Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

מחקר גנטי הפיק תועלת רבה משחרור רצף הגנום האנושי. ריצוף Pyro הוא מערכת ייחודית המאפשרת ניתוח של שונות גנטית כמו גם חוסר איזון אללי של RNA, DNA, מצב מתילציה ומספר עותק גנים. בסרטון זה, אנו מדגימים תגובת ריצוף פירו בסיסית לניתוח גנטי.

היי, אני קריסטי קינג מהמעבדה של ד"ר צ'ארלס אבי וד"ר בריאן גייג' במחלקה לרפואה פנימית בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון. היום אנו הולכים להראות לכם נוהל לריצוף פירו. הליך זה שימושי מכיוון שזו אחת השיטות היסודיות אך הפשוטות ביותר המשמשות לניתוח SNPs.

ריצוף Pyro מבוסס על ריצוף על ידי סינתזה, תוך ניצול שחרור פירופוספט בכל פעם שנוקלאוטיד משולב בגדיל DNA פתוח בעל שלושה ראשוניים. לאחר טעינת צלחת, נוקלאוטידים משולבים על סמך רצף המסופק על ידי התוכנה לאחר השחרור, הפירופוספט משמש בתגובה המביאה לשחרור TP, המשמש את לוציפראז להמרת לוציפר לאוקסי לוציפר וכתוצאה מכך לפליטת אור. האור המוכנס נאסף על ידי מצלמת CCD ונרשם כפסגות, הידועות גם בשם פירוס.

כל נוקלאוטידים שאינם משולבים בגדיל ה-DNA מתפרקים על ידי AP pyra כדי למנוע רעשי רקע. הליך זה כולל את השלבים הבאים. תכנון בדיקה, אלקטרופורזה של ג'ל PCR לבקרת איכות וריצוף פירו.

אז בואו נתחיל עם ריצוף פירו. על מנת לבצע ריצוף פירו, יש להכין תחילה מוצר PCR. PCR לריצוף פירו דורש יותר מחזורים מרוב ה-PCR על מנת להבטיח שכל הפריימר מנוצל בערך 50 מחזורים.

ריצוף Pyro דורש גם שאחד מהפריימרים של PCR יהיה ביוטיניליזציה. לבסוף, חשוב לציין כי נדרש גם פריימר פנימי. תכנון בדיקה יעיל עשוי להתבצע עם תוכנה המסופקת באמצעות ריצוף פירו כדי להבטיח שאין זיהום.

וכדי לאשר את קיומו של מוצר PCR, יש לשפוך ג'ל על כמה דגימות כמו גם בקרה שלילית. כדי להכין את צלחת ריצוף הפיירו הוסף 12 מיקרוליטר מתערובת פריימר ריצוף הפיירו לצלחת ריצוף הפיירו של 96 בארות. זה דורש תערובת של 43.2 מיקרוליטר של הפריימר הפנימי, יחד עם 1396.8 מיקרוליטר של חיץ כורע מכסים את לוחית רצף הפיירו בסרט דבק.

אם ההתקנה אמורה להימשך יותר מ-50 דקות לכל באר של מוצר ה-PCR של 96 בארות, הוסף 70 מיקרוליטר של תערובת מהירות SRO המכילה 240 מיקרוליטר מהירויות סרו מצופות סטרפטווידין. 4,560 מיקרוליטר של מאגר קשירה, העשוי מטריס נתרן כלורי, EDTA ו-20 ו-3,600 מיקרוליטר מים והחזר את המכסה היטב. מניחים את צלחת המוצר PCR 96 באר עם תערובת החרוזים בשייקר צלחת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

ודא שהמכסה מאובטח כדי למנוע זיהום צולב בין הבארות. שלב זה יאפשר כריעה יסודית של הסטרפטוקוס ENC, חרוזי ספרוס מצופים לתג הביוטין שנמצא על פריימר ה-PCR. הקימו עמדת עבודה להכנת הצלחות.

