Name: איתור חלבוני וירוס ורוק של וקטור עלה בצמח המארח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: חקור איתור חלבוני רוק של וקטור עלה וחלבוני וירוס בצמחי אורז באמצעות Western blot ו-SDS-PAGE. שיטה זו מאפשרת חקירת אינטראקציות חלבונים בצמחים ומנגנוני העברת וירוסים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31772124 ו -31972239) ואוניברסיטת פוג'יאן לחקלאות וייעור (מענק KSYLX014).

העלעלים הבוגרים הלא-אלימים הופצו במרכז לחקר וירוסים הנישאים על ידי וקטורים באוניברסיטת פוג'יאן לחקלאות וייעור, סין.
1. גידול חרקים לא אלימים
<ol><li>מגדלים את הבוגרים על שתילי אורז בכלוב קוביות בגודל 40X35X20 ס"מ (אורך X רוחב X גובה). יש לכסות צד אחד של הכלוב ברשת חסינת חרקים לצורך אוורור.<ol><li>שמור את הכלובים עם עלעלים באינקובטור המכיל בקר לחות מובנה ב 26 ° C עם לחות יחסית של 60-75% תחת תקופת צילום של 16 שעות אור ו 8 שעות כהה.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמשו בשאיפה כדי להעביר בעדינות את כל הבוגרים מהכלוב שלהם לכלוב חדש המכיל שתילי אורז טריים מדי שבוע.<ol><li>תנו ליותר מ-200 מבוגרים להזדווג ולהטיל ביצים באורז.</li>
		<li>שמרו את שתילי האורז הישנים כדי שהנימפות יצאו. החזירו את הנימפות הלא-וירוסיות החדשות האלה לשלב ה-2 בכוכב.</li>
	</ol></li>
</ol>2. רכישת וירוסים ואיסוף חרקים אלימים
<ol><li>מעבירים בזהירות את הנימפות הלא וירוסיות 2 אינץ' לצינור תרבית זכוכית (קוטר 2.5 ס"מ על גובה 15 ס"מ) למשך 1-2 שעות לרעב באמצעות השואב.<ol><li>שחררו את הנימפות לכלוב המכיל צמח אורז נגוע ב-RDV שגדל בעציץ.</li>
		<li>אפשר נימפות להאכיל על צמח האורז נגוע במשך 2 ימים. הערה: השקו בזהירות את צמח האורז והימנעו משטיפת הנימפות. אורכן של הנימפות הדו-כוכביות הוא כ-1.6-2 מ"מ.</li>
	</ol></li>
	<li>העבירו בזהירות את הנימפות הללו לכלוב חדש המכיל שתילי אורז טריים ללא וירוסים עם לחות יחסית של 60-75% תחת תקופת צילום של 16 שעות אור ו -8 שעות כהות. אפשר לנימפות להאכיל על צמח האורז נגוע במשך 12 ימים כדי להשלים את תקופת העברת הדם של RDV.</li>
</ol>3. איסוף חלבוני רוק באמצעות כלוב האכלה
<ol><li>הכינו חמישה כלובי האכלה קטנים דמויי צינור (2.5 ס"מ קוטר על 4 ס"מ גובה) שבהם קצה אחד מכוסה ברשת חסינת חרקים.</li>
	<li>כלאו 15-20 עלעלים בכל כלוב האכלה, ולאחר מכן כסו את הקצה השני של הכלוב במחצלת קצף דקה.<ol><li>מקבעים שתיל אורז אחד (בגובה 5-6 ס"מ) בין קצה הכלוב למחצלת קצף בעזרת סרטי הדבקה. ודאו שהעלעלים בכלוב ההאכלה יוכלו להיזון משתילי האורז החשופים לחלק הפנימי של הכלוב.</li>
	</ol></li>
	<li>לטבול את שורשי השתיל במים, כך צמח האורז יישאר בחיים. אפשר את leafhoppers להאכיל אותם במשך 2 ימים.</li>
