Name: רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-EGFR-Mutant NSCLC (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: למדו פרוטוקול להערכת רגישות לתרופות באורגנואידים מסרטן ריאה NSCLC עם מוטציות EGFR. השיטה משתמשת באוסימרטיניב ובדיקת ניידות תאים לפיתוח טיפולים מותאמים אישית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למעבדות של ירון P Roose (UCSF) וקלווין J Kuo (סטנפורד) על הקלט שלהם לגבי תרבות organoid ופיתוח פרוטוקול. אנו מודים עוד יותר Oghenekevwe M. Gbenedio (מעבדת רוס, UCSF) על פרוטוקולים וקלט הקמת מדגם. פרויקט מחקר זה נערך בתמיכת NIH [U54CA224081]. פ. הזרק נתמך על ידי מלגת הפוסט-דוקטורט של מילדרד שיל מהסיוע הגרמני לסרטן.

עבור מחקר של נבדקים אנושיים, הושגה הסכמה מדעת ואיסוף רקמות בוצע תחת הפרוטוקולים המאושרים של ועדת הבדיקה הפנימית של UCSF (IRB, פרוטוקול מס ': #13-12492, או CC #17-23309). הקמת תרביות אורגנויד מדגימות קליניות שלא זוהו בוצעה בשיתוף פעולה עם שותפי מחקר על פי שיטות שפורסמו בעבר13,14,15,16. תרביות אורגנויד אוחזרו לתחזוקה וניסויים להסלמה בסמים במעבר שלוש או מאוחר יותר. כל הפרוטוקולים הבאים בוצעו בתנאים אספטיים בסביבת מעבדה לתרבות רקמת יונקים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig1v2.jpg"> איור 1: שרטוט פרוטוקול של זרימת עבודה ושלבים קריטיים בטכניקה. (א) זרימת עבודה ניסיונית הכוללת זריעת אורגנוידים בפורמט של 96 בארות, טיפול בהסלמה תרופתית ב-7 ימים לאחר הזריעה, והקריאה של הישרדות תאים מבוססת אור 5 ימים לאחר הטיפול באמצעות קורא לוחות ELISA. (B) תמונה לדוגמה של תרבויות האורגנויד TH107 החיוביות של EGFRdel19 ו- EGFRL858R חיובי TH330 NSCLC. תרבויות מקוריות, תאים בזמן הזריעה (יום 0), ואורגנוידים בטיפול מתחילים 7 ימים לאחר הזריעה (יום 7) מוצגים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. שינויים בקוטר האורגנויד במהלך תקופת התרבות הראשונית של 7 ימים מכמתים ומצביעים על עלייה של פי &gt; פי שניים בגודל האורגנויד. שינויי קיפול יחסיים בגדלים ביום 7 בהשוואה לגודל הממוצע ביום 0 מוצגים מתחת לתמונות הייצוגיות. עבור TH107, נצפה שינוי קיפול של 2.38 על פני 7 ימים, המציין זמן הכפלה של 5.88 ימים (141.12 שעות). עבור TH330, נצפה שינוי קיפול של 2.41 על פני 7 ימים, המציין זמן הכפלה של 5.81 ימים (139.42 שעות). כימות השינויים בגודל האורגנויד והערכה סטטיסטית מוצגים (מימין). מובהקות סטטיסטית מחושבת על ידי t-test לא מזווג, p &lt; 0.0001. (ג) פריסת טיפול להסלמה תרופתית בפורמט צלחת 96-well organoid. מספר המשוכפלים הטכניים והמינונים המופתיים מצוין, כולל שליטה שלילית. השרטוטים נוצרים באמצעות BioRender, כלי איור מבוסס אינטרנט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig1v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
1. הכנות ניסיוניות
<ol><li>הכן מדיום צמיחה (GM) כפי שדווח בעבר15: תערובת התזונתיים של הנשר המתוקן של Dulbecco F12 (DMEM/F-12) עם L-alanyl-L-גלוטמין, בתוספת 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיציצין, 10 מ"מ HEPES, 25 ננומטר hRspondin, 1x B27, 5 מ"מ ניקוטינאמיד, 1.25 מ"מ N-אצטילציסטאין, 500 ננומטר A-8301, 500 nM SB20202190, 50 מיקרוגרם / mL Primocin, 100 ng / mL hNoggin, 100 ng / mL hFGF-10, 25 ננוגרם/מ"ל hFGF-7 (ראו טבלת חומרים). הערה: יש לערבב בעדינות כדי להימנע מהקצפה ולסנן דרך מערכת סינון של 0.22 מיקרומטר. יש לחמם את המדיה ל-37°C תוך שעה לפני השימוש.</li>
	<li>הכן מדיה גורם גדילה נמוכה (LGM) כפי שדווח בעבר16 ללא תוספת של גורם גדילה אפידרמיס (EGF): תערובת מתקדמת של דולבק של נשר שונה בינוני/חזיר F12 (DMEM / F-12), בתוספת 1 מ"מ HEPES, 1x L-אלניל-L-גלוטמין, 1x פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין, 10 מ"מ ניקוטינאמיד, 1 מ"מ ניקוטינאמיד, 1 מ"מ N-אצטילציסטאין, 1x B27, 500 nM A-8301, 100 ננוגרם/מ"ל hNoggin. הערה: יש לערבב בעדינות כדי להימנע מהקצפה ולסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש לחמם את המדיה ל-37°C תוך שעה לפני השימוש.</li>
	<li>להפשיר BME2 (תמצית מופחתת קרום מרתף גורם גדילה, סוג 2, ראה טבלת חומרים) על קרח, ב 4 °C (60 °F), לילה.</li>
</ol>2. יצירת השעיה חד-תאית וזריעה של תאים
<ol><li>ניתוק תרבות האורגנויד BME2 שקועה כמתואר בשלבים הבאים (2.1.1-2.1.1.6).<ol>
<li>שאפו בזהירות את התקשורת מלוחות התרבות. הימנעו מלגעת בתרבות האורגנויד BME2 השקועה. הערה: שאיפה תקשורתית יכולה להיעשות כפי שהחוקר מעדיף, למשל, עם מערכת שאיפה נוזלית בסיסית או באמצעות פיפטה. הימנעו מלגעת באורגנוידים המוטבעים BME2 מכיוון שהדבר עלול לגרום לאובדן ביומסה אורגנויד.</li>
		<li>טריפסין את תרבות האורגנויד BME2 השקועה עם אנזים רקומביננטי מתאים (ראה טבלת חומרים). בתבנית צלחת 6-well, להוסיף 2 מ"ל לבאר. לשבור את BME2 באופן מכני על ידי צנרת שוב ושוב למעלה ולמטה. לוחות דגירה ב 37 °C (5 °F) בחממה תרבית התא במשך 5 דקות.</li>
		<li>מעבירים את ההשעיה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-600 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>שאפו את האנזים רקומביננטי בזהירות מבלי לגעת בכדור האורגנויד. הערה: שאריות BME2 עשויות להיות נוכחות. חזור על עיכול האנזים במידת הצורך.</li>
		<li>Resuspend גלולה organoid ב GM (שלב 1.1). הוסף DNase I 1x 100 U / mL ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>צנטריפוגה בטמפרטורת 600 גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. פיפטה את התקשורת בזהירות מבלי לגעת גלולה organoid ולהשליך. Resuspend ב GM טרי.</li>
	</ol></li>
	<li>זריעה של השעיית תא יחיד אורגנויד<ol><li>מחממים מראש צלחת שחורה חדשה, ברורה-תחתון 96-well ב 37 °C (50 °F) בחממה תרבית התא במשך 10 דקות. הערה: שימוש בלוחות תחתון ברורים חיוני לניטור צמיחת אורגנויד ותגובת סמים.</li>
		<li>לספירה, הכן דילול של 1:5 של השעיית התא ב- PBS (נפח כולל: 500 μL) וספור את ההשעיה התאית באמצעות מנתח תאים (ראה טבלת חומרים). הערה: הקפד להתרבות על ידי גורם הדילול (x 5) כדי לקבל את ריכוז התא הסופי. ניתן להשתמש בשיטות ספירה חלופיות כגון hemocytometer. כדאיות התא צריכה להיות מנוטרת באמצעות בדיקת הכדאיות מכתמת (למשל, עם טריפאן Blue17). באמצעות מנתח תאים, הכדאיות מוערכת באופן אוטומטי. הכדאיות של השעיות אורגנויד של תא יחיד כפי שהוערכו על ידי מנתח התאים צריכה להיות ≥95% (איור משלים 1).</li>
		<li>חשב את הנפח של ההשעיה התאית הדרושה כדי לזרוע לניסוי. הערה: ריכוז הזריעה הוא 1500 תאים / μL BME2, עם 5 μL BME2 הדרוש לבאר (מספר כולל: 7500 תאים / טוב). עבור צלחת אחת של 96 בארות, נדרשים 6 x 10E5 תאים. זה כולל זריעה של 60 בארות עם כיפות organoid (4.5 x 10E5) ועודף ניסיוני (חישוב עבור סך של 80 בארות).</li>
		<li>הכן aliquot אחד של השעיית תאים בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל לכל צלחת 96-well מתוכנן להיות זרע אם לוחות מרובים 96-well כלולים בניסוי. הערה: עודף ניסיוני ו aliquots נפרד לכל צלחת 96-well זרע נדרשים כדי להסביר את ההטיה הניסיונית המוגברת עקב טיפול BME2.</li>
