Name: הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: למדו את פרוטוקול מבחן טביעת ההידבקות לחקירת אירועי הידבקות מולקולרית בתאים מתגלגלים. השיטה מאפשרת מיפוי מרחבי וכימות כוחות הידבקות ברמת המולקולה הבודדת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן קנדה לחדשנות (CFI 35492), המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה של קנדה דיסקברי גרנט (RGPIN-2017-04407), גבולות חדשים בקרן המחקר (NFRFE-2018-00969), קרן מייקל סמית לחקר הבריאות (SCH-2020-0559) וקרן אמיליה הבריטית.

<ol><li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li>
<li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li>
<li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2FOncology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li>
<li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li>
<li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade%3A+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li>
<li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling%2Fadhesion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li>
<li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li>
<li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006(2014).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li>
<li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502(2017).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li>
<li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prepare+reproducible%2C+homogeneous%2C+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li>
<li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%3A+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li>
<li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li>
<li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507(2019).</li>
<li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A%3A+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li>
<li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+tension-classifications%2C+interpretations+and+limitations+of+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001(2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

טביעת הרגל של הידבקות מאפשרת הדמיה של אירועי הידבקות מולקולרית בין PSGL-1 ו- P-selectin במהלך הידבקות מתגלגלת תאים. תהליך זה מופעל על ידי לכידה בתיווך P-selectin ואחריו מתגלגל תחת לחץ גיזום נוזלי. בעיות פוטנציאליות במהלך הניסוי כרוכות בדרך כלל גלגול תאים עניים או חסר מסלולי פלורסנט גם כאשר תאים מתגלגלים היטב. בעיות אלה נובעות לעתים קרובות מבקרי איכות בשלבים הקריטיים בפרוטוקול, כמפורט בטבלה לפתרון בעיות (טבלה 1). 
ביומולקולס ומאגרים נדרשים להיות מסוננים ומאוחסנים ב 4 °C (4 °F) ...