	<li>הוציאו את העלעלים מכלובי ההאכלה שלהם ואספו את שתילי האורז שמהם ניזונו. חותכים את חלקי השתילים מחוץ לכלוב ומשחזרים את אזורי ההאכלה של שתילים. הערה: ניתן לאחסן דגימה זו ב -80 °C למשך 3 חודשים לכל היותר, אם היא אינה משמשת באופן מיידי לזיהוי.</li>
</ol>4. הכנת מגיב
<ol><li>יש להמיס 15.1 גרם בסיס טריס, 94 גרם גליצין ו-5 גרם SDS בליטר אחד של מים סטריליים להכנת חיץ 5xTris-גליצין. לדלל 200 מ"ל של חיץ 5xTris-גליצין עם 800 מ"ל של מים סטריליים כדי להכין חיץ 1xTris-גליצין (ראה טבלה 1 להרכב החיץ).</li>
	<li>יש להמיס 80 גרם NaCl, 30 גרם בסיס טריס ו-2 גרם KCl ב-1 ליטר מים סטריליים להכנת מאגר מלח חוצץ 10xTris (TBS). Autoclave את התמיסה ב 121 ° C במשך 15 דקות.</li>
	<li>יש להמיס 8 גרם SDS, 4 מ"ל של ß-מרקפטואתנול, 0.02 גרם ברומופנול כחול ו-40 מ"ל גליצרול ב-40 מ"ל של 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) להכנת מאגר דגימת חלבון 4x.</li>
	<li>ערבבו 800 מ"ל חיץ טריס-גליצין עם מתנול 200 מ"ל להכנת מאגר ההעברה.</li>
	<li>הוסף תמיסת 100 מ"ל 10xTBS ו- 3 מ"ל טווין 20 עד 900 מ"ל מים סטריליים כדי להכין את מאגר TBS עם תמיסת Tween 20 (TBST).</li>
</ol>5. כתם מערבי לאיתור חלבוני הרוק והויראלי
<ol><li>טוחנים 0.1 גרם של דגימות האורז עם חנקן נוזלי עד הרקמה הופכת אבקה. הוסיפו 200 μL של מאגר דגימת חלבון 4x לדגימה והרתיחו אותו במשך 10 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.<ol><li>מוציאים את הסופרנאטנט ומניחים אותו בבקבוקון חדש. טען 10 μL של הדגימה לתוך ג'ל SDS-PAGE, והפעל אותו במאגר Tris-glycine ב 150 V במשך 45-60 דקות. הערה: ניתן להשליך את השאריות לאחר הצנטריפוגה.</li>
	</ol></li>
	<li>שים קרום ניטרוצלולוז 0.45 מיקרומטר וציוד סנדוויץ' אחר במאגר ההעברה למשך 30 דקות. הערה: ניתן לבצע שלב זה לפני שהג'ל סיים את ריצתו.</li>
	<li>סנדוויץ' את הג'ל ולהעביר אותו במשך 90-120 דקות ב 100 V במאגר ההעברות.</li>
	<li>קחו את הממברנה והכניסו אותה לתמיסת חסימת חלב יבש 7% ללא שומן בתמיסת TBST למשך 20 דקות. הוסף את הנוגדן הספציפי נגד RDV P8 או Vg לתמיסה של 7% חלב יבש ללא שומן ב- TBST. לדגור עם הנוגדן להכתמת הממברנה במשך 2 שעות או לילה.</li>
	<li>שטפו את הממברנה בתמיסת TBST שלוש פעמים, עם 5 דקות כביסה בכל פעם.</li>
	<li>הוסף את IgG נגד ארנב עיזים כנוגדן משני לחלב יבש 7% ללא שומן עם TBST. יש לדגור עם הנוגדן במשך 60-90 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שטפו את הממברנה בתמיסת TBST שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם.</li>
	<li>השתמש בערכת ECL Western לשיטה הכימילומינסנטית. ערבבו ריאגנטים לזיהוי 1 ו-2 בערכה ביחס של 1:1 בצינור. שים את מגיב מעורב על הממברנה לדגור את הכתם במשך 5 דקות.</li>
	<li>מסננים את המגיב העודף ומצלמים תמונה קולורימטרית של התמונה הכימילומינסנטית. שלבו אותם כדי לראות את הסולם עם להקות חלבון.</li>
</ol>