		<li>תאי Aliquot מההשעיה של תא בודד כפי שחושבו (שלב 2.2.3) לאחר חידוש זהיר על-ידי צנרת למעלה ולמטה. כדורי תאים ב 600 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את המדיה באמצעות פיפטה P200 מבלי לגעת בגלולה התא. מניחים את גלולה התא על הקרח תוך זמן קצר (~ 1 דקות) ומנצלים מחדש את גלולה התא ב- BME2. הערה: שאריות מדיה עלולות לסכן את המבנה והנוקשות של BME2. פיפטה את כל התקשורת בזהירות. מניחים תאים על קרח תוך זמן קצר כדי להסתגל לכדור התא ולאפשר לתאים להיות resuspended ב- BME2 מבלי להתגבש. שמור BME2 על קרח כל הזמן כדי שהוא יישאר במצב הנוזלי. עבור צלחת אחת 96-well, 400 μL BME2 נדרש עבור resuspension של גלולה התא. Resuspend כדורי התא בזהירות, הימנעות המבוא של בועות.</li>
		<li>הטה את לוחית 96 הבאר השחורה והחממה מראש לכיוונך. תאי צלחת המשתמשים ב-5 μL של השעיית תאים לבאר וזריעה של כיפות תאים במיקום השעה 6 של כל באר (איור 1A).  זרעו את כיפות התאים בבארות הפנימיות הנותרות (עמודות 2-10 ושורות B-G של צלחת 96 בארות). הערה: מומלץ לבצע צנרת הפוכה18 בעת טיפול ב- BME2.</li>
		<li>אין להזיז את הצלחת של 96 הבארות ולדגור כיפות תאים טריות שנזרעו במכסה המנוע של זרימה למינארית תרבית התא במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להעביר את הצלחת לאינקובטור תרבית התאים ולדגור אותו במשך 10 דקות ב 37 °C (37 °F).</li>
		<li>בזהירות להוסיף 100 μL של GM לכל באר לכל הבארות המכילות organoids (עמודות 2-10 ושורות B-G של צלחת 96-well). הוסף 100 μL של PBS לבארות החיצוניות בקצה הצלחת.</li>
		<li>תרבות BME2 מוטבע organoids במדיה GM ב 37 °C (50 °F) בחממה תרבית התא במשך 7 ימים בסך הכל. בדוק את הצמיחה של organoids תחת מיקרוסקופ האור באופן קבוע. הערה: עיין באיור 1B ובטבלה המשלימה 1 כדוגמה להתקדמות הצמיחה הצפויה מזריעה ליום הטיפול.</li>
		<li>שנה את המדיה פעם אחת לאחר 3-4 ימים של תרבות: לסובב את הצלחת בכיוון השעון על ידי 180 ° (organoids עכשיו במיקום 12: 00), בזהירות לשאוף GM מעמדה הפוכה לכיפה organoid באמצעות מנגנון רב ערוצי אם זמין, ולאחר מכן להוסיף GM טרי.</li>
	</ol></li>
</ol>3. טיפול תרופתי
<ol><li>הכן דילול סמים סדרתי ב- LGM עבור התרופה המועדפת, למשל, אוסימרטיניב, לטיפול באורגנוידים NSCLC מוטנטיים EGFR. כלול פקד שלילי (LGM media + 0.1% DMSO). הכן aliquots סמים מספיק של כל המינונים על פי מספר הבארות זרע בתוספת עודף ניסיוני. הערה: סדרת דילול הכוללת ≥8 מנות ונעה בין 1 nM-10 μM מומלץ עבור מעכבים ממוקדים.</li>
	<li>סובב את לוח האורגנויד בכיוון השעון ב-180° (אורגנוידים נמצאים כעת במיקום של השעה 12). בזהירות לשאוף GM באמצעות מנגנון רב ערוצי רצוי. הערה: הימנעו מלגעת בכיפת האורגנוידים תוך שאיפה ל-GM מכיוון שהדבר עלול לגרום לאובדן ביומסה אורגנויד ותוצאות השפעה.</li>
	<li>הוסף 100 μL של שליטה (למשל, LGM מדיה + 0.1% DMSO) או פתרון תרופה לבאר. הערה: עיין באיור 1C עבור סכמטי הטיפול בהסלמה תרופתית בתבנית צלחת של 96 בארות.</li>
	<li>אינדגירה טיפלה organoids ב 37 °C (5 °F) בחממה תרבית התא במשך 5 ימים.</li>
</ol>4. קריאה על ידי בדיקת הישרדות מבוססת זוהר
<ol><li>קריאת קציר והישרדות<ol>
<li>בצע את בדיקת ההישרדות על פי Reference19.<ol>
<li>להפשיר ריאגנט (ראה טבלת חומרים) לילה ב 4 °C (65 °F). שיווי משקל ריאגנט באמבט מים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לפני השימוש ומערבבים על ידי היפוך.</li>
			<li>הוסף נפח שווה של ריאגנט לכל באר (100 μL לבאר). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה, עם קצה פיפטה להציב במיקום של כיפת organoid. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
			<li>באמצעות פיפטה רב-ערוצית, העבירו כ-75% (150 μL) מהליסאט (שלב 4.1.1.2) לצלחת חדשה לבנה ואטומה של 96 בארות. הערה: העברת 75% מהליסטים לצלחת חדשה מבטיחה היעדר בועות בקריאה המאוחרת יותר מבלי להשפיע על רגישות הבדיקה.</li>
			<li>דגירה למשך 25 דקות נוספות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הקלט אור באמצעות קורא לוחות ELISA (זמן שילוב 0.25-1 s/per well) (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>שמור נתונים בתבנית מתאימה, לדוגמה, טבלת נתונים המכילה את כל הקריאות וההקלטות הגולמיות של פריסת הלוח והתרופות המשמשות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי (ראה טבלת חומרים)<ol>
<li>צור טבלת XY חדשה והוסף נתונים בתבנית XY: שורות (X) הן שליטה שלילית ואחריהן מינוני סמים הסלמה, עם מינונים כמו יומן [מעכב] בריכוז טוחנת. עמודות (Y) הן ערכי קריאה הכוללים שכפולים המוערמים יחד עם עמודות. הערה: ריכוז הפקד השלילי צריך להיות מצוין כערך מינימלי (נתון 0 אינו אפשרי בקנה מידה יומן), למשל, יומן [מעכב], M = -10.</li>
		<li>נרמל ערכים על-ידי בחירה באפשרות נתח &gt; לנרמל ובאמצעות הפרמטרים הבאים: לנרמל כל תת-קולומן בנפרד, Y = 0 כ- 0 %, "ערך אחרון בכל תת-קולון (או הראשון, הגדול מביניהם)" כ- 100 %, גורם באחוזים, גרף את התוצאות.</li>
		<li>התאם עקומת רגרסיה לא ליניארית בנתונים מנורמלים על-ידי בחירה באפשרות ניתוח ניתוח XY &gt; &gt; &gt; רגרסיה לא ליניארית &gt; תגובת מינון - עיכוב &gt; יומן רישום (מעכב) לעומת תגובה מנורמלת - שיפוע משתנה.</li>
		<li>דווח על תוצאות כטבלה של ערכי IC50 שהופקו לאחר ניתוח רגרסיה לא ליניארי וגרף של עקומת תגובה כולל נקודות נתונים מנורמלות כממוצע +/- סטיית תקן ועקומת רגרסיה מותאמת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>de Bono, J. S., Ashworth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+cancer+research+into+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translating cancer research into targeted therapeutics.</a> Nature. 467 (7315), 543-549 (2010).</li>
<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+profiling+identifies+common+responders+to+chemotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li>
<li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+establishing+pure+lung+cancer+organoids+limit+their+utility+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine.</a> Cell Reports. 31 (5), 107588(2020).</li>
<li>Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+organoids+for+cancer+biology+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Applications of organoids for cancer biology and precision medicine.</a> Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).</li>
<li>Bivona, T. G., Doebele, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+understanding+and+targeting+residual+disease+in+oncogene-driven+solid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A framework for understanding and targeting residual disease in oncogene-driven solid cancers.</a> Nature Medicine. 22 (5), 472-478 (2016).</li>