מפל ההדבקה המתגלגל מתאר כיצד תאים במחזור לקשור ולהתגלגל לאורך קיר כלי הדם1. גלגול פסיבי הוא בעיקר בתיווך selectins, מחלקה עיקרית של מולקולות הידבקות הסלולר (CAMs)1. תחת זרם הגיזה של דם, לויקוציטים המבטאים P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1) יוצרים קשרים ארעיים מאוד עם P-selectin, אשר עשוי לבוא לידי ביטוי על פני השטח של תאי אנדותל מודלקים. תהליך זה הוא קריטי עבור לויקוציטים לעבור לאתר של דלקת2. בנוסף, PSGL-1 הוא גם קולטן mechanosensitive מסוגל להפעיל את שלב הידבקות המשרד הבאים של מפל הידבקות מתגלגל על מעורבותו עם P-selectin3.
מוטציות גנטיות המשפיעות על תפקוד CAM יכולות להשפיע קשות על המערכת החיסונית, כגון במחלה הנדירה של מחסור בהידבקות לויקוציטים (LAD), שבה תקלה במולקולות הידבקות המתווכות בגלגול מובילה לאנשים אימונו-מוגעים קשות4,5,6. בנוסף, תאים סרטניים במחזור הוכחו לנדוד בעקבות תהליך גלגול דומה, המוביל גרורות7,8. עם זאת, מכיוון שגלגול תאים הוא מהיר ודינמי, שיטות מכניות ניסיוניות קונבנציונליות אינן מתאימות לחקר אינטראקציות מולקולריות במהלך גלגול תאים. בעוד ששיטות מניפולציה של תאים יחידים ומולקולה אחת כמו מיקרוסקופיה של כוח אטומי ופינצטה אופטית הצליחו לחקור אינטראקציות מולקולריות כגון האינטראקציה התלויה בכוח של P-selectin עם PSGL-1 ברמת המולקולה הבודדת9, הן אינן מתאימות לחקירת אירועי הידבקות חיה במהלך גלגול תאים. בנוסף, האינטראקציה המאופיינת במבחנה אינה יכולה לענות ישירות על השאלה על הידבקות מולקולרית ב- vivo. לדוגמה, איזה טווח מתח מולקולרי רלוונטי מבחינה ביולוגית כאשר תאים מתפקדים בסביבתם הטבעית? שיטות חישוביות כגון סימולציית דינמיקה דבק10 או מודל מצב יציב פשוט11 לכדו פרטים מולקולריים מסוימים וכיצד הם משפיעים על ההתנהגות המתגלגלת אך תלויים מאוד בדיוק הפרמטרים וההנחות של המודל. טכניקות אחרות כגון מיקרוסקופיה כוח המתיחה יכול לזהות כוחות במהלך נדידת תאים אבל לא מספקים רזולוציה מרחבית מספקת או מידע כמותי על מתח מולקולרי. אף אחת מהטכניקות הללו אינה יכולה לספק תצפיות ניסיוניות ישירות של הדינמיקה הזמנית, ההטרוגניות המרחבית וההטרוגניות בעוצמה של כוחות מולקולריים, המתייחסים ישירות לתפקוד התא ולהתנהגות בסביבתם הטבעית.
לכן, יישום חיישן כוח מולקולרי המסוגל למדוד במדויק אינטראקציות בתיווך סלקטיבי חיוני לשיפור הבנתנו של הידבקות מתגלגלת. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור טביעת הרגל הידבקות assay12 שבו חרוזים מצופים PSGL-1 מגולגלים על משטח המציג p-selectin פונקציונלי מד צמיגים (TGTs)13. TGTs אלה הם חיישני כוח מבוססי DNA בלתי הפיכים שגורמים להיסטוריה קבועה של אירועי קרע בצורה של קריאת פלואורסצנטיות. זה מושג באמצעות הקרע של TGT (dsDNA) ולאחר מכן תיוג לאחר מכן של TGT קרוע (ssDNA) עם גדיל משלימה תווית פלואורסצנטית. אחד היתרונות העיקריים של מערכת זו הוא התאימות שלה הן להדמיה מוגבלת עקיפה והן עם רזולוציית-על. הגדיל המשלים המסומן באופן פלואורסצנטי יכול להיות מאוגד לצמיתות (>12 bp) להדמיה מוגבלת עקיפה או כבול באופן חולף (7-9 bp) להדמיה ברזולוציית-על באמצעות DNA PAINT. זוהי מערכת אידיאלית לחקור הידבקות מתגלגלת כמו TGTs נקרעים במהלך גלגול פעיל, אבל קריאת פלואורסצנטיות מנותח לאחר גלגול. שתי שיטות ההדמיה מספקות גם למשתמש יותר חופש לחקור הידבקות מתגלגלת. בדרך כלל, הדמיה מוגבלת עקיפה שימושית לחילוץ כוח קרע מולקולרי באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות13, ואילו הדמיה ברזולוציית-על מאפשרת ניתוח כמותי של צפיפות הקולטן. עם היכולת לחקור תכונות אלה של הידבקות מתגלגלת, גישה זו מספקת פלטפורמה מבטיחה להבנת מנגנון ויסות הכוח על הידבקות מולקולרית של תאים מתגלגלים תחת זרימת גיסת.