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCranston%2C+PS+%22Encyclopedia+of+Insects%22">Encyclopedia of Insects</a>. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amsterdam. (2003).</li>
<li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li>
<li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+reoviruses+in+insect+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li>
<li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper%2C+Nephotettix+cincticeps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li>
<li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs%2C+schizaphis+graminum+%28Homoptera%3A+aphididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li>
<li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li>
<li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid%27s+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li>
<li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs%3A+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li>
<li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li>
<li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Kansas+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li>
<li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li>
<li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li>
<li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts%2C+insect+vectors+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li>
<li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transcriptomic%2Fproteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li>
<li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260(2020).</li>
<li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181(2019).</li>
<li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941(2016).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313(2019).</li>
<li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li>
<li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445(2021).</li>
<li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Faculty+of+Agriculture%2C+Hokkaido+Imperial+University%22%5BJournal%5D)">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li>
<li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li>
<li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li>
<li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211(2015).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li>
<li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563(2017).</li>
<li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li>
<li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142(2020).</li>
<li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li>
<li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li>
<li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הרוק המופרש ישירות על ידי בלוטות הרוק של החרקים המוצצים ממלא תפקיד מרכזי מכיוון שהוא מעכל מראש ומנקה רעלים מהרקמות המארחות ומהגורמים הביולוגיים חוצי הממלכות של הווקטורים לפונדקאים 1,3,4. הגורמים הביולוגיים חוצי הממלכות, כולל אליציטורים, משפיעים ורנ"א קטן, הם קריטיים לתקשורת בין חרקים למארחים14,15,16. לכן, חשיפת זנים ותפקודים נוספים של מ...

