אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans
October 14th, 2021
הפרוטוקול הבא מתאר את הפיתוח והאופטימיזציה של זרימת עבודה בתפוקה גבוהה עבור גידול תולעים, הדמיה פלואורסצנטית ועיבוד תמונה אוטומטי כדי לכמת אגרגטים של פוליגלוטמין כהערכה של שינויים בפרוטאוסטזיס.
גישה פשוטה ננקטה כדי לעקוב אחר שינויים בפרוטאוסטזיס על ידי הערכת צבירת פוליגלוטמין ומתן מסגרת שיכולה לשמש ליישומי תפוקה גבוהה. ניקוד פנוטיפ כמו מספר הצברים על ידי אני יכול להיות סובייקטיבי. אוטומציה של ספירה מצטברת מאפשרת לנו לחסל הטיה כזו, להגדיל את התפוקה ואת יכולת השכפול.
שיטה זו מסייעת לזהות גנים חיידקיים התורמים לשיבוש הפרוטאוסטזיס של המארח. הבנת תרומתם של גנים חיידקיים בודדים תסייע לנו להבין את משמעותה בפתוגנזה של מחלות כמו אלצהיימר, פרקינסון והנטינגטון. התחילו בהסרת הצלחות המכילות תולעים מהמקפיא ותנו להן להפשיר בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן נגבו את העיבוי העודף והסירו את המכסה לפני ההדמיה. השתמש בהגדרות המיקרוסקופ עם זמן חשיפה של 500 אלפיות השנייה, הגדלה של 40 X עם מתאם מצלמה של 0.63 X ועוצמת GFP המוגדרת ל-100% במהלך לכידת התמונה. כעת התאימו את פקדי האור המועברים עד שהתולעים ייראו מוארות בבהירות בהשוואה לרקע הכהה, תוך הימנעות מחשיפת יתר.
שנה את מיקומי התולעים בתוך הבאר כדי למנוע גוש יתר על ידי שימוש בקצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי לדחוף בעדינות את התולעים לתנוחה הרצויה. הגדר את הערוץ למסנן GFP ליצירת מישור מוקד עבור שתי התמונות. צלם תמונת שדה בהיר.
צלם תמונה פלואורסצנטית מתאימה מבלי להפריע לצלחת, או לשנות את המיקוד של המיקרוסקופ. עכשיו כדי להעריך את התמונות, תחילה להוריד את CellProfiler. פתח את התוכנה, גרור ושחרר את התמונות המעניינות לתוך תיבת התמונות.
לחץ על התמונות ברשימת הקבצים כדי לפתוח אותן. בחר את זכוכית המגדלת כדי להדגיש אזור עניין ואת סמל החץ כדי למדוד את אורך התולעים והאגרגטים. רחף מעל האובייקט הרצוי כדי לקבוע את ערך העוצמה שלו, אותו ניתן לראות בחלק התחתון של המסך.
כדי להשתמש בצנרת ניתוח התמונות של CellProfiler, תן שם לצמדי התמונות כראוי כמתואר בכתב היד של הטקסט לאחר הורדת CellProfiler מהאתר הרשמי. הורד את הצינור והעלה אותו ל- CellProfiler על-ידי בחירת קובץ, ייבוא וצינור מהקובץ. בחר את מודול התולעים הלא סבוכות כדי לפתוח את ההגדרות שלו כדי לטעון ערכת אימון המשמשת לזיהוי תולעים במודול התולעים הלא סבוכות.
לאחר מכן זהה את שם הקובץ של ערכת האימונים. בחר את סמל קובץ ההעלאה והעלה גם את הקובץ המשלים. העלה תמונות על-ידי בחירת מודול התמונות בפינה השמאלית העליונה.
ולאחר מכן גרור ושחרר תמונות בעלות שם תקין. לפני ניתוח התמונות, בחר את תיקיית הפלט הרצויה שתשמש לאחסון התוצאות על ידי לחיצה על לחצן הגדרות הפלט הממוקם בסמוך לפינה השמאלית התחתונה של התוכנית. לאחר מכן בחר את סמל התיקיה מימין לפלט ברירת המחדל כדי לבחור את מיקום הפלט הרצוי.
