איתור חלבוני וירוס ורוק של וקטור עלה בצמח המארח

פרוטוקול זה מספק טכניקה לזיהוי חלבוני הרוק של עלעלים ופונדקאים צמחיים כדי להמשיך לחקור את תפקודם של חלבונים אלה בפונדקאים של הצמח. טכניקה זו קלה לביצוע והמערכת יציבה וניתנת לשכפול. שיטה זו יכולה גם להיות מועילה בזיהוי חלבוני רוק של המיפטרות אחרות ופונדקאים צמחיים.

כדי להתחיל, מגדלים את העלעלים הבוגרים על שתילי אורז בכלוב קוביות בגודל 40 על 35 על 20 סנטימטרים. יש לכסות צד אחד של הכלוב ברשת חסינת חרקים לצורך אוורור. הניחו את הכלובים עם העלעלים באינקובטור המכיל בקר לחות מובנה בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס עם לחות יחסית של 60 עד 75% בתקופת צילום של 16 שעות אור ושמונה שעות חושך.

פעם בשבוע, השתמשו בשאיפה כדי להעביר בעדינות את כל המבוגרים מהכלוב שלהם לכלוב חדש המכיל שתילי אורז טריים. אפשרו ליותר מ-200 מבוגרים להזדווג ולהטיל ביצים באורז. שמרו את שתילי האורז הישנים כדי שהנימפות ייצאו ויגדילו את הנימפות הלא-ארסיות החדשות האלה לשלב האינסטאר השני.

בעזרת השואב, מעבירים בזהירות את הנימפות הלא אלימות האינסטאריות השניות לצינור תרבית זכוכית למשך שעה עד שעתיים לרעב. לאחר מכן שחררו את הנימפות לכלוב המכיל צמח אורז נגוע בנגיף ננסי אורז שגדל בעציץ ואפשרו לנימפות להיזון מצמח האורז הנגוע במשך יומיים. לאחר יומיים, העבירו בזהירות את הנימפות הללו לכלוב חדש המכיל שתילי אורז טריים ללא וירוסים, ואפשרו לנימפות להיזון משתילי האורז נטולי הנגיף במשך 12 יום כדי להשלים את תקופת העברת הדם של נגיף ננסי האורז.

כדי לאסוף את חלבוני הרוק, הכינו חמישה כלובי האכלה קטנים דמויי צינור המכוסים ברשתות חסינות חרקים בקצה אחד. לאחר כליאת 15 עד 20 עלעלים בכל כלוב האכלה, כסו את הקצה השני של הכלוב בשטיחון קצף דק. קבעו שתיל אורז אחד בין קצה הכלוב למחצלת קצף בעזרת סרטי הדבקה, וודאו שהעלעלים בכלוב ההאכלה יוכלו להיזון משתילי האורז החשופים לחלק הפנימי של הכלוב.

טובלים את שורשי השתיל במים כדי שצמח האורז יישאר בחיים, ומאפשרים לעלעלים להיזון מהם במשך יומיים. לאחר יומיים, הוציאו את העלעלים מכלובי ההאכלה שלהם ואספו את שתילי האורז שעליהם ניזונו העלים. חותכים את השתילים מחוץ לכלוב ומשחזרים את אזורי ההאכלה של השתילים.

הכינו חיץ טריס-גליצין 1x על ידי דילול 200 מיליליטר של חיץ 5x מוכן עם 800 מיליליטר מים סטריליים. לאחר מכן הכינו מאגר של 10x TBS ובצעו אוטוקלאבינג של התמיסה בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, הכינו את מאגר דגימת החלבון 4x.

לאחר מכן להכין את מאגר ההעברה על ידי ערבוב 800 מיליליטר של חיץ Tris-גליצין עם 200 מיליליטר של מתנול. לבסוף, הכינו את פתרון TBST על ידי הוספת 100 מיליליטר של 10x TBS ושלושה מיליליטר של Tween 20 עד 900 מיליליטר של מים סטריליים. כדי לזהות את חלבוני הרוק והנגיפים, לטחון 0.1 גרם של דגימות האורז עם חנקן נוזלי עד הרקמה הופכת אבקה.

לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטר של מאגר דגימת חלבון 4x לדגימה ומרתיחים במשך 10 דקות. צנטריפוגו את הדגימות והעבירו את הסופרנאטנט לבקבוקון חדש. טען 10 מיקרוליטר של הדגימה על ג'ל SDS-PAGE והפעל אותה במאגר Tris-Glycine במתח של 150 וולט למשך 45 עד 60 דקות.

בזמן שהג'ל פועל, הניחו קרום ניטרוצלולוז 0.45 מיקרון וציוד סנדוויץ' אחר במאגר ההעברה למשך 30 דקות. לאחר הריצה, סנדוויץ' את הג'ל ולהעביר אותו במשך 90 עד 120 דקות ב 100 וולט במאגר ההעברה. לאחר השלמת הניקוי, הניחו את הממברנה בתמיסת חסימת חלב יבש ללא שומן 7% ב-TBST ודגרו במשך 20 דקות.

לאחר מכן, להוסיף נוגדן נגד וירוס ננס האורז P8 או vitellogenin לדגור על הממברנה במשך שעתיים או לילה. לאחר הדגירה, שטפו את הממברנה עם TBST שלוש פעמים עם דגירה של חמש דקות בין כל שטיפה. לאחר מכן להוסיף עז נגד ארנב IgG כנוגדן משני לדגור את הממברנה במשך 60 עד 90 דקות.

השתמש בערכת ECL Western לזיהוי כימילומינסנטי בריאגנטים מעורבים אחד ושניים בערכה ביחס של אחד לאחד. שים את הממברנה על מגיב מעורב לדגור את הכתם במשך חמש דקות. מסננים את מגיב עודף ולקחת תמונה chemiluminescent ו colorimetric של הממברנה.

שלב את התמונות כדי לראות את האחרון עם להקות חלבון. ניתוח כתמים מערביים לגילוי ויטלוגנין הראה רצועות ספציפיות וצפויות של כ-220 קילודלטון בהזנת צמחי אורז ובלוטות רוק של החרקים. לעומת זאת, לא נצפתה להקה בצמחים שאינם ניזונים, מה שמעיד על כך שויטלוגנין שוחרר בצמח המארח כחלבון רוק.

ניתוח כתם מערבי לגילוי חלבון ננס האורז P8 הראה רצועה ספציפית וצפויה של כ-46 קילודלטון בצמחי האכלה ובגופי חרקים אלימים. לעומת זאת, לא נצפתה להקה בצמחים שאינם ניזונים ובגופי עלים שאינם אלימים, מה שמוכיח כי ניתן לזהות את החלבונים הנגיפיים גם בצמחים הניזונים. יש לקחת בחשבון את העומס הנגיפי בעלונים, את תזמון הזיהוי ואת הרפליקטים בעת ביצוע פרוטוקול זה.

שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לחקר יתושים המעבירים arboviruses.