<table><tbody><tr><td>מדריך מקדחה 4 ערוצים</td> מודפס בתלת מימד <td>בהתאמה אישית</td><td></td><td>עם שקופית נימה ABS</td></tr><tr><td>4 חורים</td><td>בהתאמה</td><td></td> אישית <td>מקדח שקופית מיקרוסקופ נקייה באמצעות דרמל עם מקדחים מצופים יהלום על מוביל מקדחה בעל 4 ערוצים בעל פריסה התואמת את מרכזי 8-32 חורי הברגה על מהדק האלומיניום.</td></tr><tr><td>אצטון</td><td>VWR</td><td>BDH1101-4LP</td><td></td></tr><tr><td>מרווח אקרילי</td><td>בהתאמה</td><td></td> אישית <td>חותכים שני בלוקים של יריעות אקריליות במידות של 40 מ"מ x 30 מ"מ x 2.5 מ"מ. בכל בלוק, קדחו שני חורים בקוטר 3 מ"מ המיושרים במדויק עם 4-40 החורים במחזיק האלומיניום.</td></tr><tr><td>מחזיק שבבי אלומיניום</td><td>בהתאמה</td><td></td> אישית <td>בלוק אלומיניום אנודייז במכונה למחזיק בצורת C עם הממד החיצוני של 640 מ"מ x 500 מ"מ x 65 מ"מ וממד הפתיחה של 400 מ"מ x 380 מ"מ x 65 מ"מ. הכניסות והיציאות מקישות עם חוט 8-32.</td></tr><tr><td>Aminosilane</td><td>AlfaAesar</td><td>L14043</td><td>CAS 1760-24-3</td></tr><tr><td>תמיסה אנטיביוטית/אנטי-פטרייתית</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SV3007901</td><td>עט/סטרפטוקוקוק/פטריות</td></tr><tr><td>חרוזים, פוליסטירן מצופה ProtG</td><td>Spherotech</td><td>PGP-60-5</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Buffer, DNA PAINT</td><td></td><td></td><td>0.05% Tween-20, 5 מ"מ Tris, 75 מ"מ MgCl2, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Buffer, T50M5</td><td></td><td></td><td>10mM Tris, 50 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer, מתגלגל</td><td></td><td></td><td>HBSS עם 2 מ"מ CaCl2, 2 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ Hepes, 0.1% מאגר BSA</td></tr><tr><td>, שטיפה</td><td></td><td></td><td>10 מ"מ Tris, 50 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl2 ו-2 מ"מ CaCl2, 0.05% Tween 20</td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>VWR</td><td>BDH9224</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים</td><td>VWR</td><td>10062-868</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית מרוכזת</td><td>VWR</td><td>BDH3072-2.5LG</td><td>95-98%</td></tr><tr><td>Coverslip מחזיק פינצטה</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW150</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה מצופה יהלום ביטים</td><td>טכנולוגיית שוחקים</td><td>C5250510</td><td>0.75 מ"מ מקדח יהלום</td></tr><tr><td>DNA, אמין-ssDNA (גדיל עליון)</td> <td>IDT DNA</td><td>מותאם אישית oligo</td><td>CCGGGCGACGCAGGGGGG / 3AmMO /</td></tr> <tr><td>DNA, ביוטין-ssDNA (גדיל תחתון)</td> <td>IDT DNA</td><td>מותאם אישית oligo</td> <td>/ 5BiotinTEG / TTTTT CCCTCCTGCGTCCCCGG</td></tr><tr><td>DNA, גדיל הדמיה עבור DNA-PAINT</td><td>IDT DNA</td><td>מותאם אישית oligo</td><td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>DNA, גדיל הדמיה לתיוג קבוע</td><td>IDT DNA</td><td>מותאם אישית oligo</td><td>CCGGGCGACGCAGG / 3Cy3Sp /</td></tr> <tr><td>סרט דו צדדי</td><td>סקוטש</td><td>237</td><td>3/4 אינץ 'רוחב, סרט דו צדדי קבוע</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>15575020</td><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>אפוקסי</td><td>גורילה</td><td>42001</td><td>זמן ריפוי 5 דקות</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Avantor</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>GelGreen</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>VWR</td><td>BDH3094-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית, כיסויים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית, שקופית מיקרוסקופ</td><td>VWR</td><td>48300-026</td><td>75 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ</td></tr><tr><td>זכוכית, צנצנת מכתים</td><td>VWR</td><td>74830-150</td><td>צנצנת צביעה וויטון (900620)</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)</td><td>Lonza</td><td>04-315Q</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HL-60 תאים</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>תמיכת שקופיות בתא לחות מודפס</td><td>בתלת מימד בהתאמה אישית</td><td></td><td>עם נימה ABS</td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>VWR</td><td>BDH7690-1</td><td>30%</td></tr> <tr><td>אימידזול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>כניסות/יציאות</td><td>מקדחה בהתאמה</td><td></td> אישית <td>דרך שמונה ברגים סטים של 8-32 באמצעות מקדחי קובלט. תוספת 1.5 ס"מ&nbsp; צינורות פוליאתילן (טיגון, תעודת זהות 1/32 אינץ' OD 3/32 אינץ') לתוך כל בורג חלול</td></tr><tr><td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td> <td>Lonza</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>VWR</td><td>BDH9244</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי Ni-NTA מגנטיים</td><td>Invitrogen</td><td>10103D</td><td></td></tr><tr><td>צינורות דואר</td><td>EMS</td><td>EMS71406-10</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו ביו-ספין P-6 עמודות ג'ל</td><td>Biorad</td><td>7326200</td><td>במאגר SSC</td></tr><tr><td>PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>PEG-ביוטין</td><td>Laysan ביו</td><td>ביוטין-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>VWR</td><td>470302-132</td><td></td></tr><tr><td>חלבון, חלבון G</td><td>Abcam</td><td>ab155724</td><td>N-terminal His-Tag ו-C-terminal </td></tr><tr><td>חלבון ציסטאין, P-selectin-Fc</td><td>R& D System</td><td>137-PS</td><td>רקומביננטי חלבון כימרה אנושי P-Selectin/CD62P Fc,</td></tr><tr><td>חלבון CF, סטרפטווידין</td><td>ארז</td><td>CL1005-01-5MG</td><td></td></tr><tr><td>מזרק משאבה</td><td>מכשיר הרווארד 704801</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחלקת נתרן ביקרבונט</td> '<td> s Science</td><td>470302-444</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>VWR</td><td>97061-274</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Thermofisher</td><td>22322</td><td></td></tr><tr><td>מזרק</td><td>המילטון</td><td>81520</td><td>מזרקים עם נעילת PTFE, 5 מ"ל</td></tr><tr><td>מחטי מזרק</td><td>BD</td><td>305115</td><td>Precision Glide 26 גרם, אורך 5/8 אינץ'</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>BDH4502-500GP</td><td></td></tr><tr><td>צינורות, מתאם</td><td>Tygon</td><td>ABW00001</td><td>ניסוח 3350, תעודת זהות 1/32 אינץ'; OD 3/32 אינץ'</td></tr><tr><td>צינורות, פוליאתילן</td><td>BD תוך-רפואי</td><td>427406</td><td>תוך-רפואי (PE20) 0.38 מ"מ; OD 1.09 מ"מ</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93773</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