מצב השידור הווקטורי-מארח של ארבו-וירוסים, בעיה בסיסית, נמצא בחזית המדע הביולוגי. וירוסים צמחיים רבים בעלי חשיבות חקלאית מועברים אופקית על ידי וקטורים של חרקים1. יותר ממחצית הנגיפים הצמחיים הם וקטורים על ידי חרקים המיפטרניים, כולל כנימות, זבובים לבנים, עלים, פלנטהופרים ותריפס. לחרקים אלה תכונות ייחודיות המאפשרות להם להעביר ביעילות וירוסים צמחיים1. יש להם חלקי פה מוצצי פירסינג והם ניזונים מהלשד מפלואם ומקסילם, ומפרישים את הרוק שלהם 1,2,3,4. עם הפיתוח והשיפור של טכניקות, הזיהוי והניתוחים הפונקציונליים של מרכיבי הרוק הופכים למוקד חדש של מחקר אינטנסיבי. חלבוני הרוק הידועים ברוק כוללים אנזימים רבים, כגון פקטינאסטראז, צלולאז, פרוקסידאז, פוספטאז אלקליין, פוליפנול אוקסידאז וסוכראז, בין היתר 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . החלבונים ברוק כוללים גם אליקטורים המפעילים את תגובת ההגנה של הפונדקאי, ובכך משנים את ביצועי החרקים, ומשפיעים המדכאים את הגנת הפונדקאי, המשפרים את כושר החרקים ורכיבים הגורמים לתגובות פתולוגיות של המארח14,15,16,17. לכן, חלבוני רוק הם חומרים חיוניים לתקשורת בין חרקים לפונדקאים. במהלך העברת הנגיפים, הרוק המופרש על ידי בלוטות הרוק של חרקים אלימים מוצצי פירסינג מכיל גם חלבונים נגיפיים. רכיבים נגיפיים מנצלים את זרימת הרוק כדי לשחרר אותם מהחרק לפונדקאי הצמח. לכן, רוק החרק מגשר על האינטראקציה הטריטרופית וירוס-וקטור-מארח. חקירת התפקוד הביולוגי של חלבוני רוק המופרשים על ידי חרקים אלימים מסייעת להבין את הקשר בין וירוס-וקטור-מארח.
עבור וירוסים של בעלי חיים, מדווח כי רוק של יתושים מתווך את ההעברה והפתוגניות של נגיף הנילוס המערבי (WNV) ונגיף דנגי (DENV). חלבון הרוק AaSG34 מקדם שכפול והעברה של נגיף דנגי-2, ואילו חלבון הרוק AaVA-1 מקדם העברת נגיף DENV וזיקה (ZIKV) על ידי הפעלת אוטופגיה18,19. חלבון הרוק D7 של יתושים יכול לעכב זיהום DENV במבחנה ו-in vivo באמצעות אינטראקציה ישירה עם נגיפים של DENV וחלבון מעטפת DENVרקומביננטי 20. בנגיפים צמחיים, וירוס תלתלי העלים הצהובים של עגבנייה (TYLCV) גורם לחלבון הרוק של הזבוב הלבן Bsp9, המדכא את החסינות בתיווך WRKY33 של מארח הצמח, להגביר את ההעדפה והביצועים של הזבובים הלבנים, ובסופו של דבר מגביר את העברת הנגיפים21. מאחר שמחקרים על התפקיד שממלאים חלבוני רוק של חרקים בפונדקאים של צמחים פיגרו אחרי אלה של פונדקאים של בעלי חיים, נדרשת בדחיפות מערכת יציבה ואמינה לזיהוי חלבוני הרוק בפונדקאים של צמחים.
נגיף הצמח המכונה וירוס ננס אורז (RDV) מועבר על ידי הופר Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) ביעילות גבוהה ובאופן מתפשט מתמשך22,23. RDV דווח לראשונה כמועבר על ידי וקטור חרקים וגורם למחלה קשה של אורז באסיה24,25. הנגיף הוא איקוסהדרלי ודו-שכבתי כדורי, והשכבה החיצונית מכילה את חלבון הקפסיד החיצוני P822. תקופת השידור במחזור הדם של RDV ב N. cincticeps היא 14 ימים 26,27,28,29,30. כאשר RDV מגיע לבלוטות הרוק, נגיפים משתחררים לחללים המאוחסנים ברוק בבלוטות הרוק באמצעות מנגנון דמוי אקסוציטוזה23. ויטלוגנין (Vg) הוא קודמן חלבון החלמון החיוני להתפתחות ביציות בנקבות חרקים31,32,33. לרוב מיני החרקים יש לפחות תעתיק Vg אחד של 6-7 קילובייט, המקודד חלבון מקדים של כ-220 kDa. מבשרי החלבון של Vg יכולים בדרך כלל להיבקע למקטעים גדולים (140 עד 190 kDa) וקטנים (<50 kDa) לפני הכניסה לשחלה18,19. ניתוח פרוטאומי קודם גילה את נוכחותם של הפפטידים שמקורם ב-Vg ברוק המופרש של העלה Recilia dorsalis, אם כי תפקידם אינו ידוע (נתונים שלא פורסמו). לאחרונה דווח כי Vg, המופרש דרך הפה מצמחים, מתפקד כגורם משפיע לפגיעה בהגנות של צמחים34. לא ידוע אם Vg של N. cincticeps יכול גם להשתחרר לצמח המארח עם זרימת רוק, ואז יכול לשחק תפקיד בצמח להפריע להגנה על הצמח. כדי לענות על השאלה האם N. cincticeps מנצל חלבוני רוק, כגון Vg, כדי לעכב או להפעיל את הגנות הצמח, הצעד הראשון הוא זיהוי חלבונים המשתחררים לצמח במהלך ההאכלה. הבנת השיטה לזיהוי חלבוני הרוק הנמצאים בצמח עשויה להיות חיונית כדי להסביר את תפקודם של חלבוני הרוק ואת יחסי הגומלין בין המיפטרה לצמחים.
בפרוטוקול המוצג כאן, N. cincticeps משמש כדוגמה כדי לספק שיטה לבחון את נוכחותם של חלבוני רוק בצמח המארח שהוכנסו באמצעות הזנת חרקים. הפרוטוקול מפרט בעיקר את האיסוף והזיהוי של חלבוני רוק והוא מועיל לחקירה נוספת על רוב ההמיפטרנים.