הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי

במהלך המטופויזיס, תאי גזע המטופויאטיים עוברים מעבר מטבולי מגליקוליזה לזרחון חמצוני. פרוטוקול זה יכול לשמש להערכת תפקודים גליקוליטיים ומיטוכונדריים של גזע המטופויאטי של עכבר ותאי אב. שיטה זו יכולה לשמש להערכת ביו-אנרגיה תאית בזמן אמת.

הפלטפורמה מבוססת המיקרו-פלטה בעלת 96 הבאר מציעה כימות תפוקה גבוה עם רגישות גבוהה, ומאפשרת ניתוח סימולטני של דגימות מרובות באמצעות לוח יחיד. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את ההשפעות של כימיקלים או מניפולציות גנטיות על חילוף החומרים HSC בתנאים מגוונים. זה יכול לעזור להבהיר מסלולים מטבוליים המקיימים פלוריפוטנטיות HSC.

למרות שהמחקר הנוכחי מתמקד בעיקר בגבעולים המטופויאטיים של עכברים ובתאי אב, ניתן היה להתאים את הפרוטוקול ואת הגישה הזו בקלות כדי לייעל את תנאי הניתוח עבור כל סוג של תאי השעיה. יום אחד לפני הבדיקה, פתחו את ערכת בדיקת השטף החוץ-תאית כדי להסיר את מחסנית החיישן ואת מכלול לוח השירות. שמור את דירות מדריך הטעינה לשימוש למחרת.

כעת הפרד ידנית את מחסנית החיישן מלוח השירות והניח אותה במהופך ליד לוח השירות. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, מלאו כל באר של לוחית השירות ב-200 מיקרוליטרים של קליבנט הכלולים בערכת בדיקת השטף, ואז הניחו את מחסנית החיישן בחזרה על לוחית השירות, והקפידו להטביע לחלוטין את החיישנים בקליברנט. לאחר מכן דגרו את לוחית השירות עם קליברנט ומחסנית חיישנים מורכבת בחממה שאינה פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה בעקבות תנאי הלחות המוזכרים בכתב היד.

ביום הבדיקה, הכינו 2.5 מיליליטרים של תמיסת דבק התא לכל מיקרו-לוחית תרבית תאים של 96 בארות, כמתואר בכתב היד של הטקסט. פתחו את המיקרו-פלטה של תרבית התאים בת 96 הקידוחים הכלולה בערכת בדיקת השטף ופיצו 25 מיקרוליטרים של תמיסת דבק התא המוכנה בתחתית כל באר. מכסים את המיקרו-פלטה במכסה ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתוך מכסה המנוע.

לאחר הדגירה, מסירים ומשליכים את תמיסת דבק התא העודפת באמצעות פיפטה רב-ערוצית או אשורטור ושוטפים כל באר פעמיים עם 200 מיקרוליטרים של מים אולטרה-פוריים סטריליים. יש לייבש את הצלחת באוויר ללא המכסה בתוך מכסה המנוע למשך 30 עד 45 דקות. צנטריפוגה שושלת העכברים המוכנה שלילית HSPCs ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר השלכת הסופרנטנט, יש לבצע החייאה של כדורי התא בתווך הבדיקה המתאים, ושוב לבצע צנטריפוגה בתרחיף התא. חזור על הליך זה פעם נוספת והחזיר את התאים במדיום הבדיקה המחומם המתאים לריכוז של 250, 000 תאים לכל 50 מיקרוליטרים או חמישה מיליון תאים למיליליטר. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 50 מיקרוליטרים של תרחיף התא לאורך הצד של כל באר של דבק התא המצופה במיקרו-פלטה של תרבית תאים 96 בארות, ולאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטרים של מדיום הבדיקה לבארות מדידת הרקע הפינתיות.

צור לוחית איזון צנטריפוגה על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של מים לכל באר של מיקרו-פלטה של תרבית תאים שאינה מצופה בת 96 בארות. צנטריפוגה של התאים ב-200 פעמים G למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. דגירה של הצלחת באינקובטור שאינו פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 25 עד 30 דקות לחיבור התא.

לאחר 30 דקות, ודא חזותית תחת מיקרוסקופ שהתאים נדבקים ביציבות למשטח המיקרו-לוחית. התחילו בהכנת כל הפתרונות הנדרשים במדיום בדיקת הלחץ של הגליקוליזה שחוממה מראש, כפי שצוין בכתב היד של הטקסט, והסירו את מחסנית החיישן המיובשת מהאינקובטור. הרם את מחסנית החיישן מהקליברנט והחלף אותה על אותה צלחת שירות עם הקליברנט כדי להסיר את בועות האוויר.

מקם את מדריך הטעינה 80 שטוח בחלק העליון של מחסנית החיישן המכוונת אותו כך שהאות A תמוקם בפינה השמאלית העליונה. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוציאו 20 מיקרוליטרים של תמיסת גלוקוז 100 מילימולרית ביציאה A.החליפו את מדריך ההעמסה של 80 שטוח במדריך הטעינה של BC שטוח, תוך כיוון האות B בפינה השמאלית העליונה. מחלקים 22 מיקרוליטרים של 20 תמיסת אוליגומיצין מיקרומולרית ביציאה B.כוונו מחדש את מדריך הטעינה של BC שטוח כדי לאתר את האות C בפינה השמאלית העליונה לטעינת יציאה C ופיק 25 מיקרוליטרים של 500 תמיסת 2-deoxy-d-glucose של מילימולאר ביציאה C.לאחר מכן הסר והשלך את משטחי מדריך הטעינה.

