Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

מחקר הגנטיקה הפיק תועלת רבה מהשחרור של רצף הגנום האנושי. Pyro sequencing היא מערכת ייחודית המאפשרת ניתוח של שונות גנטית, כמו גם חוסר איזון אללי של RNA, סטטוס מתילציה של DNA ומספר עותקים של גנים. בסרטון זה, אנו מדגימים תגובת pyro sequencing בסיסית לניתוח גנטי.

שלום, אני קריסטי קינג מהמעבדה של ד"ר צ'ארלס איבי וד"ר בריאן גייג' במחלקה לרפואה פנימית בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון. היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע pyro sequencing. פרוצדורה זו שימושית כיוון שהיא אחת השיטות היסודיות והפשוטות ביותר המשמשות לניתוח SNPs.

ריצוף פירו (Pyro sequencing) מבוסס על ריצוף באמצעות סינתזה, המנצל את שחרור הפירופוספט בכל פעם שנוקלאוטיד נשלב בשרשרת DNA פתוחה בקצה ' שלושה. לאחר טעינת הפלטה, נוקלאוטידים נשלבים על בסיס רצף המסופק על ידי התוכנה. לאחר שחרורו, הפירופוספט משמש בתגובה הגורמת לשחרור ATP, אשר משמש את הלוסיפראז להמרת לוציפרין ללוציפרין מחומצן, דבר המוביל לפליטת אור. האור הנפלט נאסף על ידי מצלמת CCD ונרשם כפסגות, הידועות גם כפירוס (pyros).

נוקלאוטידים שלא נטמעו בשרשרת ה-DNA מעוכבים על ידי AP pyra כדי למנוע רעש רקע. הליך זה כולל את השלבים הבאים: תכנון הבדיקה, אלקטרופורזה של ג'ל PCR לבקרת איכות וריצוף pyro.

אם כן, נתחיל בריצוף פיירו (pyro sequencing). כדי לבצע ריצוף פיירו, יש להכין תחילה תוצר PCR. PCR עבור ריצוף פיירו דורש יותר מחזורים מרוב ה-PCR-ים כדי להבטיח שכל הפריימר ינוצל, בערך 50 מחזורים.

ריצוף Pyro דורש גם שאחד מפריימרי ה-PCR יהיה ביוטינילי (biotinylated). לבסוף, חשוב לציין כי נדרש גם פריימר פנימי. תכנון יעיל של הבדיקה יכול להתבצע באמצעות תוכנה המסופקת עם הריצוף מסוג Pyro כדי להבטיח שאין זיהום.

וכדי לאשר את נוכחותו של תוצר ה-PCR, יש להריץ ג'ל על מספר דגימות וכן על ביקורת שלילית. להכנת פלטת ה-pyro sequencing, יש להוסיף 12 µL מתערובת הפריימרים של ה-pyro sequencing לפלטת ה-pyro sequencing בעלת 96 בארות. לצורך כך נדרשת תערובת של 43.2 µL של הפריימר הפנימי, יחד עם 1396.8 µL של annealing buffer; לאחר מכן יש לכסות את פלטת ה-pyro sequencing בסרט דביק.

אם ההכנה אורכת יותר מ-50 דקות, הוסף לכל באר בלוח ה-PCR בעל 96 בארות 70 µL של תערובת SRO speed mix המכילה 240 µL של sero beads מצופים בסטראפטיבידין, 560 µL של תמיסת קישור (binding buffer), המורכבת מ-Tris, sodium chloride, EDTA ו-Tween 20, ו-3,600 µL של מים, וסגור את המכסה היטב. הנח את לוח ה-PCR בעל 96 הבארים עם תערובת החרו지를 במנער פלטות (plate shaker) למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

ודאו שהמכסה סגור היטב כדי למנוע זיהום צולב בין הבארות. שלב זה יאפשר קישור יסודי של חרוזי spheros מצופים ב-strep ENC לתג הביוטין הנמצא על פריימר ה-PCR. הכינו עמדת עבודה להכנת הפלטות.

זה כולל את תבניות הריאגנטים, מגש תערובת תוצרי ה-PCR והחרוזים, ומגש הפריימרים של ה-pyro sequencing. ודאו שפלטת תערובת תוצרי ה-PCR והחרוזים וכן מגש הפריימרים של ה-pyro sequencing מיושרים כראוי, כך שהשליליים נמצאים באותה אוריינטציה. לפני העברת הדגימות, נערו את כלי הוואקום, כשהוא כבוי, במים נקיים כדי לשחרר חרוזים או שאריות שעשויים להיות עליו.