בחר את סמל ניתוח התמונות כדי להתחיל בניתוח תמונות. אם הניתוח לוקח זמן רב מדי להשלים והוא תקוע בעיבוד תמונה בודדת, בטל את הריצה וזיהה את התמונה הלא מעובדת על ידי מיון בתיקיית הפלט, וציין איזה שם תמונה לא נמצא. לאחר ניתוח מלא, התוכנה תארגן את התוצאות לגיליון אלקטרוני של Excel המכיל תולעים בודדות בעמודה N, ואת מספר הצברים המתאים בעמודה K.הורד את מארגן המטא-נתונים כדי לארגן בנוחות נתונים מקובץ ה- CSV של הפלט מ- CellProfiler.
עבור מערכת ההפעלה Windows, אתר את הקובץ שהורדת וחלץ אותו למיקום הרצוי. אתר ופתח את התיקיה שחולצה בשם gui_Windowsos_64x. והפעל את היישום על ידי לחיצה על סמל היישום GUI.
בקשה עשויה להיפתח ולבקש הרשאה לפעול. בחר מידע נוסף ולאחר מכן לחץ על הפעל בכל מקרה. מארגן המטא-נתונים מוכן כעת לגרור ולשחרר קבצי CSV של פלט CellProfiler.
עבור Mac OS, אתר את הקובץ שהורדת וחלץ את קובץ היישום של מערך המטא-נתונים של הקובץ. פתח את התיקיה שחולצה ונמצאה בהורדות. לחץ לחיצה ימנית על יישום ממשק המשתמש הגרפי ובחר פתח.
תופיע הנחיה המבקשת רשות לפתוח בשל היעדר רישיון רשמי. בחר פתח. לאחר שיישום מארגן המטא-נתונים שלך פתוח במערכת ההפעלה המתאימה, לחץ על העלה את הקבצים שלך לכאן, או גרור ושחרר את קבצי ה- CSV הרצויים של CellProfiler.
לחץ על כפתור הארגון, שיביא את המשתמש למסך חדש עם כפתור הורדת קבצים. לחץ על הלחצן ובחר את המיקום הרצוי כדי לשמור את קובץ הפלט. קובץ הפלט יופיע כשם הקובץ המקורי עם סיומת _organized שנוספה לשם הקובץ.
בנוכחות FUDR, לתולעים שניזונו מחיידקים שונים היה גודל גוף עקבי יותר שאיפשר זיהוי תולעים אחיד ומדויק יותר, ובכך פתר את בעיית הצפיפות. הקפאת התולעים שיפרה את זיהוי הצבירה של PolyQ על ידי ביטול הפלואורסצנציה ברקע, כמו גם הדיוק של ספירה אוטומטית הדומה לספירה ידנית. תאורת שדה בהיר הפוכה שימשה לזיהוי כל C.elegans וערוץ GFP כדי לצלם אגרגטים של polyQ YFP.
זיהוי תולעים, התרת סבך וכימות צבירה עבור כל תולעת נעשו על ידי החלת צינור עיבוד תמונה מותאם CellProfiler, המאפשר קבלת מספר האגרגטים לכל תולעת בודדת. ההבדל בין היעילות של כימות צבירה אוטומטי לבין שימוש בצנרת CellProfiler היה מזערי, מה שמצביע על כך שניתן ליישם את השיטה האוטומטית על מסכים בקנה מידה גדול. מתוך 90 זני חיידקים שנבדקו, התיישבות במעי C.elegans עם מועמד אחד הראתה ירידה משמעותית במספר הצברים.
ניסויי האישור על ידי ספירה ידנית גילו שאף אחד מהמוטאנטים, כולל זה שהפחית באופן משמעותי את מספר האגרגטים, לא השפיע על צבירת ה-polyQ. חוקרים המחליטים להשתמש במסגרת זו צריכים להבין שהצעדים המתוארים אינם מוחלטים. שינוי והבנה בסיסית של כיצד לתמרן את CellProfiler חיוניים להצלחה.