<li>Jabs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+drug+effects+in+patient-derived+cancer+cells+links+organoid+responses+to+genome+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations.</a> Molecular Systems Biology. 13 (11), 955(2017).</li>
<li>Tashiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+ex+vivo+cetuximab+sensitivity+assay+using+three-dimensional+primary+culture+system+to+stratify+KRAS+mutant+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo and ex vivo cetuximab sensitivity assay using three-dimensional primary culture system to stratify KRAS mutant colorectal cancer.</a> PLoS One. 12 (3), 0174151(2017).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
<li>Hysenaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+studies+in+lung+organoids+identify+TSPAN8+as+novel+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection studies in lung organoids identify TSPAN8 as novel mediator.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocol in Immunology. , Appendix 3, Appendix 3B (2001).</li>
<li>Pushparaj, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences%3A+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformation%22%5BJournal%5D)">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li>
<li>Promega Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellTiter-Glo+3D+Cell+Viability+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Corporation%22%5BJournal%5D)">CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay.</a> Promega Corporation. , (2021).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+lung+cancer+organoids+as+in+vitro+cancer+models+for+therapeutic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening.</a> Nature Communication. 10 (1), 3991(2019).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+organoids+analyzed+on+microwell+arrays+predict+drug+responses+of+patients+within+a+week%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week.</a> Nature Communication. 12 (1), 2581(2021).</li>
<li>Shi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+as+preclinical+models+of+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures as preclinical models of non-small cell lung cancer.</a> Clinical Cancer Research. 26 (5), 1162-1174 (2020).</li>
<li>Collisson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+profiling+of+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma.</a> Nature. 511 (7511), 543-550 (2014).</li>
<li>Ramalingam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+Survival+with+Osimertinib+in+untreated%2C+EGFR-mutated+advanced+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Overall Survival with Osimertinib in untreated, EGFR-mutated advanced NSCLC.</a> New England Journal of Medicine. 382 (1), 41-50 (2019).</li>
<li>Soria, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osimertinib+in+untreated+EGFR-mutated+advanced+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 378 (2), 113-125 (2017).</li>
<li>Rotow, J., Bivona, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+targeting+resistance+mechanisms+in+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Understanding and targeting resistance mechanisms in NSCLC.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (11), 637-658 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+AXL+kinase+causes+resistance+to+EGFR-targeted+therapy+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Activation of the AXL kinase causes resistance to EGFR-targeted therapy in lung cancer.</a> Nature Genetics. 44 (8), 852-860 (2012).</li>
<li>Kanda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erlotinib+resistance+in+lung+cancer+cells+mediated+by+integrin+%CE%B21%2FSrc%2FAkt-driven+bypass+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Erlotinib resistance in lung cancer cells mediated by integrin β1/Src/Akt-driven bypass signaling.</a> Cancer Research. 73 (20), 6243-6253 (2013).</li>
<li>Bruun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+from+multiple+colorectal+cancer+liver+metastases+reveal+moderate+intra-patient+pharmacotranscriptomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids from multiple colorectal cancer liver metastases reveal moderate intra-patient pharmacotranscriptomic heterogeneity.</a> Clinical Cancer Research. 26 (15), 4107-4119 (2020).</li>
<li>Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+inhibition+metrics+correct+for+confounders+in+measuring+sensitivity+to+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs.</a> Nature methods. 13 (6), 521-527 (2016).</li>
<li>Yuki, K., Cheng, N., Nakano, M., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of tumor immunology.</a> Trends in Immunology. 41 (8), 652-664 (2020).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+therapeutic+impact+of+intratumor+heterogeneity+in+cancer+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution.</a> Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).</li>
<li>Rambow, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+minimal+residual+disease-directed+therapy+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Toward minimal residual disease-directed therapy in melanoma.</a> Cell. 174 (4), 843-855 (2018).</li>
<li>Marine, J. C., Dawson, S. J., Dawson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+mechanisms+of+therapeutic+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-genetic mechanisms of therapeutic resistance in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (12), 743-756 (2020).</li>
<li>Frismantas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+drug+response+profiling+detects+recurrent+sensitivity+patterns+in+drug-resistant+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ex vivo drug response profiling detects recurrent sensitivity patterns in drug-resistant acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 129 (11), 26-37 (2017).</li>
<li>Drusbosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+response+to+BET+inhibitors+using+computational+modeling%3A+A+BEAT+AML+project+study%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">Predicting response to BET inhibitors using computational modeling: A BEAT AML project study.</a> Leukemia Research. 77, 42-50 (2019).</li>
</ol>

