסית שלנו מספקות שברים מועשרים ותת-תאיים ספציפיים כדי למדוד כמותית את ההפצה וההפצה מחדש של חלבונים קולטני אור חשובים במוטות רגילים. יתר על כן, טכניקות בידוד אלה יכולות גם להיות מותאמות בקלות כדי לבודד ולחקור כמותית את הרכב החלבון של שכבות תאיות אחרות בתוך רשתית בריאה ומנוונת כאחד.

האסטרטגיות הנוכחיות פותחו כדי לספק שיטות מהירות ופשוטות יחסית לבודד ולנתח חלבונים בין תאים תת-תאיים מוט ספציפיים לניתוח כתמים מערביים. יישמנו שתי טכניקות פילינג רציפות (איור 1 ואיור 2) ואחריהן חיסונים כדי להדגים שניתן להשתמש בשיטות אלה באופן אמין כדי לזהות את ההתפלגות הידועה של טרנסדוצין מוט (GNAT1) ו- arrestin (ARR1) הן בבעלי חיים כהים והן בבעלי חיים המותאמים לאור. כדי לאמת את האפקטיביות של שני הפרוטוקולים שלנו בדיוק בידוד תאים תת-תאיים מוט ללא זיהום משכבות תאי...

פרוטוקול זה מציג שתי טכניקות לבודד את התאים התת-תאיים של קולטני מוט מורין לניתוח חלבונים. השיטה הראשונה משתמשת בשרשתית חיה ונייר סינון תאית כדי להפריד מקטעים חיצוניים מוט, ואילו השני משתמש ברשתית ליופילית וקלטת דבק כדי לקלף שכבות מגזר פנימיות וחיצוניות מוט.