ניתן להשתמש בגישות ביוכימיות נוספות כגון כתם מערבי כדי לאשר צבירה של polyQ.
סקירה כללית
המחקר הזה מפתח זרימת עבודה מהירה לתרבות תולעים, הדמיית פלואורסנציה ועיבוד תמונה אוטומטי כדי לכמת הצטברות פוליגלוטמין כמדד לשינויים בפרוטאוסטאזיס. השיטה משפרת את הערכת ההצטברות הזו, במיוחד בחקירת תפקידם במחלות ניווניות של מערכת העצבים.
רכיבי המחקר העיקריים
תחום המחקר
- פרוטאוסטאזיס
- מחלות ניווניות של מערכת העצבים
- בדיקת תפוקה גבוהה
רקע
- הצטברות פוליגלוטמין קשורה למחלות כמו אלצהיימר, פרקינסון והנטינגטון.
- הבנת תרומת גנים חיידקיים לפרוטאוסטאזיס לקוי היא חיונית.
- שיטות ניקוד מסורתיות להצטברות יכולות להיות סובייקטיביות.
שיטות ששימשו
- הדמיה וניתוח מהירים באמצעות CellProfiler
- C. elegans כמודל ביולוגי
- כימות אוטומטי של הצטברות פוליגלוטמין
תוצאות עיקריות
- עיבוד תמונה אוטומטי מאפשר הסרת הטיה ושיפור יכולת השחזור בספירת הצטברות.
- זוהו גנים חיידקיים המשפיעים על פרוטאוסטאזיס של המארח, עם ממצאים משמעותיים במספרי הצטברות תולעים.
- תוצאות מאומתות מצביעות על כך שאוטומציה דומה לספירה ידנית, התומכת במסכים בקנה מידה גדול.
מסקנות
- המחקר הזה מספק מסגרת אמינה לחקר פרוטאוסטאזיס באמצעות הצטברות פוליגלוטמין.
- תובנות שהושגו באמצעות שיטה זו רלוונטיות להבנת מנגנונים במחלות ניווניות של מערכת העצבים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Automating aggregate quantification in C. elegans addresses the need for high-throughput, bias-free assessment of proteostasis in neurodegenerative disease models. By standardizing image acquisition and CellProfiler-based analysis, the method enables reproducible screening of large compound or genetic libraries. This supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines for protein conformational diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying polyglutamine aggregation as a proxy for proteostasis disruption.
- Operational Value: Reduces subjectivity in phenotypic scoring, improving data reliability for target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts for mechanism-based compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative aggregate counts per worm, enabling robust assay readouts for screening campaigns.
- Operational Value: Increases throughput and reproducibility through automation, reducing manual labor and inter-operator variability.
- Assay Readiness: Produces structured output (Excel spreadsheet with worm and aggregate counts) compatible with downstream data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links C. elegans proteostasis models to human neurodegenerative disease mechanisms via conserved polyQ aggregation pathways.
- Mechanistic De-risking: Facilitates identification of bacterial or genetic modifiers of aggregation, supporting target validation in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Enables cross-functional teams to compare conditions using normalized, automated aggregate quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative proteostasis readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on proteostasis mechanisms by enabling objective, high-content aggregation phenotyping.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized worm imaging and analysis compatible with 96-well or larger format screens.
- Analytics: Produces quantifiable dependent variable measurements (aggregates per worm) that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects invertebrate model findings to human disease pathways through conserved aggregation biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline adaptable to multiple proteostasis targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating bias from manual aggregate counting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized image processing and automated data output.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling large-scale screens with reduced hands-on time and higher data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable, quantitative proteostasis biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and GFP/YFP imaging parameters for polyQ detection.
- Depends on CellProfiler software and associated pipeline configuration for automated worm and aggregate segmentation.
- Necessitates standardized image naming and folder organization for successful batch processing.
- Benefits from FUDR treatment to reduce worm size variability and improve detection accuracy in high-density wells.
- Relies on user training to adapt the pipeline for different worm strains, expression patterns, or imaging setups.