T.G.B. הוא יועץ ל- Array Biopharma, תרופות מהפכה, נוברטיס, אסטרהזנקה, טקדה, ספרינגוורקס, תרופות ג'אז, טיפולי ממסר, טיפולי גשם, גשם טיפולי, Biosciences מנוע, ומקבל מימון מחקר מ נוברטיס, אסטרטגיה, Kinnate, ותרופות מהפכה.

כתב יד זה מפתח ומתאר פרוטוקול סטנדרטי להערכת רגישות לסמים במודלים של PDO תלת-ממדיים שמקורם ב- NSCLC. בנוסף למחקרי רגישות לתרופות, יש צורך באפיון נוסף של מודלים אורגנוידים זמינים כדי לקבוע את הסיבות הבסיסיות להבדלים ברגישות לסמים. זה עשוי לכלול פרופיל גנטי של organoids ודגימות חולים וניתוחים אחרים הזמינים עבור organoids, כגון כתמים אימונוהיסטוכימיה עבור סמני בידול וסמנים ביולוגיים איתות תאי כללי ופיזיולוגיה13,29.
שלבים קריטיים בפרוטוקול הפרוטוקול המתואר להלן מספק זרימת עבודה מתוקננת המאפשרת ניתוחים מדויקים וניתנים לשחזור של רגישות לסמים כאשר עוקבים אחריו בזהירות. יש לנקוט בזהירות מיוחדת בשלבים הבאים: עיכול טריפל ו- DNAse I במהלך הדור של השעיות תא בודד, זריעה של השעיות של תא יחיד ב- BME2, ניטור צמיחת organoid עד טיפול, שינויי מדיה, שיבוש וליזה של Organoids מוטבע BME2 במהלך קריאת הישרדות תאים מבוססי זוהר. (1) בעוד עיכול DNAse I נוסף לאחר דיסוציאציה מבוססת טריפל של organoids אינו חיוני להרחבת מודלים organoid במהלך תחזוקת תרבות סדירה, DNAse I העיכול לא צריך להיות מושמט בעת זריעה לניסויים הסלמה סמים כפי שהוא מבטיח הפרדה טובה יותר של אשכולות organoid לתוך השעיות תא יחיד וספירת תאים מדויקת. (2) זריעת השעיית תא יחיד ב- BME2 מייצגת צעד קריטי בהתחשב בהתבססות של BME2 בטמפרטורת החדר. לכן, לכל היותר 1-2 שורות צריך להיות זרע בבת אחת, ודגימות צריך להיות ממוקם על קרח לפני שורות נוספות הם זרעו. הערה, תאים צריכים להיות pipetted למעלה ולמטה כאשר זריעה ממשיכה לאפשר השעיית תא הומוגנית. (3) צמיחת Organoid צריך להיות במעקב זהיר במהלך התרחבות 7 ימים מזריעה לטיפול. דוגמה להתפתחות הצפויה ניתנת באיור 1B ובטבלה משלימה 1. שימו לב, הערכת שינויים בגודל האורגנויד על ידי מיקרוסקופיה וניתוח תמונה של ברייטפילד כפי שמוצג באיור 1B עשויה לאפשר הערכה מדויקת של ההבדלים בצמיחת האורגנויד וזמני ההכפלה. זמני הכפלה יכולים להשפיע על תגובות לסמים, כפי שנדון לאחרונה בספרות 30. אם קצב הגידול האורגנויד עולה על הדוגמה המוצגת באופן משמעותי, ניתן לשקול זמן התרחבות קצר יותר עד לתחילת הטיפול ומשך הטיפול הקצר יותר. (4) בנוסף, יש לנקוט בזהירות מיוחדת בעת שינוי מדיה כדי למנוע שאיפה organoids. מיקום הזריעה של אורגנוידים מוטבעים BME2 במיקום השעה 6 מאפשר שאיפה בטוחה של מדיה כאשר לוחות מסתובבים בכיוון השעון על ידי 180 ° ומדיה נשאפת במיקום ההפוך של organoids. (5) לבסוף, תמוגה יסודית של אורגנוידים מוטבעים BME2 במהלך קריאת ההישרדות חיונית כדי לרשום תוצאות מדויקות. על פי הוראות היצרן, דגימות צריך להיות pipetted למעלה ולמטה שוב ושוב, באופן אידיאלי באמצעות טיפים לא מסוננים, כדי להבטיח תמוגה נכונה. יש לעקוב אחר זמני הדגירה כמתואר. יתר על כן, העברת 75% של lysate (במקום את הנפח הכולל) לצלחת לבנה, אטומה תחתית 96-well עבור הקריאה הסופית באמצעות קורא צלחת ELISA מאפשר הערכה מתאימה, כמו זה מבטיח את אותו נפח בכל באר והיעדר בועות אוויר שניתן להציג על ידי צינורות נמרצים.
שימו לב, יצירת פרופילים של תגובות לסמים בתרבויות אורגנויד משובצות BME2 עשויה להראות סטיית תקן גבוהה יותר מזו שנצפתה בתרביות רגילות של קו תאים (איור 2, איור 3A). סטיית התקן הגבוהה יותר מבוססת על מספר גורמים, כולל סבירות מוגברת לשינויים מינוריים בזריעה בעת עבודה עם BME2 והבדלים בשיעורי הצמיחה האורגניים הבודדים על פני בארות במהלך תקופת הצמיחה הראשונית של 7 ימים. לכן, שווה או יותר מארבעה העתקים טכניים לכל ריכוז סמים צריך להיות זרע.
והכי חשוב, יש להעריך בקפידה את נוכחותם של תאים ממאירים הנושאים את מוטציית הנהג האונקוגנית ואת הזיהום המוגבל על ידי תאי אפיתל רגילים בדרכי הנשימה. אתגרים במפעל NSCLC יכול להעדיף את הצמיחה של תאי אפיתל דרכי הנשימה נורמלי7. העתק פרופילי מספרים או גישות מבוססות PCR ורצף כדי לאשר את נוכחותן של מוטציות הנהג האונקוגניות הן שיטות הבחירה כדי להבטיח את האיכות של תרביות אורגנויד NSCLC.
שינויים ופתרון בעיות של השיטה מדיה וגורמי גדילה בהתאמה שנוספו לפתרונות מדיה בסיסיים יכולים להשפיע באופן משמעותי על תגובת התרופה למעכבים ממוקדים. הם מפעילים קולטני מעקפים ומסלולי איתות המשפיעים ומגבילים את תגובת התרופה (למשל, FGF, HGF, EGF)26. בעוד שתקשורת עשירה ומותאמת בגורם גדילה עשויה להיות אופטימלית להרחבת תרבות האורגנויד, יש לבצע הערכות הסלמה ורגישות של תרופות במדיה מופחתת של גורם צמיחה, כפי שתואר לעיל. הדבר מבוסס על ניסיון פנימי בהשוואת ניסוחים שונים של מדיה ונתוני תגובה לתרופות (איור 3C). בעוד שפתרונות מדיה יכולים להשפיע על מידת הרגישות לטיפול תרופתי מסוים ויכולים לשנות ערכי IC50, פנוטיפים חזקים של רגישות או התנגדות נראים לכאורה ללא קשר לניסוח מדיה (איור 3C,D). בנוסף, מומלץ עקביות כללית בניסוח התקשורת ובפרופיל תגובות סמים על פני תרביות אורגנויד, ויש לזרוע סכום שווה או יותר מארבעה העתקים טכניים לריכוז. הדבר חשוב במיוחד לטווחי בחינת ביצועים ברגישות לעומת. התנגדות למעכב העניין.
מגבלות השיטה הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הרגישות של NSCLC 3D סרטן אורגנויד מודלים מעכבים ממוקדים כאשר תאים סרטניים שמקורם בחולה מתורבתים. ניסויים נוספים, כולל ניתוח פרמקודינמי לגבי עיכוב מסלול וניתוח רצף לנוכחות הנהג oncogene ומוטציות משניות, נדרשים לאפיון מפורט של עמידות לתרופות ורגישות. יתר על כן, גורמים עוברי אורח כגון גירויים מיקרו-אנירומנטליים הנגזרים מאינטראקציות או מגורמים מופרשים על ידי תאים עוברי אורח שאינם סרטניים במיקרו-סביבה של הגידול אינם נלקחים בחשבון, ויש צורך בפרוטוקולים חדשניים כאשר מנסים מודלים אורגנוידים של תרבות משותפת עם תאים חיסוניים או סטרומיים. העבודה האחרונה הדגישה את השימוש במודלים אורגנוידים כדי לשחזר אינטראקציות מיקרו-סביבה של גידולים ותגובות פרופיל למעכבי מחסום חיסוני, כגון טיפול נגד PD-L111, 13,31.
משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות/ חלופיות מודלים אורגנויד סרטן 3D לשחזר את המגוון הגנטי ואת דטרמיננטים של תגובת הטיפול נוכח הגידול המקורי4,5,6. ראוי לציין, הטרוגניות מרחבית וטמפורלית יכולה לקדם את התפתחות הגידול, והופעה מקבילה והתפתחות רציפה של תת-שכבות הגידול יכולות להתרחש 32,33. הטרוגניות תוך-אטומית משמעותית לבחירה של תאים סרטניים עמידים יותר תחת לחץ טיפולי9,34,35. הפרוטוקול המסופק כאן מאפשר הערכה מהירה של רגישויות לטיפול במעכבים ממוקדים בדגימות בקרבת מטופלים. לפיכך, למודלים אורגנוידים יש יתרונות על פני מודלים קונבנציונליים יותר של קו תאים הומוגניים חסרי מגוון גנטי או מחקרים ארוכי טווח באמצעות קווי תאים או קסנוגרפטים שמקורם במטופל. יתר על כן, הפרוטוקול הנוכחי מאפשר הגדלה של עד זרועות מרובות של גישות טיפול וטיפול משולב עם מגבלות מעטות לגבי עלות ויכולת אנליטית. ככזה, הוספת תרופה שנייה של עניין במינון קבוע תוך הסלמת המעכב הממוקד בעיקר והשוואתו להסלמה של המעכב הממוקד בעיקר לבדו מאפשרת להעריך ביעילות את ההשפעות הקומבינטוריות הפוטנציאליות ועם מינימום ביומסה נוספת הנדרשת (איור משלים 3). בהשוואה להערכות מבוססות הדמיה המשמשות לניטור התפתחות אורגנויד ותגובה לתרופות, בדיקת ההישרדות של התאים המבוססת על אור המתוארת כאן יש רגישות דומה עם ציוד מינימלי והכשרה הנדרשים.
חשיבות ויישומים פוטנציאליים של השיטה בתחומי מחקר ספציפיים פיתוח צינור מתוקנן המאפשר להקים מודלים אורגנוידים של סרטן מדגימות מטופלים ופרופיל הרגישויות לתרופות הבאות טומן בחובו פוטנציאל ישימות קליני משמעותי. פרופיל פרמקולוגי Ex vivo זכה להכרה באיתור נקודות תורפה ותכונות הקשורות עמידות בגידולים, בקורלציה לתגובת הטיפול בחולים36,37. באופן משמעותי, פרופיל ex vivo של רגישויות לתרופות עשוי לסייע בבחירת הטיפול במרפאה ובתכנון טיפולים משולבים רציונליים המטפלים במנגנוני התנגדות. בסך הכל, גישה זו יכולה לעזור לאפשר אסטרטגיות מותאמות אישית משופרות לטיפול מולקולרי או משטרי טיפול קומבינטורי. זה האחרון עשוי לעזור למקד סובלנות סמים ומנגנוני התנגדות מוקדם ולהעמיק את התגובה הקלינית כדי לשפר את תוצאות המטופל בעתיד.