זה כולל את שקתות הריאגנטים, מוצר ה-PCR ומגש תערובת החרוזים ומגש הפריימר לרצף פירו. ודא שמוצר ה-PCR וצלחת תערובת החרוזים כמו גם מגש הפריימר לרצף ה-pyro מיושרים כהלכה כך שהנגטיבים יהיו באותו כיוון. לפני העברת דגימות, נער את כלי הוואקום, שמכובה במים נקיים כדי לשחרר חרוזים או פסולת שעלולים להיות עליו.

השליכו את המים הנותרים, מלאו מחדש את השוקת והפעילו את הוואקום. השאירו את כלי הוואקום בשוקת עד להסרת כל המים, כלומר כ-30 שניות. הנח את קצות המסנן של כלי הוואקום לתוך הבארות של צלחת תערובת חרוזי ה-PCR והניח לו להישאר עד שכל הנוזלים יוסרו מהצלחת.

ניתן להשתמש בנדנוד עדין כדי למנוע מתח פנים. הנח את הוואקום בשוקת האתנול של 70% כאשר הנוזל מתחיל לזרום דרך הצינור. אפשר לקצות המסנן לשאוב את האתנול למשך חמש שניות.

חזור על הפעולה עבור נתרן הידרוקסיד 0.2 מולארי, אשר מנטרל את ה-DNA ל-PCR חד-גדילי ולמאגר הכביסה. לניקוי ונטרול מוצר ה-PCR. נתק את צינור הוואקום מכלי הוואקום והנח את כלי הוואקום לתוך צלחת ריצוף הפיירו המכילה את פריימר ריצוף הפיירו בתערובת חיץ כריעה.

אם צינור הוואקום עדיין מחובר, כאשר הוא מונח בצלחת ריצוף הפירו, תערובת הפריימר תישאב דרכה. הטיפים הגורמים לך לאבד את מוצר ה-PCR שלך. נער או נדנד בעדינות את קצות הוואקום בבארות של צלחת ריצוף הפיירו כדי לפזר את מוצר ה-PCR שלך.

הסר את כלי הוואקום מלוחית רצף הפיירו לאחר השלמת הטלטול או הנדנדה, וחבר מחדש את כלי הוואקום לצינור והנח את הכלי במים הנקיים כדי לנקות אותו לצלחת הבאה. מניחים את צלחת רצף הפיירו על גוש חום למשך שתי דקות בחום של 80 מעלות צלזיוס. לאחר שתי דקות מוציאים את הצלחת מגוש החום ומניחים על משטח קריר.

לאחר הקירור ניתן להשתמש בסרט דבק לכיסוי הצלחת, אלא אם כן הצלחת תופעל תוך 15 דקות כדי למנוע אידוי. ועכשיו הגיע הזמן להתחיל בריצוף פירו. השלב הראשון של ריצוף pyro הוא הזנת פרטי הבדיקה למחשב.

תחת הזנת סימפלקס, בחר את הערך החדש והזן מידע בדיקה, כולל שם מזהה והרצף לניתוח, המסופק על ידי תוכנת תכנון הבדיקה ומאפשר בקרת איכות בחר סדר חלוקה, המספק את הרצף סביב בסיסי הבקרה של SNP פלוס. לבסוף, בחר היסטוגרמות כדי לספק חזותית של איך ה-pigram שלך אמור להיראות. עכשיו הגיע הזמן להיכנס לריצת חיתוך.

תחת ריצות החיתוך והכרטיסייה כללי, הזן שם הפעלה ובחר פרמטרים של מכשיר עבור הריצה. תחת לשונית ההגדרה, בחר את ערך הבדיקה ולחץ וגרור מעל הצלחת. כדי להזין את מבחן הבחירה לצלחת שלך, חשוב לציין כי אין צורך להשתמש בצלחת כולה בה ניתן להשבית בארות שונות לצורך ניתוח, כמו גם בדיקות רבות ושונות עשויות להיות מופעלות על אותה צלחת.

לחץ על הכרטיסיה תצוגה ולאחר מכן בחר. רץ. דף זה מפרט את הנפחים המתאימים של נוקלאוטידים, אנזים ומצע הדרושים לריצה. נקה גם את הנוקלאוטיד או את קצות הנימים והמגיב לפני השימוש.