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריס בסיס</td><td>רוש</td><td>D609K69032</td><td>במשך 5 פעמים; בופר טריס-גליצין ו 10 פעמים; הכנת בופר TBS</td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>WXBD0677V</td><td>למשך 5 פעמים; הכנת חוצץ טריס-גליצין</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>למשך 5 פעמים; הכנת חיץ טריס-גליצין</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>10019318</td><td>במשך 10 פעמים; הכנת מאגר TBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>סינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ</td><td>10016318</td><td>במשך 10 ופעמים; TBS הכנת מאגר</td></tr> <tr><td>&szlig;-מרקפטואתנול</td><td>Xiya Reagent</td><td>B14492</td><td>עבור 4 & פעמים; הכנת מאגר דגימת חלבון</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SHBL3668</td><td>עבור 4 & פעמים; הכנת מאגר דגימת חלבון</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>10010618</td><td>עבור 4 & פעמים; הכנת מאגר דגימת חלבון</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>להכנת מאגר העברה</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>להכנת TBST</td></tr><tr><td>חלב יבש ללא שומן</td><td>Becton.Dickinso והחברה</td><td>252038</td><td>לחסימת ממברנה, דילול נוגדנים</td></tr><tr><td>עז אנטי ארנב IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>הכרה בערכה המערבית הראשונית</td></tr><tr><td>והגוף ECL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>מצע כימילומינסנט</td></tr><tr><td>ניטרוצלולוז ממברנה</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>לחלבונים העברה</td></tr><tr><td><חזק>מאגרים ותמיסות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>בופר</חזק></td><td><חזק>הרכב</חזק></td><td></td><td><חזק>הערות/תיאור</חזק>&</td></tr>&<tr><td>nbsp; 5 ופעמים; טריס-גליצין בופר</td><td>15.1 גרם Tris base 94 גרם גליצין &nbsp; 5 גרם SDS ב-1 ליטר מים</td><td></td> סטריליים<td>&nbsp; פתרון מלאי</td></tr><tr><td>1 ופעמים; בופר טריס-גליצין</td><td>200 מ"ל של 5& פעמים; Tris-glycine buffer 800 מ"ל מים</td><td></td> סטריליים <td>פתרון עבודה, עבור SDS-PAGE</td></tr><tr><td>10& פעמים; חוצץ תמיסת מלח (TBS)</td><td>80 גרם NaCl 30 גרם Tris base 2 גרם KCl ב-1 ליטר מים</td><td></td> סטריליים <td>תמיסת מלאי</td></tr><tr><td>TBS עם תמיסת Tween 20 (TBST)</td><td>100 מ"ל 10& פעמים; תמיסת TBS 3 מ"ל Tween 20 900 מ"ל מים</td><td></td> סטריליים <td>תמיסת עבודה</td></tr><tr><td>4&; מאגר דגימת חלבון</td><td>8 גרם SDS 4 מ"ל &szlig;-mercaptoethanol 0.02 גרם ברומופנול כחול 40 מ"ל גליצרול ב-40 מ"ל 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td><td></td> <td>למיצוי חלבון</td></tr><tr><td>מאגר העברה</td><td>800 מ"ל מאגר טריס-גליצין 200 מ"ל מתנול</td><td></td><td>עבור העברת חלבון</td></tr><tr><td><חזק>מכשירים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SHBL3668</td><td>להכנת מאגר דגימת חלבון 4x</td></tr><tr><td>חממה בטמפרטורה קבועה</td><td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td><td>PRX-1200B</td><td>לגידול עלים</td></tr><tr><td>Electrophoresis</td><td>Tanon Science & טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>Tanon EP300</td><td>עבור SDS-PAGE</td></tr><tr><td>מודול ליבת העברה אלקטרופורטית</td><td>BIO-RAD</td><td>1703935</td><td>עבור SDS-PAGE</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10010618</td><td>עבור 4x חלבון מאגר מאגר</td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>WXBD0677V</td><td>עבור 5x Tris-glycine buffer הכנת</td></tr><tr><td>עז אנטי ארנב IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>הכרה במכשיר טחינת הרקמות העיקרי והגוף</td></tr><tr><td>הגבוה</td><td>שנחאי Jingxin פיתוח תעשייתי ושות 'בע"מ</td><td>JXFSIPRP-24</td><td>לטחינת רקמות צמח</td></tr><tr><td>KCl</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td></td><td>10016318 עבור 10x TBS מאגר הכנת</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10014118</td><td>להכנת מאגר העברה</td></tr><tr><td>מיני רטוב העברת חום שוקת</td><td>BIO-RAD</td><td>1703930</td><td>עבור SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10019318</td><td>להכנת חיץ ניטרוצלולוזה 10x TBS</td></tr><tr><td>קרום ניטרוצלולוזה</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>לחלבונים העברת</td></tr><tr><td>חלב יבש ללא שומן</td><td>Becton.Dickinso והחברה</td><td>252038</td><td>לחסימת ממברנה, דילול נוגדנים</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>מצע כימילומינסנט</td></tr><tr><td>מכשיר צבע חלבון</td><td>GE מדעי הבריאות AB</td><td>Amersham lmager 600</td><td>לגילוי חלבונים</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>להכנת מאגר טריס-גליצין 5x</td></tr><tr><td>Tris בסיס</td><td>Roche</td><td>D609K69032</td><td>עבור 5x Tris-glycine buffer ו-10&times; הכנת מאגר TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>להכנת TBST</td></tr><tr><td>טנק אלקטרופורזה צלחת אנכית</td><td>BIO-RAD</td><td>1658001</td><td>לאמבט מים SDS-PAGE</td></tr><tr><td></td><td>שנחאי Jinghong ציוד ניסיוני ושות', בע"מ</td><td>XMTD-8222</td><td>להרתיח את דגימות החלבון</td></tr><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול</td><td>Xiya Reagent</td><td>B14492</td><td>להכנת מאגר דגימת חלבון פי 4</td></tr></tbody></table>