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

שתי טכניקות הפילינג שהוכחו כאן מבודדות תאים תת-תאיים בודדים של מוטות, ויכולות לעזור לחשוף את התהליכים הפיזיולוגיים החשובים המתרחשים בכל תא מיוחד במוטות בריאים וחולים. בידוד תאי מוט שונים מרשתית העכבר יכול להיות מאתגר. טכניקות פשוטות אלה משתמשות בחומרי מעבדה זולים ונפוצים כדי לבודד באופן אמין תאים תת-תאיים של מוטות לניתוח חלבונים.כדי להתחיל, למקם חתיכת נייר מסנן לתוך צלחת פטרי מלא איימס HEPES חוצץ בועות עם 100% חמצן. לאחר מכן, באמצעות פיפטת העברה רחבת-שעמום, העבר מלבן רשתית אחד המנותח מעכבר C57 Black 6J בן חודשיים עד שלושה חודשים. כוונו את הרשתית המחוצצת כלפי מעלה וודאו שצלבי האור פונים כלפי מטה לכיוון תחתית המנה.לאחר מכן, באמצעות פינצטה, לתפוס קלות את הצדדים של הרשתית חצויה ולהזיז אותו על גבי נייר הסינון. לאחר שהרשתית ממורכזת, הזיזו את נייר הסינון כלפי מעלה כך שהרשתית החצויה תיגע בנייר הסינון כדי ליצור מקטע חיצוני מוט, או ROS לסינון הידבקות בנייר. הרם בזהירות את נייר הסינון עם הרשתית המצורפת מתוך מאגר HEPES של איימס.מניחים את הצד התחתון של נייר הסינון על מגבת נייר ומטפטפים פעמיים עד שלוש פעמים לייבוש. מוסיפים טיפה של איימס HEPES על הצד של נייר המסנן עם הרשתית ומניחים את נייר המסנן על מגבת הנייר שוב לייבוש. לאחר מכן, מניחים את נייר הסינון עם הרשתית בחזרה לתוך צלחת פטרי, ובאמצעות פינצטה, בעדינות לדחוף את כל הקצוות של הרשתית חצויה למעלה והרחק מנייר המסנן מכל הצדדים.מקלפים בעדינות את הרשתית מנייר הסינון, נוגעים רק בהיקף הקיצוני של הרשתית כדי לשמור על שלמותה המבנית. לאחר מכן, הרם את נייר הסינון מצלחת פטרי והסר נוזל עודף על מגבת נייר, ומבטיח כי הצד במגע עם הרשתית אינו יוצר קשר עם מגבת הנייר. מניחים את נייר הסינון עם שכבת ROS החלקית לתוך צינור מסומן על קרח, ולשמור את הרשתית הקלופה שקועה במאגר HEPES איימס.חזור על תהליך הפילינג עבור רשתית חצויה זו כשבע עד שמונה פעמים כדי להסיר את שכבת ROS כולה. לאחר כל קליפה, מניחים את נייר הסינון באותו צינור כדי לשלב את כל ROS מבודד מרשתית חצויה אחת. שמור את הצינור המכיל את כל קליפות נייר הסינון של ROS מבודד על קרח לשימוש מיידי.באמצעות פינצטה, להעביר את הרשתית הקלופה הנותרת לתוך צינור מסומן כראוי ולשמור את הצינור על קרח לשימוש מיידי. כדי להכין את דגימת הרשתית לליופיליזציה, מניחים פיסת נייר סינון ומעבירים רשתית חצויה לצלחת פטרי מלאה במאגר של רינגר קר. לאחר מכן, באמצעות פינצטה, בזהירות להפוך את הרשתית כך שהוא מכוון קעור למעלה ולהזיז אותו לנוח על גבי נייר הסינון.הרם את נייר הסינון בקצוות כלפי מעלה כדי שחתיכת הרשתית החצויה תיגע בנייר הסינון. המשך להרים את נייר הסינון מהפתרון של רינגר. לאחר מכן, מניחים את הצד התחתון של נייר הסינון על מגבת נייר ומטפטפים בזהירות פעמיים עד שלוש פעמים כדי להסיר נוזל עודף.לאחר מכן, הרימו את נייר הסינון עם פינצטה והוסיפו טיפה של צלצולים קרים לצד נייר הסינון עם הרשתית. שוב, מניחים את נייר הסינון על מגבת הנייר כדי להסיר נוזל עודף. אחסנו כל רשתית דבוקה ודגימת נייר סינון בצלחת פטרי מלאה בצלצול קר עד שתהיה מוכנה להקפיא את כל הדגימות.לאחר מכן, באמצעות פינצטה, הרימו כל דגימה מהחוצץ של הצלצול הקר, והבטיחו כי הפינצטה תיצור קשר רק עם קצוות נייר הסינון, תוך הימנעות מהרשתית החצויה. מניחים את הצד התחתון של כל נייר סינון על מגבת נייר כדי להסיר נוזל עודף. לאחר מכן, מוסיפים טיפה של PBS קר על הצד של נייר המסנן שבו הרשתית דבוקה וטפטוף שוב את נייר הסינון על מגבת הנייר.