טיפולים מותאמים אישית נגד נהגים אונקוגניים חוללו מהפכה בטיפול בסרטן, שיפרו את הישרדות המטופלים וצמצמו את תופעות הלוואי בתיווך הטיפול1. ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיות אבחון וריצוף מולקולריות הדגישו את המורכבות של גידולים אנושיים, עם הטרוגניות מרחבית וטמפורלית המשפיעה על תגובת הטיפול2. סיכום מחדש של הבדלים תת-מחלקתיים אלה במודלים של תרביות תאים הוגבל זה מכבר לחקירת שינויים נבחרים בעלי עניין בשורות תא אחידות אחרות. מודלי PDO תלת-ממדיים שפותחו לאחרונה שנוצרו מביופסיות גידול או כריתות גידול כירורגיות מאפשרים ייצוג משופר של מורכבות תאית ואיתות על דיבור צולב בתוך רקמת הגידול שמקורה במטופל3. ככזה, organoids הגידול נגזר סרטן מערכת העיכול והלבלב נוצרו בהצלחה לשחזר את המגוון הגנטי ואת דטרמיננטים של תגובת הטיפול4,5,6. בסרטן ריאות תאים לא קטנים (NSCLC), פיתוח organoid ואתגרי הקמה מוכרים, ואופטימיזציה של טכניקות תרבות וגורמי מדיה סלקטיביים נדרש כדי לאפשר שימוש רחב יותר ושיטתי יותר של PDOs NSCLC בעתיד7,8.
פיתוח טיפולים קומבינטוריים המתמקדים באריות תאים סרטניים העומדים בפני טיפול תרופתי ראשוני חיוני כדי לעכב התפתחות התנגדות ובסופו של דבר לשפר את הישרדות המטופל9. בהתחשב במורכבות האדריכלית של תרביות אורגנויד, יש לייעל את הפרמטרים של תגובת התרופה הקלאסית כדי לאפשר בדיקה מדויקת וניתנת לשחזור של רגישויות לסמים. קריאות מבוססות הדמיה10,11 ובדיקות כדאיות תאים קלאסיות למדידת שפע ATP תאי6,12, בין טכניקות אחרות, זמינות לתגובות סמים פרופיל בתרביות PDO. כאן, אנו מפתחים ומתארים פרוטוקול מתוקנן להערכת רגישויות לתרופות לטיפול ממוקד נגד נהגים קליניים ידועים במודלים של NSCLC PDO.

<table><tbody><tr><td>צינורות 1.5 מ"ל</td> צינורות צנטריפוגה <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל</td> 500 מ"ל מסנן ואקום/מערכת בקבוקי אחסון, 0.2 ומיקרו;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> m נקבוביות 33.2 ס"מ2</td><td>430773 קורנינג</td><td></td> ממברנה <td>ניילון לשתי המדיה</td></tr><tr><td>96 באר, מטופל בתרבית תאים, שטוח שקוף תחתון שחור מיקרופלייט</td><td>קורנינג</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>96 באר, מטופל בתרבית תאים, לבן מוצק שטוח מיקרופלייט תחתון</td><td>שטוח 3917</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-8301</td><td>Tocris Bioscience</td><td>293910</td><td>לשתי המדיה</td></tr><tr><td>מתקדם DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>עבור LGM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>עבור שתי המדיה</td></tr><tr><td>BioRender 2021</td><td>https://biorender.com/</td><td></td> <td>תוכנת איור מדעי מקוונת</td></tr><tr><td>BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2)</td><td>R& D Systems</td><td>353301002</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור תרביות תאים (37 & deg; C, 5% CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo בדיקת כדאיות תאים תלת מימדית</td><td>Promega</td><td>G9682</td><td>3D-CTG צנטריפוגה</td></tr><tr><td>המחזיקה 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNAse I)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>MT21031CV</td><td>תמיסת מלח חוצץ פוספט של Dulbecco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, תוסף GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>עבור GM</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>עבור תוכנת LGM</td></tr><tr><td>GraphPad Prism (גרסה 9.2.0)</td><td>תוכנת ניתוח סטטיסטי</td> <td>GraphPad</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>לשני המדיה</td></tr><tr><td>hFGF-10</td><td>PeproTech</td><td>100-26-100ug</td><td>עבור GM</td></tr><tr><td>hFGF-7</td><td>PeproTech</td><td>100-19-50ug</td><td>עבור GM</td></tr><tr><td>hNoggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C-100ug</td><td>עבור שני המדיה</td></tr><tr><td>hRspondin</td><td>PeproTech</td><td>120-38-100ug</td><td>עבור GM</td></tr><tr><td>קצות פיפטה שמירה נמוכים, 20 ומיקרו; L (P20)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2149P-05-HR</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה עם שמירה נמוכה, 200 ומיקרו; L (P200)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>2069-05-HR</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה באורך רגיל, 1000 ומיקרו; L (P1000)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>2179-HR</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>רב ערוצית</tr><tr><td>N-אצטילציסטאין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-424-777</td><td>לשתי המדיה</td></tr><tr><td>ניקוטינמיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>N0636-100G</td><td>לשתי המדיה</td></tr><tr><td>Osimertinib</td><td>Selleck Checm</td><td>S7297</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>עבור LGM</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SV30010</td><td>עבור</td></tr><tr><td>פיפטות GM (גדלים שונים)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>קורא צלחות</td><td>מכשירים מולקולריים</td> ציוד <td>SpectraMax M5</td><td>, ניתן להשתמש בקוראים חלופיים</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>עבור GM</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Selleck Chem</td><td>S1077</td><td>עבור GM</td></tr><tr><td>TrypLE אקספרס אנזים</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום וצינורות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL XR מנתח תאים</td><td>בקמן קולטר</td><td>Vi-CELL XR</td><td>מנתח תאים / מונה</td></tr></tbody></table>

רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-egfr-mutant nsclc

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

תרבויות אורגנויד חדשניות של סרטן תלת-ממדיות הנגזרות מדגימות של מטופלים קליניים מייצגות מערכת מודל חשובה להערכת הטרוגניות תוך-אטומית ותגובת טיפול למעכבים ממוקדים בסרטן. עבודה חלוצית בסרטן מערכת העיכול והלבלב הדגישה את ההבטחה של אורגנוידים שמקורם במטופלים (PDOs) כמערכת תרבות קרובה למטופל, עם מספר גדל והולך של מודלים המתעוררים. באופן דומה, העבודה בסוגי סרטן אחרים התמקדה בהקמת מודלים אורגנוידים ואופטימיזציה של פרוטוקולי תרבות. ראוי לציין, מודלים אורגנויד סרטן 3D לשמור על המורכבות הגנטית של דגימות הגידול המקורי ובכך לתרגם נתוני רצף שמקורם בגידול לטיפול עם טיפולים ממוקדים מושכלים גנטית בסביבה ניסיונית. יתר על כן, PDOs עשוי לטפח את ההערכה של טיפולים משולבים רציונליים כדי להתגבר על הסתגלות הקשורה להתנגדות של גידולים בעתיד. זה האחרון מתמקד במאמצי מחקר אינטנסיביים בסרטן ריאות שאינו תאים קטנים (NSCLC), כמו פיתוח התנגדות בסופו של דבר מגביל את הצלחת הטיפול של מעכבים ממוקדים. הערכה מוקדמת של מנגנונים הניתנים למיקוד טיפולי באמצעות PDOs NSCLC יכולה לעזור ליידע טיפולים משולבים רציונליים. כתב יד זה מתאר פרוטוקול סטנדרטי להערכה מבוססת לוחית של תרבית התאים של רגישויות לתרופות למעכבים ממוקדים ב- PDOs תלת-ממדיים שמקורם ב- NSCLC, עם יכולת הסתגלות פוטנציאלית לטיפולים משולבים ושיטות טיפול אחרות.

אתגרים ניכרים בהקמת אורגנוידים של NSCLC נרשמו7. לכן, זה מרגש לראות את העבודה האחרונה הקמת organoids סרטן ריאות ושימוש בהם לטיפול תרופתי assays20,21,22. מוטציות EGFR אחראיות ל-11.3% ממקרי NSCLC23. טיפול ממוקד במעכבי EGFR מייצג את אפשרות הטיפול בקו הראשון ב- NSCLC מוטציה EGFR ושיפר את בטיחות ההישרדות והטיפול הכוללת בחולים24. עבודה זו קבעה את הרגישות מעכבי טירוזין קינאז EGFR שאושרו על ידי ה-FDA אוסימרטיניב24,25 באורגנוידים NSCLC מוטציה EGFR. אורגנוידים NSCLC מוטציה EGFR נוצרו כריתה כירורגית או דגימות ביופסיה גידול של חולי NSCLC ואושרו מחסה מוטציה oncogenic המצוין על ידי ריצוף DNA. כפי שתואר לעיל, מודלים organoid NSCLC מוטציה EGFR טופלו עם מינונים הסלמה של osimertinib ו PDO הכדאיות מוערך על ידי קריאת הישרדות תאים מבוססי אור חמישה ימים לאחר תחילת הטיפול. בעוד מוטציה EGFR (EGFRdel19)-חיובי TH107 organoids הראו רגישות לטיפול osimertinib עם ריכוז מעכב חצי מקסימלי (IC50) של 56 nM (איור 2A), EGFR-מוטציה (EGFRL858R)-חיובי TH116 organoids היו עמידים לטיפול osimertinib עם IC50 של יותר מ 1 מיקרומטר (איור 2B). הרגישות של EGFRdel19-חיובי TH107 NSCLC לוותה בשינויים משמעותיים בתעתיק, כולל ירידה בביטוי חתימות גנים הקשורות למחזור התאים ועלייה בביטוי חתימות גנים הקשורות לאפופטוזיס (איור משלים 2A,B). כהפניה, מוצגים נתוני תגובה עבור קו התאים הרגיש של NSCLC PCLC החיובי ל-EGFRdel19 (איור 3A, B). האחרון כולל ניתוח הישרדות למינונים מסלימים של אוסימרטיניב על ידי בדיקת הישרדות דו-ממדית מבוססת אור (איור 3A) וחקר דיכוי איתותים ברמה של איתות EGFR-MAPK על ידי כתם מערבי (איור 3B). בסך הכל, נתונים אלה מדגישים את הדיוק של הפרוטוקול הנוכחי לקביעת תגובת התרופה והבחנה בין מודלים רגישים ועמידים ל- NSCLC PDO. ניתוחים נוספים של EGFRL858R חיובי TH116 organoid ודגימות קליניות זמינות נדרשים כדי לקבוע שינויים אפשריים הקשורים להתנגדות.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig02.jpg"> איור 2: עקומת תגובת הטיפול של מודלים אורגנודיים NSCLC מוטנטיים של EGFR להסלמה אוסימרטיניב. (A) תגובת אוסימרטיניב במודל האורגנויד הרגיש של EGFRdel19 חיובי TH107 NSCLC. (B) תגובת אוסימרטיניב בדגם האורגנויד העמיד EGFRL858R חיובי TH116 NSCLC. נקודות נתונים מוצגות כערכים מנורמלים המציגים את סטיית התקן הממוצעת +/- , עם עקומת רגרסיה לא ליניארית המותקנת בנתונים. TH107, n = 6 עותקים משוכפלים טכניים לכל נקודת נתונים. TH116, n = 4 עותקים משוכפלים טכניים לכל נקודת נתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig03.jpg"> איור 3: נתונים השוואתיים לתגובת הטיפול לאוסימרטיניב בקו תאים רגיש של NSCLC מוטציה מסוג EGFR ומודלים אורגנוידים המתרבים במדיה שונה. (A) תגובת אוסימרטיניב בקו התא הרגיש של EGFRdel19-חיובי NSCLC PC9, שנקבע על ידי בדיקת 2D-CTG סטנדרטית. (B) איתות דיכוי בתאי PC9 על טיפול של יומיים עם osimertinib (2 מיקרומטר). (ג) תגובת אוסימרטיניב בתרבות הדגם האורגנודית הרגישה של EGFRL858R חיובית TH330 NSCLC במדיה של LGM ו- GM. (ד) תגובת Osimertinib במודל האורגנויד AZ021 NSCLC העמיד במדיה LGM ו- GM. אישור המוטציה האונקוגנית EGFRL858R ב- AZ021 נכשל ועשוי להיות סיבתי להיעדר תגובת אוסימרטיניב. עבור A ו- C-D, נקודות נתונים מוצגות כערכים מנורמלים המציגים את סטיית התקן הממוצעת +/- , עם עקומת רגרסיה לא ליניארית המותקנת בנתונים. PC9, n = 3 שכפולים טכניים לכל נקודת נתונים. TH330, n = 5 עותקים משוכפלים טכניים לכל נקודת נתונים. AZ021, n = 6 עותקים משוכפלים טכניים לכל נקודת נתונים. בדיקת דירוג וילקוקסון בוצעה על נתונים מנורמלים כדי לקבוע את המשמעות הסטטיסטית. עבור TH330 (C), LGM לעומת GM, ** p = 0.0078. עבור AZ021 (D), LGM לעומת GM, ns p = 0.0742. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: תוצאות מנתח תאים מייצגות לספירה והערכת כדאיות של מודלים אורגנויד מוטנטיים של EGFR. TH107 ו- TH107BC מתייחסים למודלים אורגנוידים שונים ו- A ו- B לשכפולים ביולוגיים. עבור כל דגם ושכפול ביולוגי, נספרים שלושה עותקים משוכפלים טכניים; כולם מראים ≥95% כדאיות. תמונה מייצגת במהלך ספירת תאים מוצגת מימין, ומציגה כדאיות חזקה וניתוק של תא יחיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig1-R2.pdf" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 2: ניתוח העשרה מוגדר גנים (GSEA) באמצעות נתוני ריצוף RNA בתפזורת שהתקבלו עבור אורגנוידים TH107 NSCLC מוטנטיים EGFR, השוואת שליטה לא מטופלת (DMSO) ותאים שטופלו ב- Osimertinib במשך 3 ימים (OSI_D3). (א-ב) לאחר טיפול ממוקד, תאים רגישים יעברו מעצר G1 מחזור התא ולהפסיק התפשטות פעילה. כביטוי של גנים מחזור התא G2M קשורה להתפשטות פעילה, העשרה נומינלית של ביטוי בפקד לא מטופל (DMSO) צפוי. עבור גנים הקשורים לאפופטוזיס, צפויה העשרה נומינלית בתאים שטופלו (OSI_D3). שניהם אושרו במודל האורגנויד TH107 NSCLC מוטציה EGFR שטופלו ב- Osimertinib: (A) GSEA עבור חתימת הביטוי הולמרק G2M (משמאל) מראה העשרה בתאים שטופלו ב- DMSO. ציון העשרה נומינלי (NES): +1.708, רוזוולט &lt; 0.0001. (B) GSEA עבור חתימת הביטוי של הולמרק אפופטוזיס (מימין) מראה העשרה בתאים שטופלו באוסימרטיניב. נס: -1.075, רוזוולט: ns, 0.3275. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig2-R2.pdf" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 3: טיפול תרופתי קומבינטורי במודל האורגנויד TH330 מוטציה EGFR שטופלו בהסלמה של אוסימרטיניב בנוכחות מעכב תוסף שני בריכוז קבוע. שינויים הקשורים להתנגדות ב- NSCLC מוטציה EGFR, כלומר, הפעלת SRC ו- AXL26,27,28, היו תרופתיים ממוקדים על ידי טיפול קומבינטורי עם מעכב SRC Saracatinib (100 nM) או מעכב AXL R428 (500 ננומטר), n = 6 שכפולים טכניים לכל נקודת נתונים. שני הטיפולים הקומבינטוריים הביאו לתגובת טיפול מוגברת, עם משמעות לשילוב של אוסימרטיניב עם מעכב SRC Saracatinib. מובהקות סטטיסטית הוערכה על ידי מבחן הדירוג של וילקוקסון: אוסימרטיניב לעומת אוסימרטיניב + סרקטיניב, *p = 0.0195; אוסימרטיניב נגד Osimertinib + R428, ns, p = 0.2500. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig3-R2.pdf" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 1: שינוי גודל האורגנויד מזריעה (d0) ל-7 ימים לאחר הטיפול (d7). (A) התפתחות צמיחה ב EGFRdel19 חיובי NSCLC organoid TH107. (B) התפתחות צמיחה EGFRL858R חיובי NSCLC organoid TH330. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