איתור חלבוני וירוס ורוק של וקטור עלה בצמח המארח

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

וקטורי חרקים מעבירים אופקית וירוסים צמחיים רבים בעלי חשיבות חקלאית. יותר ממחצית הנגיפים הצמחיים מועברים על ידי חרקים המיפטרניים שיש להם חלקי פה מוצצים חודרים. במהלך העברה ויראלית, רוק החרק מגשר בין הנגיף-וקטור-מארח מכיוון שווקטורי הרוק נגיפים, וחלבוני החרקים, מעוררים או מדכאים את התגובה החיסונית של צמחים מחרקים לפונדקאים צמחיים. הזיהוי והניתוחים הפונקציונליים של חלבוני רוק הופכים לתחום חדש של התמקדות בתחום המחקר של אינטראקציות ארבו-וירוס-מארח. פרוטוקול זה מספק מערכת לזיהוי חלבונים ברוק של עלעלים באמצעות הצמח המארח. וקטור ההופר Nephotettix cincticeps הנגוע בנגיף ננס האורז (RDV) משמש כדוגמה. ויטלוגנין וחלבון הקפסיד החיצוני העיקרי P8 של RDV וקטור על ידי הרוק של N. cincticeps ניתן לזהות בו זמנית בצמח האורז כי N. cincticeps ניזון ממנו . שיטה זו ישימה לבדיקת חלבוני הרוק הנשמרים באופן זמני בצמח המארח לאחר הזנת חרקים. הוא האמין כי מערכת זו של זיהוי יועיל המחקר של hemipteran-virus-צמח או hemipteran-צמח אינטראקציות.

איור 1 מדגים את כל השלבים בפרוטוקול הזה: גידול חרקים, רכישת וירוסים, איסוף חלבוני רוק באמצעות הזנת אורז והכתם המערבי. תוצאות הכתמים המערביים הראו כי רצועות ספציפיות וצפויות של כ -220 kDa נצפו בדגימות של בלוטות אורז ורוק של חרקים על הממברנה מודגרות עם נוגדנים נגד Vg. לעומת זאת, לא נצפתה להקה בדגימת האורז שאינה ניזונה. התוצאה באיור 2 מצביעה על כך ש-Vg שוחרר לצמח המארח כחלבון רוק. על הממברנה המודגרת עם נוגדנים נגד RDV P8, נצפתה רצועה ספציפ...

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בצמח המארח כדי לזהות חלבוני רוק של חלבונים נגיפיים צמחיים וחלבונים נגיפיים צמחיים המשתחררים על ידי וקטורי עלים.