שפכו את יתרת המים, מלאו מחדש את האמבט והפעילו את הוואקום. השאירו את כלי הוואקום באמבט עד שכל המים יסוקו, מה שייקח כ-30 שניות. מקמו את קצות המסנן של כלי הוואקום בבארות של פלטת תערובת חרוזי ה-PCR והשאירו אותם שם עד שכל הנוזל יסוק מהפלטה.

ניתן להשתמש בערכור תנועות עדינות כדי למנוע מתח פשטי. הניחו את הוואקום באמית ה-70% ethanol כאשר הנוזל מתחיל לזרום דרך הפיתול. אפשרו לקצות המסננת לשאוב את ה-ethanol למשך חמש שניות.

חזור על הפעולה עבור נתרן הידרוקסיד בריכוז 0.2 molar, אשר דנטורביליז את ה-DNA ל-PCR גדיל, ועבור תמיסת השטיפה. כדי לנקות ולנטרל את תוצר ה-PCR. נתק את צינור הוואקום מכלי הוואקום והנח את כלי הוואקום לתוך פלטת ה-pyro sequencing המכילה את הפריימר של ה-pyro sequencing בתערובת של kneeling buffer.

אם צינור הוואקום עדיין מחובר, בעת ההנחה בתוך פלטת ה-pyro sequencing, תערובת הפריימרים תישאב החוצה. קצות הטיפים יגרמו לאובדן של תוצר ה-PCR. נענעו או הניעו בעדינות את קצות הוואקום בתוך הבארות של פלטת ה-pyro sequencing כדי לפזר את תוצר ה-PCR.

הסר את כלי הוואקום מלוח הריצוף הפיירוגני (pyro sequencing plate) לאחר סיום הניעור או הנעירה, חבר מחדש את כלי הוואקום לצינור והנח את הכלי במים נקיים כדי לנקות אותו עבור הלוח הבא. הנח את לוח הריצוף הפיירוגני על בלוק חימום למשך שתי דקות בטמפרטורה של 80 °C. לאחר שתי דקות, הסר את הלוח מבלוק החימום והנח אותו על משטח קריר.

לאחר הקירור, ניתן להשתמש בסרט דביק לכיסוי הפלטה, אלא אם כן הפלטה תוכנס למכשיר תוך 15 דקות כדי למנוע התאיידות. כעת הגיע הזמן להתחיל ב-pyroSequencing. השלב הראשון ב-pyro sequencing הוא הזנת פרטי הבדיקה למחשב.

תחת רשומת simplex, בחרו ברשומה חדשה והזינו את פרטי הבדיקה, כולל שם מזהה (ID) ואת הרצף לניתוח, המסופק על ידי תוכנת תכנון הבדיקה ומאפשר בקרת איכות; בחרו את סדר החלוקה (dispensation order), המספק את הרצף סביב ה-SNP בתוספת בסיסי בקרה. לבסוף, בחרו בהיסטוגרמות כדי לקבל ייצוג חזותי של המראה הצפוי של הפיגרמה (pyrogram). כעת הגיע הזמן להזין הרצת snip.

בלשונית general ובסעיף snip runs, הזינו שם להרצה ובחרו את פרמטרי המכשיר עבור ההרצה. בלשונית setup, בחרו את רשומת הבדיקה (assay) וגררו אותה על פני הפלטה. להזנת הבדיקה הנבחרת לפלטה, חשוב לציין כי אין צורך להשתמש בפלטה כולה, כך שניתן להשבית בארות שונות לצורך הניתוח, וכן ניתן להריץ בדיקות רבות ושונות על אותה פלטה.

לחצו על לשונית התצוגה (view) ולאחר מכן בחרו ב-Run. עמוד זה מפרט את הנפחים המתאימים של הנוקלאוטידים, האנזים והסובסטרט הדרושים להרצה. נקו הן את קצות הנימיות/הנוקלאוטידים והן את קצות הריאגנטים לפני השימוש.

מלאו את הטיפים במים והפעילו לחץ בחלק העליון של הטיפ כדי לבדוק אם קיימות סתימות. אם מים אינם מסתננים מהחלק התחתון של הטיפ, רוקנו ומלאו אותו שוב מספר פעמים כדי לנסות לדחוף את המים דרכו. לחלופין, ניתן לבצע סוניקציה לטיפים אם הטיפ נותר סתום.