הידבקות מתגלגלת, הקלה על ידי אינטראקציות בתיווך סלקטיבי, היא תנועתיות דינמית מאוד, פסיבית בגיוס לויקוציטים לאתר של דלקת. תופעה זו מתרחשת venules postcapillary, שבו זרימת הדם דוחפת לויקוציטים בתנועה מתגלגלת על תאי האנדותל. גלגול יציב דורש איזון עדין בין היווצרות קשר הידבקות לבין הניתוק המכני שלהם, ומאפשר לתא להישאר מחובר לפני השטח תוך כדי גלגול לכיוון הזרימה. שלא כמו תהליכי הידבקות אחרים המתרחשים בסביבות סטטיות יחסית, הידבקות מתגלגלת היא דינמית מאוד כאשר התאים המתגלגלים נעים על פני אלפי מיקרון בעשרות מיקרון לשנייה. כתוצאה מכך, שיטות מכניות קונבנציונליות כגון מיקרוסקופיה כוח המתיחה אינם מתאימים למדידת אירועי הידבקות בודדים ואת הכוחות המולקולריים הקשורים בשל ציר הזמן הקצר ורגישות גבוהה הנדרשים. כאן, אנו מתארים את היישום האחרון שלנו של טביעת הרגל הידבקות assay כדי לדמיין את P-selectin: אינטראקציות PSGL-1 בהידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית. שיטה זו משתמשת רצועות מד מתח מבוססות DNA בלתי הפיכות כדי לייצר היסטוריה קבועה של אירועי הידבקות מולקולרית בצורה של מסלולי פלואורסצנטיות. ניתן לדמיין מסלולים אלה בשתי דרכים: (1) תפירת אלפי תמונות מוגבלות עקיפה כדי לייצר שדה ראייה גדול, המאפשרת הפקת טביעת רגל של הידבקות של כל תא מתגלגל לאורך אלפי מיקרון, (2) ביצוע DNA-PAINT כדי לשחזר תמונות ברזולוציית-על של מסלולי הפלואורסצנטיות בתוך שדה ראייה קטן. במחקר זה, נעשה שימוש ב-90% מטביעת הרגל של הידבקות כדי לחקור תאי HL-60 המתגלגלים בלחצי גיסה שונים. בעשותנו כן, הצלחנו לדמיין את ההתפלגות המרחבית של P-selectin: אינטראקציית PSGL-1 ולקבל תובנה על הכוחות המולקולריים שלהם באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות. לפיכך, שיטה זו מספקת את היסודות לחקירה כמותית של אינטראקציות פני התא השונות המעורבות בהידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית.