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

פרוטוקול זה מספק טכניקה לזיהוי חלבוני הרוק של עלעלים ופונדקאים צמחיים כדי להמשיך לחקור את תפקודם של חלבונים אלה בפונדקאים של הצמח. טכניקה זו קלה לביצוע והמערכת יציבה וניתנת לשכפול. שיטה זו יכולה גם להיות מועילה בזיהוי חלבוני רוק של המיפטרות אחרות ופונדקאים צמחיים.כדי להתחיל, מגדלים את העלעלים הבוגרים על שתילי אורז בכלוב קוביות בגודל 40 על 35 על 20 סנטימטרים. יש לכסות צד אחד של הכלוב ברשת חסינת חרקים לצורך אוורור. הניחו את הכלובים עם העלעלים באינקובטור המכיל בקר לחות מובנה בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס עם לחות יחסית של 60 עד 75% בתקופת צילום של 16 שעות אור ושמונה שעות חושך.פעם בשבוע, השתמשו בשאיפה כדי להעביר בעדינות את כל המבוגרים מהכלוב שלהם לכלוב חדש המכיל שתילי אורז טריים. אפשרו ליותר מ-200 מבוגרים להזדווג ולהטיל ביצים באורז. שמרו את שתילי האורז הישנים כדי שהנימפות ייצאו ויגדילו את הנימפות הלא-ארסיות החדשות האלה לשלב האינסטאר השני.בעזרת השואב, מעבירים בזהירות את הנימפות הלא אלימות האינסטאריות השניות לצינור תרבית זכוכית למשך שעה עד שעתיים לרעב. לאחר מכן שחררו את הנימפות לכלוב המכיל צמח אורז נגוע בנגיף ננסי אורז שגדל בעציץ ואפשרו לנימפות להיזון מצמח האורז הנגוע במשך יומיים. לאחר יומיים, העבירו בזהירות את הנימפות הללו לכלוב חדש המכיל שתילי אורז טריים ללא וירוסים, ואפשרו לנימפות להיזון משתילי האורז נטולי הנגיף במשך 12 יום כדי להשלים את תקופת העברת הדם של נגיף ננסי האורז.כדי לאסוף את חלבוני הרוק, הכינו חמישה כלובי האכלה קטנים דמויי צינור המכוסים ברשתות חסינות חרקים בקצה אחד. לאחר כליאת 15 עד 20 עלעלים בכל כלוב האכלה, כסו את הקצה השני של הכלוב בשטיחון קצף דק. קבעו שתיל אורז אחד בין קצה הכלוב למחצלת קצף בעזרת סרטי הדבקה, וודאו שהעלעלים בכלוב ההאכלה יוכלו להיזון משתילי האורז החשופים לחלק הפנימי של הכלוב.טובלים את שורשי השתיל במים כדי שצמח האורז יישאר בחיים, ומאפשרים לעלעלים להיזון מהם במשך יומיים. לאחר יומיים, הוציאו את העלעלים מכלובי ההאכלה שלהם ואספו את שתילי האורז שעליהם ניזונו העלים. חותכים את השתילים מחוץ לכלוב ומשחזרים את אזורי ההאכלה של השתילים.הכינו חיץ טריס-גליצין 1x על ידי דילול 200 מיליליטר של חיץ 5x מוכן עם 800 מיליליטר מים סטריליים. לאחר מכן הכינו מאגר של 10x TBS ובצעו אוטוקלאבינג של התמיסה בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, הכינו את מאגר דגימת החלבון 4x.לאחר מכן להכין את מאגר ההעברה על ידי ערבוב 800 מיליליטר של חיץ Tris-גליצין עם 200 מיליליטר של מתנול. לבסוף, הכינו את פתרון TBST על ידי הוספת 100 מיליליטר של 10x TBS ושלושה מיליליטר של Tween 20 עד 900 מיליליטר של מים סטריליים. כדי לזהות את חלבוני הרוק והנגיפים, לטחון 0.1 גרם של דגימות האורז עם חנקן נוזלי עד הרקמה הופכת אבקה.לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטר של מאגר דגימת חלבון 4x לדגימה ומרתיחים במשך 10 דקות. צנטריפוגו את הדגימות והעבירו את הסופרנאטנט לבקבוקון חדש. טען 10 מיקרוליטר של הדגימה על ג'ל SDS-PAGE והפעל אותה במאגר Tris-Glycine במתח של 150 וולט למשך 45 עד 60 דקות.בזמן שהג'ל פועל, הניחו קרום ניטרוצלולוז 0.45 מיקרון וציוד סנדוויץ' אחר במאגר ההעברה למשך 30 דקות. לאחר הריצה, סנדוויץ' את הג'ל ולהעביר אותו במשך 90 עד 120 דקות ב 100 וולט במאגר ההעברה. לאחר השלמת הניקוי, הניחו את הממברנה בתמיסת חסימת חלב יבש ללא שומן 7% ב-TBST ודגרו במשך 20 דקות.לאחר מכן, להוסיף נוגדן נגד וירוס ננס האורז P8 או vitellogenin לדגור על הממברנה במשך שעתיים או לילה. לאחר הדגירה, שטפו את הממברנה עם TBST שלוש פעמים עם דגירה של חמש דקות בין כל שטיפה. לאחר מכן להוסיף עז נגד ארנב IgG כנוגדן משני לדגור את הממברנה במשך 60 עד 90 דקות.השתמש בערכת ECL Western לזיהוי כימילומינסנטי בריאגנטים מעורבים אחד ושניים בערכה ביחס של אחד לאחד. שים את הממברנה על מגיב מעורב לדגור את הכתם במשך חמש דקות. מסננים את מגיב עודף ולקחת תמונה chemiluminescent ו colorimetric של הממברנה.שלב את התמונות כדי לראות את האחרון עם להקות חלבון. ניתוח כתמים מערביים לגילוי ויטלוגנין הראה רצועות ספציפיות וצפויות של כ-220 קילודלטון בהזנת צמחי אורז ובלוטות רוק של החרקים. לעומת זאת, לא נצפתה להקה בצמחים שאינם ניזונים, מה שמעיד על כך שויטלוגנין שוחרר בצמח המארח כחלבון רוק.ניתוח כתם מערבי לגילוי חלבון ננס האורז P8 הראה רצועה ספציפית וצפויה של כ-46 קילודלטון בצמחי האכלה ובגופי חרקים אלימים. לעומת זאת, לא נצפתה להקה בצמחים שאינם ניזונים ובגופי עלים שאינם אלימים, מה שמוכיח כי ניתן לזהות את החלבונים הנגיפיים גם בצמחים הניזונים. יש לקחת בחשבון את העומס הנגיפי בעלונים, את תזמון הזיהוי ואת הרפליקטים בעת ביצוע פרוטוקול זה.שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לחקר יתושים המעבירים arboviruses.