מלאו את הקצוות במים והפעילו לחץ על החלק העליון של הקצה כדי לבדוק אם יש חסימות בקצוות. אם מים לא משפריצים מתחתית הקצה, רוקנו ומלאו מחדש מספר פעמים כדי לנסות לעבור בכוח את המים. או שאתה יכול לסוניקציה של הטיפים אם הקצה נשאר חסום.

השליכו וקבלו טיפים חדשים. יש להשעות את האנזים והמצע במים לפני השימוש. אם בועות אוויר מטלטלות עלולות לגרום לחסימות בקצה או לחלוקה לא עקבית, ניתן לאחסן אנזים ומצע מושעים שאינם בשימוש במינוס 20 מעלות צלזיוס.

לשימוש עתידי עבור קצות חלוקה נימיים בצינור מיקרו פוגה, בצע דילול אחד לאחד עם הנוקלאוטידים ו-te buffer P שמונה. יש לערבב היטב לפני השימוש. מלאו את קצות הנוקלאוטידים והריאגנטים בנפחים המתאימים בהתאם לכמויות המוצעות על ידי התוכנה.

הוצא בעדינות נוזל בצידי הקצוות כדי למנוע פיפטינג בועות אוויר לתוכם וגרימת סתימות. הקפד לבדוק אם יש בועות אוויר בקצות חלוקת הנוקליאוטידים. אם קיימות בועות אוויר, פשוט הקש על צידי הקצוות עד שהאוויר מבעבע על פני השטח או עקור אותם בעזרת קצה פיפטה נקי.

הפעל לוחית בדיקה לאחר מילוי המחסנית. הנח את המחסנית במכשיר ריצוף הפיירו ואת לוחית הבדיקה בפלטפורמת צלחת 96 הבאר. הנחת סרט דבק מעל הצלחת מאפשרת לראות בקלות את חלוקת המגיב והנוקלאוטיד.

בחר/י את כרטיסיית כלי הנגינה בצד ימין של המסך ולחץ/י על ״נהל״. בחר את המכשיר מהתפריט הנפתח. לחץ על test, ותופיע אזהרה.

מבקש ממך לבדוק שלוחית הבדיקה הונחה במכשיר. לחץ על אישור. לאחר השלמתו, הסר את לוחית הבדיקה ובאמצע הצלחת צריכות להיות נקודות נוזליות מעל שש הבארות המייצגות ארבעה נוקלאוטידים, אנזים ומצע.

אם יש פחות משש נקודות קטנות, התרחשה סתימה ויש לבדוק את הטיפים ולהסיר את כל החסימות. הנח את הצלחת בפלטפורמת צלחת רצף ה-pyro 96 באר. סגור את כל המנופים ולחץ על הפעל על הצלחת האישית.

הפעל את הגדר את מצע האנזים והנוקלאוטידים יתפזרו בסדר שנקבע מראש. לאחר שהריצה נותחה על ידי רצף הפירו, הגיע הזמן לבחון את הריצה. בארות כחולות מייצגות גנוטיפ ופירו חולפים.

בארות כתומות דורשות התערבות אנושית וניתן לערוך אותן על ידי לחיצה על באר העניין ופתיחת ההיסטוגרמה החזויה. גנוטיפ עשוי לעבור, להיכשל או להיבדק, כמו גם לשנות את הגנוטיפ עצמו בהתאם. לאחר עריכת באר, עיגול כהה יופיע על מפת הצלחת.

בקרות שליליות צריכות לקבל ציון שלילי. ייתכנו שיאים לא ספציפיים בבארות השליליות, עם זאת, זה נגרם בדרך כלל על ידי לולאה של הפריימר הפנימי. אז זה עתה הראינו לכם כיצד לרצף פולימורפיזם בגנום אנושי.

ריצוף DNA Pyro שימושי על פני הליכי ריצוף אחרים מכיוון שהוא ניתן להתאמה למגוון רחב של יישומים. הוא גם חזק מספיק כדי לטפל ב-DNA מכל מקור, כולל ריכוז נמוך ו-DNA מפורק. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להתחיל עם מוצר PCR נקי וטוב.

כלול בקרה שלילית לכל בדיקה וודא שכל הריאגנטים שלך טובים. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.