יש להשליך את הטיפים ולהשתמש בטיפים חדשים. יש לערבב מחדש את האנזים והסובסטרט עם מים לפני השימוש. כדי למנוע היווצרות בועות אוויר שעלולות לגרום לחסימות של הטיפים או לחלוקה לא עקבית, ניתן לאחסן אנזים וסובסטרט שערבובם בוצע אך לא נעשה בהם שימוש בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.

לשימוש עתידי בטיפים לדיספנסציה קפילרית בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה, הכינו מהילול של 1:1 עם הנוקלאוטידים ו-te buffer P eight. ערבבו היטב לפני השימוש. מלאו את הטיפים של הנוקלאוטידים והריאגנטים בנפחים המתאימים בהתאם לכמויות המוצעות על ידי התוכנה.

יש להזרים את הנוזל בעדינות לאורך דפנות הטיפים כדי למנוע כניסת בועות אוויר אליהם שעלולות לגרום לסתימות. יש לוודא שאין בועות אוויר בטיפים להזרמת הנוקלאוטידים. אם קיימות בועות אוויר, פשוט הקישו על דפנות הטיפים עד שהבועות יעלו לפני השטח, או הסירו אותן באמצעות טיפ פיפט נקי.

הריצו פלטת בדיקה לאחר מילוי המחסנית. מקמו את המחסנית במכשיר הריצוף הפירו-סקוונסינג (pyro sequencing) ואת פלטת הבדיקה בפלטפורמת פלטות 96 הבארים. הנחת סרט דביק מעל הפלטה מאפשרת לראות בקלות את חלוקת הריאגנטים והנוקלאוטידים.

בחר בלשונית המכשיר (instrument) בצד שמאל של המסך, ולאחר מכן לחץ על "ניהול" (manage). בחר את המכשיר מתוך התפריט הנפתח. לחץ על "בדיקה" (test), ואז תופיע הודעת אזהרה.

תתבקש לבדוק אם פלטת הבדיקה הוכנסה למכשיר. לחץ על אישור. עם סיום הפעולה, הוצא את פלטת הבדיקה; במרכז הפלטת הבדיקה צריכות להופיע טיפות נוזל מעל שש מהבארות, המייצגות ארבעה נוקלאוטידים, אנזים ותסבסובית.

אם ישנן פחות משש נקודות קטנות, אירעה סתימה ויש לבדוק את הקצוות ולהסיר מהם כל חסימה. הנח את הפלטה בפלטפורמת הפלטות בעלת 96 בארות של ה-pyro sequencing. סגור את כל המנופים ולחץ על run עבור הפלטה הבודדת.

הגדירו את הריצה, את האנזים, את הסובסטרט ואת הנוקלאוטידים שיוזרמו בסדר שנקבע מראש. לאחר שהריצה נותחה על ידי מכשיר ה-pyrosequencer, הגיע הזמן לבחון את תוצאות הריצה. בארות כחולות מייצגות גנוטיפ תקין ותוצאת pyro תקינה.

בארים שצבען כתום דורשות התערבות אנושית וניתן לערוך אותן על ידי לחיצה על הבאר הרלוונטית ופתיחת ההיסטוגרמה החזויה. ניתן לסמן גנוטיפ כעבר, נכשל או נבדק, כמו גם לשנות את הגנוטיפ עצמו באופן המתאים. לאחר עריכת באר, עיגול כהה יופיע במפת הפלטה.

יש לדרג ביקורות שליליות כשליליות. ייתכן שיופיעו שיאים שאינם ספציפיים בבארות השליליות, עם זאת, הדבר נגרם בדרך כלל על ידי לולאות של הפריימר הפנימי. כך שהראינו לכם כיצד לבצע ריצוף של פולימורפיזם ב-genomic אנושי.

ריצוף DNA בשיטת Pyro sequencing שימושי יותר מנהלי ריצוף אחרים מכיוון שהוא ניתן להתאמה למגוון רחב של יישומים. הוא גם חסון מספיק כדי לטפל ב-DNA מכל מקור, כולל DNA בריכוז נמוך או כזה שעבר דגרדציה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להתחיל עם תוצר PCR נקי ואיכותי.

כללו ביקורת שלילית עבור כל בדיקה וודאו שכל הרכיבים שלכם תקינים. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.