כעת צור או טען את התבנית לבדיקת הלחץ של הגליקוליזה בבקר. הזן את הפרטים לגבי אסטרטגיות הזרקה, מצבי טיפול וסוגי תאים, ולחץ על צור קבוצות. עבור אל מפת הצלחת והקצה בארות לכל קבוצה לניתוח.

בפרוטוקול, ודא כי הכיול ושיווי המשקל נבדקים בשלב האתחול. עבור המדידה והמדידות הבסיסיות לאחר כל הזרקה, הגדר את מספר מחזורי המדידה לשלושה וערבב, המתן, מדוד פעמים לשלוש דקות, אפס דקות, שלוש דקות. לחץ על התחל הפעלה בתוכנה.

הסר את המכסה ממחסנית החיישן הטעונה והלחה של התרכובות והניח אותה על מגש העבודה של מנתח השטף החוץ-תאי. התחל את ריצת הכיול. מוציאים את המיקרו-פלטה המכילה את התאים הזורעים מהאינקובטור.

מבלי להפריע לתאים, הוסיפו באיטיות 130 מיקרוליטרים של מדיום בדיקת הלחץ של הגליקוליזה שחוממה מראש כדי להרכיב את הנפח הבינוני בכל באר ל-180 מיקרוליטרים ולהחזיר את הצלחת לחממה למשך 15 עד 20 דקות נוספות. לחץ על פתח מגש בתוכנה כדי לפתוח את המגש התרמי של סוסון ים. לאחר סיום הכיול, החלף את לוחית השירות במיקרו-לוחית בדיקה זו המכילה את התאים ולחץ על לוח תא העומס כדי להתחיל את המדידות.

לאחר סיום המדידות, הסירו את מדיום הבדיקה מהצלחת מבלי להפריע לתאים ושטפו אותם בעדינות עם 250 מיקרוליטרים של מלוחים מחוטי פוספט מבלי לנתק את התאים. כעת מוסיפים לכל באר 10 מיקרוליטרים של חיץ ליזה רדיו-אימונופרציפציה בתוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז 1X ומתסיסים את הצלחת על שייקר למשך 10 דקות. להקפיא את כל הצלחת במינוס 80 מעלות צלזיוס.

להפשיר את הצלחת ולבצע בדיקת מדידת חלבון לצורך נורמליזציה של נתונים בהתאם להוראות היצרן. אחזור וניתוח הנתונים על-ידי פתיחת קובץ הנתונים באמצעות תוכנת שולחן העבודה של Wave. לחץ על נרמל, הדבק את ערכי הנורמליזציה עבור כל באר ולאחר מכן לחץ על החל כדי לנרמל את הנתונים.

לחץ על ייצוא ובחר מחולל דוחות בדיקת מאמץ של גליקוליזה כדי לייצא את הנתונים שנותחו למחולל דוחות. קצב ההחמצה הלא-גליקוליטי עולה עם מספר תאים מוגבר מ-50, 000 ל-250, 000, אך גדל רק באופן מינימלי בין 200, 000 ל-250, 000. הזרקה של גלוקוז 10 מילימולרי מגרה את הגליקוליזה בכל מספרי התאים עם עלייה מקסימלית ב- ECAR שנצפתה ב- 250, 000 תאים לבאר.

עם זאת, הזרקה של שני מיקרומולר של אוליגומיצין אינה מגדילה עוד יותר את ECAR. נתוני OCR שהתקבלו באותה קבוצה של בדיקות מאמץ של גליקוליזה מראים ירידה משמעותית לאחר הזרקת אוליגומיצין עקב עיכוב מורכב 5. חושבו פרמטרים של בדיקת מאמץ של גליקוליזה ונבחרו 250, 000 תאים לכל באר בשני מיקרומולרים של אוליגומיצין למחקרים נוספים.

בדיקת הלחץ המיטוכונדרית הראתה כי שתי זריקות אוליגומיצין מיקרומולריות גורמות לירידה משמעותית ב- OCR באמצעות עיכוב של קומפלקס 5. FCCP מגרה זיהוי תווים אופטי (OCR) ב-HSPCs באופן תלוי מינון עם עלייה מקסימלית שנצפתה בשני מיקרומולרים. תערובת של 0.5 מיקרומולר רוטנון והזרקת 0.5 מיקרומולר אנטימיצין A מקטינה את ה-OCR לרמתו המינימלית המתאימה לצריכת חמצן שאינה מיטוכונדריאלית.

פרמטרים של בדיקת מאמץ מיטוכונדריאלית חושבו ושני מיקרומולר של FCCP נבחר למחקרים נוספים. בהתחשב באופי התפוקה הגבוהה של טכניקה זו, ניתן היה להתאים את הפרוטוקול המתואר כאן בקלות לסינון מספר רב של מודולטורים ביו-אנרגטיים בתאי גזע המטופויאטיים, אבות המטופויאטיים ותאים המטופויאטיים ממאירים. ניתוח סוסון ים נמצא בשימוש נרחב בספרות למדידת חילוף החומרים במגוון רחב של הקשרים בנוכחות מצעים ומעכבים שונים.