פרוטוקול זה מתאר הערכה מתוקננת של רגישויות לתרופות למעכבי איתות ממוקדים במודלים אורגנויד שמקורם בחולה NSCLC.

רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-EGFR-Mutant NSCLC

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שעבודה מוצלחת עם organoids טמונה בפרטים, ולתחום חסרים פרוטוקולים מפורטים ברורים שאחרים יכולים לבנות מהם. היתרון הגדול ביותר של טכניקה זו הוא ציר הזמן, דרישות הביומסה הנמוכות והמדרגיות בעלות נמוכה. בעוד הרבה יותר עבודה נדרשת, טכניקה זו יכולה לעזור לשפר את הטיפול בסרטן ריאות על ידי מתן אפשרות לבדיקה של טיפולים אישיים או משולבים מדויקים יותר שניתן לתרגם קלינית.האתגר הגדול ביותר הוא עם טיפול BME2, הידוע בכינויו מטריגל. אני ממליץ בחום לתרגל צנרת וטיפול BME2 נוזלי לפני הצגת organoids היקר שלך. התחל על ידי ניתוק תרבות האורגנויד BME2 שקועה על ידי שאיפה קפדנית של התקשורת מלוחות התרבות הימנעות מלגעת בתרבות.טריפסינים את תרבית האורגנויד BME2 השקועה עם אנזים רקומביננטי מתאים על ידי הוספת שני מיליליטרים של אנזים רקומביננטי לבאר בצלחת שש בארות. באופן מכני לשבור את BME2 על ידי צנרת שוב ושוב למעלה ולמטה ודגור לוחות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבית התא במשך חמש דקות. בסוף הדגירה, להעביר את ההשעיה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 600 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לשאוף את האנזים רקומביננטי supernatant בזהירות מבלי לגעת גלולה organoid ו resuspend גלולה organoid במדיום הצמיחה. לאחר הוספת DNase 1, לדגור על ההשעיה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר וצנטריפוגה ב 600 פעמים G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. להשליך את התקשורת בזהירות מבלי לגעת גלולה organoid ו resuspend את הכדור במדיום צמיחה טרי.מחממים מראש צלחת שחורה חדשה וברורה 96 היטב ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבית התא במשך 10 דקות, ולאחר מכן להכין השעיית תא PBS לספור את התאים באמצעות מנתח תאים. לאחר חישוב נפח ההשעיה של התא הנדרש לניסוי, יש לצטט את התאים מהשעיה של תא יחיד ולגלגל כלפי מטה על ידי צנטריפוגה כפי שהוכח בעבר. לאחר שהמדיה נמחקת, שמור את התאים על הקרח למשך כדקה אחת לפני השימוש החוזר ב- BME2.הטה את לוחית התחתית השחורה השקוףה 96 היטב לכיוון הגוף וזרע חמישה מיקרוליטרים של השעיית תאים לבאר, ולאחר מכן זריעת כיפות התאים במיקום השעה שש של הבאר. מלאו את הבארות החיצוניות בשולי צלחת הבאר 96 עם PBS וזרעו את כיפות התאים בבארות הפנימיות הנותרות. דגירה כיפות תא זרע טרי בקפוצ'ון זרימה למינארי תרבית התא במשך חמש דקות מבלי להזיז את הצלחת, ולאחר מכן להעביר את הצלחת לחממה תרבית התא לדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.הוסף בזהירות 100 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה לבאר לכל בארות המכילות אורגנוידים ו -100 מיקרוליטרים של PBS לבארות החיצוניות בשולי הצלחת. תרבות האורגנוידים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים, שינוי מדיה לפי ההוראות המוזכרות בכתב היד הטקסט, בדיקת הצמיחה של organoids תחת מיקרוסקופ האור באופן קבוע. הכן דילול תרופה סדרתית במדיה גורם גדילה נמוכה עבור osimertinib לטיפול EGFR מוטציה nonsmall תאים סרטן ריאות organoids.כלול שליטה שלילית על-ידי הוספת מדיה של גורם צמיחה נמוך ו- 0.1%DMSO. סובב את לוח האורגנויד בכיוון השעון ב-180 מעלות, כך שהאורגנואידים נמצאים כעת במיקום של השעה 12 ושואפים בזהירות את מדיית הצמיחה באמצעות מנגנון רב-ערוצי רצוי. הוסף 100 מיקרוליטרים של שליטה או פתרון תרופתי לבאר.הדגירה טיפלה באורגנוידים שוב ב-37 מעלות צלזיוס בחממה של תרבית התא במשך חמישה ימים. התחל לבצע את בדיקת ההישרדות על ידי הפשרת ריאגנט בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. שיווי משקל הריאגנט באמבט מים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לפני השימוש ומערבבים על ידי היפוך.מוסיפים 100 מיקרוליטרים של הריאגנט לכל באר ומערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה עם קצה פיפטה להציב במיקום של כיפת organoid. דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר כ 150 microliters של lysate לצלחת 96 תחתון לבן חדש 96 היטב ולאחר מכן לדגור על הצלחת במשך 25 דקות נוספות בטמפרטורת החדר בחושך.הקלט אור באמצעות קורא לוחות ELISA. שמור נתונים בתבנית טבלת נתונים מתאימה המכילה את כל הקריאות וההקלטות הגולמיות של פריסת הלוח והתרופות המשמשות. האורגנוידים החיוביים TH107 מוטציה EGFR הראו רגישות לטיפול osimertinib עם ריכוז מעכבות מקסימלי למחצה של 56 ננומולר ואילו EGFR-מוטציה חיובית TH116 organoids היו עמידים לטיפול osimertinib עם ריכוז מעכבות מקסימלי למחצה של גדול ממיקרומולר אחד.הרגישות של תאי סרטן ריאות מסוג TH107 שאינם תאי EGFR חיוביים ל-TH107 לוותה בשינויים משמעותיים בתעתיק, כולל ירידה בביטוי חתימות הגנים הקשורות למחזור התאים ועלייה בביטוי חתימת הגנים הקשורה לאפופטוזיס. התגובה של TH330 חיובי EGFR-מוטציה רגישה למעכבים ממוקדים מושפעת באופן משמעותי בתקשורת הצמיחה לעומת מדיה גורם צמיחה נמוכה. טיפולים קומבינטוריים ב-TH330 חיובי EGFR-מוטציה הביא לתגובה טיפולית מוגברת.גישה זו משפרת אסטרטגיות מותאמות אישית לטיפול מולקולרי או משטרי טיפול קומבינטוריים. זה האחרון מסייע למקד סובלנות סמים ומנגנוני התנגדות מוקדם כדי להעמיק את התגובה הקלינית ולשפר את תוצאות המטופל.