מניחים את כל חתיכות נייר הסינון לתוך צלחת פטרי, ובאמצעות נייר טישו ללא מוך, לנדף את כל נוזל עודף המקיף את נייר הסינון. לאחר מכן, לעטוף בחוזקה את המנה כולה עם רדיד אלומיניום ולוודא כי הקצוות של רדיד האלומיניום מאובטחים ולחץ בצורה חלקה לתוך החלק התחתון של צלחת פטרי. לנקב קומץ של 0.1 עד 0.2 מילימטר חורים לתוך מכסה רדיד אלומיניום.לאחר מכן, באמצעות מלקחיים מתכת, בהדרגה להוריד את צלחת פטרי מכוסה רדיד אלומיניום לתוך חנקן נוזלי. שמור את הדגימות בחנקן נוזלי עד מוכן ליופיליזציה. עבור lyophilization, למקם את צלחת פטרי מכוסה רדיד אלומיניום לתוך בקבוק ייבוש בהקפאה ולחבר אותו למכונת lyophilizer בעקבות הפרוטוקול של היצרן.ליופיל את הרשתית במשך 30 דקות. לאחר lyophilization, לאסוף את המוט החיצוני ואת הקטע הפנימי על ידי הנחת בזהירות חתיכה קטנה של קלטת על גבי הרשתית lyophilized והחלת לחץ קל עם פינצטה כדי להבטיח שהוא נקשר עם שכבת photoreceptor. לקלף לאט את הקלטת משם ולוודא כי הן ROS ו RIS דבקו בקלטת.סרט לבן דק יהיה נוכח על פני השטח השבורים. זה RIS. כדי להפריד RIS זה, למקם חתיכה אחרת של קלטת ולדחוף את הסרט למטה על פני השטח השבורים.לאחר מכן, מניחים את פיסת הסרט רק עם השכבה הכתומה-ורודה לתוך צינור microcentrifuge המסומן כ- ROS, ופיסות נייר דבק עם השכבה הלבנה הדקה לתוך צינור אחר שכותרתו RIS. לאחר מכן, באמצעות קלטת, לאסוף את רקמת הרשתית הנותרת הממוקמת על נייר המסנן על ידי קילוף את השכבה העבה, לבן. לאחר מכן, מקם את הבידוד הזה לתוך צינור שכותרתו OIS.אם אתם משתמשים באותו יום, יש לאחסן את השכבות המבודדות מהרשתית הליופילית בטמפרטורת החדר. בבעלי חיים שהותאמו בחושך, ההתפלגות של GNAT1 ו- ARR1 התאימה באופן הדוק להפצות המצב האפל הידועות שלהם, שם אות GNAT1 היה החזק ביותר באופן ניכר בבידוד ROS, ואות ARR1 היה חזק יותר בבידוד ROS. כימות האותות GNAT1 ו- ARR1 הראה הבדלים משמעותיים בין תנאי אור כהה עבור GNAT1 ו- ARR1 בדגימות ROS ו- ROS.הן בדגימות כהות והן בדגימות המותאמות לאור, G פעימה 5S, ציטוכרום C, ואקטין אותות אינם נכללים בדגימות ROS, מדגימים היעדר זיהום משכבות תאיות אחרות. בנוסף, אות G beta 5L היה גלוי בבירור בדגימות ROS. סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים של המשטחים של רשתית ליופילית שלמה ומקולפת הראתה כי, לפני קילוף עם סרט דבק, פני השטח של רשתית ליופילית שלמה תאמו באופן הדוק את ROS גלילי אופייני.לאחר קליפת הסרט הראשונית, ROS ו RIS נראה הוסר לחלוטין, כפי שמעיד על ידי שכבה גרעינית אחידה נוכח על פני השטח של שאריות, קלוף, רשתית lyophilized. קליפות סרט לאחר מכן הסירו את RIS מהמשטח החופשי של השכבה הקלופה. טכניקה זו גם הוכיחה כי GRK1 חיסוניות היה אינטנסיבי ביותר בדגימות ROS ברשתית חשופה לאור, ונעדר בדגימות OIS.לעומת זאת, דגימות ROS ו- RIS הציגו אות קלוש עבור אלפא PKC, אשר בדרך כלל לא מזוהה ב- ROS או RIS על ידי כתמים immunofluorescence. לבסוף, קילוף סרט תת-אופטימלי יכול להניב דגימות מזוהמות מעט. מדגם RIS זוהם עם כמה מדגם OIS, לייצר הן G בטא 5L ו G בטא 5S רצועות, ואות אלפא PKC גבוה יותר.יש להקפיד בעת lyophilizing הרשתית. אם נעשה שימוש בטכניקת ליופיליזציה לא נכונה, הרשתית עלולה להינמס, מה שהופך את בידוד שכבות תת-תאיות מוטות שונות על ידי סרט דבק לבלתי אפשרי. שימוש בשיטת פילינג קלטת זו בשילוב עם qRT-PCR אפשר הפרדה של תמלילי קולטן פוטורצפטור משאר הרשתית.