הפרוטוקול לעיל מתאר את ההליך הניסיוני של תוחם טביעת הרגל של הידבקות. זרימת העבודה של הניסוי הכללי מודגמת באיור 1, החל מהרכבת תא הזרימה (איור 1A) וכלה בפונקציונליזציה של פני השטח (איור 1B) ושלבי הניסוי וההדמיה (איור 1C).
איור 2 הוא תוצאה מייצגת לאפיון הביו-שיתוף הביולוגי ProtG-ssDNA. הספקטרום UV/Vis של שלושה רכיבים במוצר הסופי, כלומר, ProtG, mal-s...

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

פרוטוקול זה מסייע לבסס את הקשר בין כוח מולקולרי להתנהגות גלגול תאים מלבד מתן אפשרות למפות ולכומת הידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית. טכניקה זו מאפשרת לחקור אירועי הידבקות בודדים במהלך גלגול התא בפועל ומאפשרת לנו למדוד את כוח ההידבקות המולקולרית הרלוונטי הפיזיולוגי ישירות. הכנת פני השטח באמצעות זמן הריכוז והדגירה המתאימים בכל שלב חיונית להשגת פונקציונליזציה משטחית באיכות גבוהה.איכות הביו-תנאים והתנאים המתאימים הם גם חיוניים. הדגמה חזותית היא קריטית כדי לעזור לחוקרים לשכפל פרוטוקול זה. בפרט, השלבים כגון הרכבה תא זרימה ותמונות לאחר עיבוד ייהנו מאוד מהדגמה חזותית.התחל על ידי פיזור דק של כמות קטנה של אפוקסי משני צידי הסרט הדו-צדדי עם סכין גילוח. בעזרת לייזר, חותכים את הסרט מצופה אפוקסי כדי ליצור ארבעה ערוצים. צור את שבב הזרימה על ידי כריכת סרט אפוקסי בין שקופית של ארבעה חורים וכיסוי PEG.באמצעות קצה פיפטה, להפעיל לחץ עדין לאורך הערוצים כדי ליצור חותם טוב, ולאחר מכן לרפא את אפוקסי במשך מינימום של שעה אחת. ישר את השבב כך שפתיחת כל ערוץ תתמקם במרכזי המתאם. לאחר מכן הנח שני מרווחי אקריל שקופים על גבי השבב.יש להפעיל לחץ מוצק באמצע הבלוק ולבורג בקצו של כל מרווח. בורג את הכניסות לתוך החורים השחלה בצד השני של הסוגר לפקח על מצב האיטום דרך בלוק אקריליק שקוף. להזרים 200 microliters של חוצץ לשטוף לתוך התא כדי לבדוק דליפה.אם נוצרות בועות בערוץ, דחוף באגרסיביות 200 מיקרוליטרים נוספים של חוצץ כביסה כדי להסיר את הבועות. הוסף 40 מיקרוליטרים של BSA לתא הזרימה כדי למנוע כריכה לא-מינית ודגרה במשך 10 דקות בתא הלחות. לאחר הדגירה, מוסיפים 40 מיקרוליטרים ב- Tween 20 לתא הזרימה ושוב מדגירים במשך 10 דקות כדי להפחית עוד יותר את הכריכה הלא-מדעית.ואז לשטוף את הערוץ עם 200 microliters של חוצץ לשטוף כדי להסיר את כל סוכני passivation. לפונקציונליזציה של פני השטח התאיים, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של סטרפטאבידין לתא הזרימה ודגרו במשך 20 דקות, ואז שטפו את התא עם 200 מיקרוליטרים של חוצץ כביסה. עכשיו, להוסיף 40 microliters של חלבון היברידי G-TGT לתא הזרימה ודגרה במשך 20 דקות.לאחר הכביסה עם חוצץ כביסה, להוסיף 40 microliters של חלבון G-TGT העליון גדיל ודגורה במשך 20 דקות כדי להשלים כל גדיל תחתון TGT לא מרוסן על פני השטח ולאחר מכן לשטוף עם חוצץ לשטוף. לבסוף, להוסיף 40 microliters של P-selectin-Fc לתא הזרימה ודגור במשך 60 דקות לפני כביסה עם חוצץ לשטוף. מלא מזרק זכוכית חמישה מיליליטר עם חוצץ מתגלגל והקש על הצדדים של המזרק כדי להתנתק ולדחוף את הבועות החוצה כפי שהם צפים לכיוון הקצה.לאחר החדרת מחט סטרילית לתוך חתיכת 200 מ"מ של צינורות פוליאתילן, לחבר את המחט למזרק הזכוכית. תקן את המזרק על משאבת המזרק והטה את משאבת המזרק כך שצד הבוכנה מוגבה כדי למנוע מבועות אוויר להיכנס לערוץ. הכנס את קצה הצינור לתוך הכניסה של תא הזרימה.הכנס קצה אחד של עוד 200 מילימטר של צינורות פוליאתילן לתוך השקע ולהטביע את הקצה השני פסולת. קח אחד עד שני מיליליטר של דגימת השעיית התא וצנטריפוגה כדי כדורי התאים. הסר את המדיום בעדינות resuspend התאים ב 500 microliters של המאגר המתגלגל.