detecting-virus-salivary-proteins-leafhopper-vector-plant

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כנימות הם משדרים יעיל של וירוסים הצמח. Microinjection כנימה של הנגיף, ההליך נוכל להראות לכם היום, היא טכניקה המאפשרת לחוקרים להזרים וירוס ישירות hemocoel של הכנימה, לעקוף את המעיים, אחד 2 המחסומים העיקריים להעברת הנגיף באופן circulative. באותה טכניקה משמשת גם להזריק dsRNA עבור RNAi.

בדיקת חסמים פיזיולוגיים להעברת נגיפי ב כנימות שימוש Microinjection

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

אנו מתארים כאן הקרינה פשוטה בשיטת הכלאה באתר (FISH) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים ברקמות חרקים וצמחים. פרוטוקול זה יכול להתארך להדמיה של ה-mRNA בהר שלם וחתכים מיקרוסקופיים.

פלואורסצנציה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים

צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את חלוקת מארח-רקמות, מצב שידור, וכן השפעה על כושר המארח של densovirus בתוך מינים פרפראים, את bollworm הכותנה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור לימוד האינטראקציה בין וירוסים דרך פה-המשודר אחרים ומארחי החרקים שלהם.

פרוטוקולים לחקירת הפצת Host-הרקמה, הילוכים-mode, ואת ההשפעה על כושר Host של Densovirus ב bollworm הכותנה

כאן אנו מציגים גישה חדשה לזיהוי וירוסים עם כפול-גדיל DNA הגנום. אנו משתמשים בשיטות הרגילות כדי לחלץ DNA ו- RNA עלים נגועים ולבצע רצף הדור הבא. כלים Bioinformatic להרכיב רצפים לתוך contigs, לזהות contigs המייצג את הגנום של וירוס והקצה הגנום לקבוצות בטקסונומיה.

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

כאן, אנו מציגים שיטת הקרנה שונה שניתן להשתמש בהרחבה כדי להקרין במהירות RNA השתקה דכאי במחלות צמחים.

הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

פרוטוקול זה לתיוג אימונופלואורסצנטי של חלבוני וירוסים צמחיים וחלבוני חרקים וקטוריים במעי חרקים שנכרתו יכול לשמש לחקר אינטראקציות בין חרקים נגיפים ווקטוריים, פונקציות חלבון חרקים ומנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס העברת הנגיף.

תיוג אימונופלואורסצנטי של חלבונים וקטוריים של וירוסים צמחיים וחרקים במעיים המיפטרניים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לאיסוף מספיק רוק מחרקים יונקים באמצעות מדיום מלאכותי. זוהי שיטה נוחה לאיסוף רוק חרקים וחקר תפקוד הרוק על התנהגות האכלת חרקים והעברת וירוסים המועברים בווקטורים.

שיטת כריך ממברנה דו שכבתית עבור אוסף הרוק של לאודלפקס

אנו מתארים שיטה לאיסוף המולימפה הניתנת לכימות ביעילות מפרוקי רגליים קטנים לצורך ניתוח לאחר מכן.

שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים

חקור איתור חלבוני רוק של וקטור עלה וחלבוני וירוס בצמחי אורז באמצעות Western blot ו-SDS-PAGE. שיטה זו מאפשרת חקירת אינטראקציות חלבונים בצמחים ומנגנוני העברת וירוסים.

איתור חלבוני וירוס ורוק של וקטור עלה בצמח המארח

גלה סרטונים נוספים