profiling-sensitivity-to-targeted-therapies-egfr-mutant-nsclc-patient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מוצג כאן הוא פרוטוקול כדי ללמוד תגובות תרופתי ב אפיתל הערמונית אורגנואידים. אורגנואידים דומה מאוד בביולוגיה vivo וגנטיקה של החולה המטופל, מה שהופך אותם מערכות מודל אטרקטיבי. אורגנואידים הערמונית ניתן להקים מתוך prostates מודלים העכבר מהונדסים גנטית, רקמת האדם שפיר, וסרטן הערמונית מתקדם.

הערמונית תרבויות אורגאיד כמו כלים לתרגם גנוטיפים ופרופילים מוטים לתגובות תרופתי

שיטה מתוארת כדי ליצור אורגנואידים באמצעות קסנוגרפטים שמקורם בחולה (PDX) עבור הקרנת במבחנה, וכתוצאה מכך זוגות תואמים של מודלים in vivo / in vitro. גידולי PDX נקצרו/ עובדו לחתיכות קטנות באופן מכני או אנזימטי, ואחריו השיטה של החכמים לגדל אורגנואידים גידולים שהיו מעבר, cryopreserved ומאופיין נגד PDX המקורי.

יצירת זוגות מודלים תואמים של PDX ו-PDX לחקר פרמקולוגיה של סרטן

מערכת בדיקת תפוקה גבוהה במבחנה פותחה להערכת תרופות נגד סרטן באמצעות אורגנוידים של גידול שמקורם במטופל (PDOs), בדומה לרקמות סרטן אך אינן מתאימות למערכות במבחנה עם 96-well ו-384-well.

תפוקה גבוהה במבחנה במבחנה באמצעות organoids גידול נגזר המטופל

פרוטוקול זה מתאר שיטה אוטומטית למחצה לבדיקות סמים אורגנואידיות בתפוקה בינונית עד גבוהה ותוכנת ניתוח תמונה אוטומטית אגנוסטית למיקרוסקופ לכימות ולהמחשה של תגובות תרופתיות רב-פרמטריות בעלות אורגנואיד יחיד ללכידת הטרוגניות תוך-גופית.

בדיקת תרופות אורגנואידיות של גידולים רב-פרמטריים באמצעות הדמיית תאים חיים של Widefield לניתוח בתפזורת ואורגנואיד יחיד

פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים ליצירה ולאפיון אורגנואידים תלת-ממדיים אוראליים-ושטיים המייצגים נגעים נורמליים, פרה-נאופלסטיים ונגעי קרצינומה של תאי קשקש הנגרמים באמצעות קרצינוגנזה כימית.

מידול קרצינומה של תאי קשקש אוראליים-ושטיים באורגנואידים תלת-ממדיים

העלייה של סמנים ביולוגיים מולקולריים להיבדק עבור סרטן ריאה לא קשקשי של תאים לא קטנים (NS-NSCLC) ניהול הטיפול הניע את הפיתוח של שיטות זיהוי מולקולרי מהיר ואמין. אנו מתארים זרימת עבודה להערכת שינויים גנומיים עבור חולי NS-NSCLC באמצעות גישת ריצוף הדור הבא (NGS) מהירה במיוחד.

ריצוף הדור הבא מבוסס אמפליקון מהיר במיוחד בסרטן ריאות של תאים לא קטנים שאינם קשקשיים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מקיף לייצור ושימוש באורגנואידים של גליובלסטומה מהונדסים במעבדה (LEGO) כדי לחקור תלות גנוטיפ-פנוטיפ ולסנן תרופות פוטנציאליות לטיפול בגליובלסטומה.

תרבית אורגנואידים של גליובלסטומה מהונדסת במעבדה וסינון תרופות

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ליצירת אורגנואידים של קרצינומה כבדית, יישום טיפול תרופתי וביצוע ריצוף RNA חד-תאי לפני ואחרי הטיפול לאפיון שינויים שעתוקיים הקשורים לטיפול.

יצירה וניתוח טרנסקריפטומי חד-תאי של אורגנואידים של קרצינומה כבדית לאחר טיפול תרופתי

ניצול גידולים שמקורם המטופל במודל פרה-קליני תת עורית הוא דרך מצוינת ללמוד את היעילות של טיפולים חדשניים, גילוי סמן ביולוגי חזוי, ושבילי סמים עמידים. מודל זה, בתהליך פיתוח התרופות, יש חשיבות רבה לקביעת גורלו של טיפולים חדשניים נגד סרטן רבים לפני למחקר קליני.

פיתוח ותחזוקה של גידול נגזר החולה פרה xenograft דגם לחקירת Novel טיפולים נגד סרטן

פרוטוקול הבאים מתמקד הקמת תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה (STS). מודל זה יכול לעזור לנו להבין טוב יותר את רקע מולקולרי ופרופיל תרופתי של ממאירות נדירים אלה, שעשוי לייצג נקודת התחלה עבור מחקרי המשך שמטרתם לשפר את ניהול STS.

הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה

למדו פרוטוקול להערכת רגישות לתרופות באורגנואידים מסרטן ריאה NSCLC עם מוטציות EGFR. השיטה משתמשת באוסימרטיניב ובדיקת ניידות תאים לפיתוח טיפולים מותאמים אישית.

רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-EGFR-Mutant NSCLC

גלה סרטונים נוספים