בזהירות לנתק את הצינורות מן הכניסות ואת השקע ואת pipette 40 microliters של התלוי התא לתוך תא הזרימה. התחבר מחדש את הצינורות כמתואר בעבר והבטיח בועות לא הוכנסו לתוך ערוץ הזרימה. התחל ניסוי גלגול תאים על ידי הפעלת משאבת המזרק בקצבי הזרימה הרצויים.צפה בגלגול תאים באמצעות מיקרוסקופ שדה כהה עם מטרה פי 10. לאחר השלמת הניסוי, הסר את התאים מהערוץ על ידי הטתת המאגר המתגלגל במהירות של 100 מיליליטר לשעה עד שהמשטח יהיה פנוי. להדמיית המסלולים המקומיים על ידי DNA-PAINT, הוסף 40 מיקרוליטרים של גדיל צלם DNA-PAINT שהוכן במאגר DNA-PAINT לערוץ.בצע מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות פנימית כוללת באמצעות התנאים המוזכרים בכתב היד של הטקסט. הפוך את התמונות ברזולוציית-על ועבד את התמונות ברזולוציית-על. להדמיית הרצועות הארוכות על-ידי תיוג קבוע, הוסיפו את גדיל הדמייה הקבוע ודגרו למשך 120 שניות במאגר T50M5.ואז לשטוף את הערוץ על ידי החדירה 200 microliters של חוצץ לשטוף. הקלט תמונה עם לייזר העירור כבוי כדי להשיג רעש מצלמת רקע. תמונה של שטח גדול בתבנית רשת על-ידי מיקרוסקופיית TIRF.תכנת את המיקרוסקופ כדי לסרוק את השטח של 400 על 50 תמונות ולפצל את הנתונים הגולמיים לקבצי TIP בודדים שכל אחד מהם מכיל מקסימום של 10,000 תמונות באמצעות תוכנית ImageJ. שיטחו את כל התמונות באמצעות פרופיל התאורה והשתמשו בתוסף MIST כדי לתפור את התמונות. התוצאה של חלבון G ssDNA bioconjugation אפיון הראה כמעט אחד הוא יחס אחד של חלבון G ל ssDNA שבו חלבון G Maleimide ssDNA ו imidazole elution חוצץ ספקטרום מן הבסיס האורתוגונלית להתאמה לספקטרום המוצר bioconjugation.Native PAGE שימש לאישור ההסתייגות הביולוגית המציגה את הרצועות הירוקות הבהירות חופפות לרצועת החלבון המונומרית G המצביעה על הטיות מוצלחות ותשואה טובה. פרופיל התאורה של TIRF המוצג מסיבי מצב יחיד בהיר בדרך כלל יותר באמצע שדה הראייה ומעמעם סביב הקצוות. כדי לפצות על התאורה הלא אחידה ולשטח את התמונות לניתוח כמותי, פרופיל התאורה נקבע על ידי ממוצע של אלפי מסגרות בודדות.תמונות שטוחות הופקו על ידי חיסור רעש המצלמה הן מפרופילים גולמיים והן מפרופילי תאורה ולאחר מכן נרמול על ידי פרופיל התאורה. תפירה גולמית הראתה דפוסים תקופתיים ברורים המתאימים לתמונות שלא תיקון, בעוד שאותו שדה ראייה שתופר מתמונות שטוחות יצר רקע שטוח. פרופיל זרימה שיפוע שימש כדי לקבוע את הטווח של מתח הגיאה וכתוצאה מכך תאים מתגלגלים ולהניב מסלולי פלואורסצנטיות שתחתיו ניתן לראות טביעת רגל טיפוסית של הידבקות של תא יחיד.תוצאות תת-אופטימליות ואופטימליות של מסלולי פלורסנט עם ניגודיות מספקת, צפיפות מסלול מופרזת, צפיפות מסלול וניגודיות אופטימליות, והדמיה מוגבלת של DNA-PAINT מוצגים. זמן הדגירה של יותר מ -60 דקות להבטיח פונקציונליזציה פני השטח ובנייה קאמרית נכונה מונעת מעבר של בועות שפוגעות פני השטח פונקציונלי. הליך זה חל על ניתוח כמותי של כוח מולקולרי המעורב בהידבקות מתגלגלת ומאפשר לחוקרים להבין את ההתנהגות המתגלגלת של סוגי התאים השונים.טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור שאלות חדשות לגבי אירועי הידבקות מהירה המובילים לקידום נוסף של מולקולה בודדת ומחקר מכנוביולוגיה.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים פרוטוקול להתבונן ולנתח מסלולי מתגלגל תאים על מצעים בדוגמת אסימטרית הקולטן. את הנתונים המתקבלים שימושיים ההנדסה של הקולטן בדוגמת מצעים להפרדה-תווית חינם התא ניתוח.