two-peeling-methods-for-isolation-photoreceptor-cell-compartments

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה נדגים כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן אפיתל ריסי העין העכבר לגדל אותם בתרבית כדי ליצור כדורים רשתית משובט. התחומים כי הם מבודדים להחזיק את המאפיינים העיקריים של בתאי גזע: התחדשות עצמית multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

הטכניקה לנתיחה מדגים הוצאת הקרביים של הזגוגית, הרשתית, ואת העדשה מהעין העכבר, הפרדה על ידי צנטריפוגה, ואפיון עם מבחני חלבון.

הוצאת הקרביים של הזגוגיות עכבר רשתית עבור ניתוח proteomic

שיטת בידוד של תאים ברשתית יחיד הגברה הבאות של cDNAs שלהם מתואר. מתא בודד transcriptomics מגלה את מידת ההטרוגניות הנוכחי הסלולר ברקמות ו חושף גנים סמן חדשים אוכלוסיות תאים נדירות. בפרוטוקול הנלווה יכול להיות מותאם כך שיתאים רבים סוגי תאים שונים.

מתא בודד פרופיל של נוירונים רשתית מתפתחות מבוגרים

סרטון זה מדגים את ההליך לבידוד תאי גנגליון רשתית ראשוניים (RGCs) באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת מחקר עתידי של RGCs, במטרה להבין טוב יותר את הירידה הגדולה בחדות הראייה הנובעת מאובדן RGCs פונקציונליים במחלות נוירודגנרטיביות.

בידוד תאי גנגליון רשתית מורין באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות

רשתית עצבית של עכבר בגילים 8 ימים היא על גבי בלוק ג'לטין 4%. לאחר הבידוד של שכבת קולטי האור (200 מיקרומטר) על ידי vibratome, הקולטניים האור הם זורעים לאחר ניתוק מכאני והאנזימטית לתרבות. שכבת קולטי האור יכולה לשמש ל, ניתוחים ביוכימיים מולקולריים או השתלה.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

הרשתית האנושית מורכבת מולקולרי ושאיכות אזורים הנבדלים זה מזה, לרבות fovea, macula, הרשתית ההיקפית. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות ניקוב ביופסיות להסרה ידנית של רקמות שכבות מן העין האנושית כדי לנתח ולאסוף אלה אזורים הנבדלים זה מזה ברשתית לניתוח פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם.

דיסקציה של הרשתית האנושית ואת RPE-Choroid לניתוח פרוטיאומיה מבנית

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות העכבר RPE תאים, אשר יוצרים מונולייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על לוחות Transwell. ההליך לוקח בערך 3 שעות.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט לבידוד תאי אפיתל פיגמנטציה ברשתית (RPE) מעיני עכבר באופן מדורג. הפרוטוקול כולל אנוקליזציה ונתיחה של עיני עכבר, ולאחר מכן בידוד, זריעה והתרבות של תאי RPE.

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

מודלים של עכברים יכולים להיות כלים שימושיים לחקר הביולוגיה של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE). נקבע כי עכברים יכולים לפתח מערך של פתולוגיות RPE. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פנוטיפ כדי להבהיר ולכמת פתולוגיות RPE בעכברים באמצעות אור, אלקטרונים הולכה ומיקרוסקופ קונפוקלי.

פרוטוקול להערכה וכימות של פתולוגיות אפיתל פיגמנטי ברשתית במודלים עכבריים של ניוון מקולרי הקשור לגיל

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי &lt; 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

למד שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים. הטכניקות הפשוטות משתמשות בחומרי מעבדה נפוצים לבידוד אמין של מגירות תת-תאיות לחקר תהליכים פיזיולוגיים במצבים בריאים וחולים.

שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים

גלה סרטונים נוספים