מסלולי לימוד Cell רולינג על דפוסי קולטן אסימטרית

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

מחקר זה השתמש במערכת microfluidic צלחת רב גם, להגדיל באופן משמעותי את התפוקה של מחקרים מתגלגלים תא תחת זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. לאור החשיבות של מתגלגל תא בתא רב שלבי ביות מפל ואת החשיבות של ביות התא הבאה משלוח מערכתי של אוכלוסיות אקסוגניים של תאים בחולים, מערכת זו מציעה פוטנציאל כפלטפורמת הקרנה כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים.

ניתוח שיטתי של במבחנה תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

assay הידבקות סטטית הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש מודל האינטראקציות בין לימפוציטים מסוג T וסוגי תאים אחרים. אינטראקציות מופקות על ידי הזרקת תאי T שכותרתו לתוך הבארות מצופים במולקולות הדבקות, ואילו קורא צלחת משמש לכמת את מספר התאים חסיד הבאים שוטף סדרתי.

סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים

קשיחות מכאנית במייקרו-הסביבה של הגידול ממלא תפקיד מכריע בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת פעילות invadopodia וactomyosin התכווצות. ג'לים באמצעות polyacrylamide (PaaS), יכולים להיות מנוצלים מבחני invadopodia וכוח המתיחה ללמוד את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן בתגובה למטריצת קשיחות.

ג&#39;לים polyacrylamide לInvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן

assay הידבקות זרימה זו מספק מודל השפעה פשוט, גבוה של אינטראקציות תא אפיתל T. משאבת מזרק משמש להפקת מאמץ הגזירה, וכן במיקרוסקופ confocal לוכדת תמונות כימות. מטרת המחקרים אלה היא לכמת הידבקות תא T ביעילות באמצעות תנאי זרימה.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

הדמיה של קרום פלזמה מבודדים הן, אמצעי האחסון תאיים שמסביב, המיקרוסקופ המשוכלל כי היתר ברזולוציה גבוהה ומהירה יוצגו. השילוב של ספינינג דיסק וסיכום השתקפות פנימית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בהגדרת אחד מאפשר ניסויים הדמיה חיה במחירים רכישה גבוהה עד 3.5 לשנייה בכל אוסף תמונות.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

המאמר מתאר את הכמת של 1) את גודל ומספר של הידעיות מיקוד ו 2) אינדקס צורת תא ואת ההתפלגות שלה מתוך תמונות קונפוקלית וקד של המונאולאיירס הקונאולית של תאים MCF7.

קוונפיקציה של אזור הדבקה בתשתית התא והפצות צורות התא ב-MCF7 Cell Monolayers

למדו את פרוטוקול מבחן טביעת ההידבקות לחקירת אירועי הידבקות מולקולרית בתאים מתגלגלים. השיטה מאפשרת מיפוי מרחבי וכימות כוחות הידבקות ברמת המולקולה הבודדת.

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

גלה סרטונים נוספים