Name: ניתוח החלק ההקפאה של האזור התת-כספי למבוגרים לניתוח פרוטאום כמותי מדויק ועמוק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: למד שיטת קריו-סקשן-דיסקשן לבידוד מדויק של נישה נוירוגנית בחדרי המוח בעכברים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח פרוטאום כמותי עמוק עם מינימום פגיעה ברקמה וזיהוי רגולטורים חדשים של נוירוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מבקשים להודות בכנות למתיאס מאן על שאיפשר לנו לבצע חלקים גדולים מהניסויים במעבדה שלו, פביאן קוסיה על העזרה עם LCM וניתוח פרוטאום, טטיאנה סימון-אברט על ניתוחים מלאים, וקורביניאן מאייר ואיגור פארון על עזרתם הטכנית. אנו מודים על מימון ממועצת המחקר הגרמנית ל- MG (SFB870, TFR274), האיחוד האירופי (Eranet S-700982-5008-001), ה- ERC (aERC "NeuroCentro" ל- MG), האגודה השבדית למחקר רפואי (SSMF, ל- JK) מענק פוסט-דוקטורט, וקרנות KI וקרנות (2020-01351, ל- JK).

כל ההליכים הניסיוניים במחקר זה בוצעו בהתאם להנחיות גרמניה והאיחוד האירופי ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים וממשלת בוואריה העליונה (Regierung von Oberbayern). רק עכברי C57Bl6 זכרים בין הגילאים 8-10 שבועות שימשו לניסויים.
1. הכנת מוח העכבר (~ 15 דקות לעכבר)
<ol><li>הכן את מדיום החיתוך על ידי הוספת 5 מ"ל של 1 M HEPES (ריכוז סופי 10 מ"מ) ל 500 מ"ל של 1x פתרון מלח מאוזן של האנק (HBSS). הערה: זמן האחסון של אמצעי הניתוח (+4 °C)) לא יעלה על שבועיים.</li>
	<li>להקריב את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם ולנתח בזהירות את המוח. הערה: בעת חקירת ECM, הרקמה צריכה להיות לא שונה. נקע צוואר הרחם שומר על זמן הניתוח קצר ככל האפשר, ובכך מונע עיכול עצמי אנזימטי פוסט-תמותתי ככל האפשר. אם הסרת הדם היא קריטית לשאלת המחקר, פשוט להחדיר את העכבר transcardially עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) לפני הסרת המוח.</li>
	<li>יש לחלץ את המוח בניתוח ידני ולהניח אותו בצלחת תרבית המכילה מדיום ניתוח קר כקרח (איור 1B – 1). הערה: שמור את המוח במדיום ביתור על קרח לאורך כל הניתוח.</li>
	<li>הסר את נורת הריח (OB) עם אזמל (איור 1B - 2) על ידי חתך קורונל ישר בין OB לבין הקוטב הקדמי של קליפת המוח.</li>
	<li>הסר את הקוטב הקדמי של קליפת המוח עם האזמל באמצעות חתך קורונלי כדי להפוך את החדרים לרוחב גלויים במישור הקורונלי (איור 1B - 3). הערה: ודא את החתך coronal נעשה ~ 5 מ"מ rostrally מן chiasm אופטי; אחרת, החלק rostral של SEZ / MEZ יאבד.</li>
	<li>בעזרת מספריים, פתחו את שני החדרים הצדדיים מלמעלה, החל בקטע קשתי מהמשטח הקליפתי וכלה בלומן החדרי, והאריכו את החתך הזה בצורה בצורת C בעקבות כיפוף החדר (איור 1B – 4).</li>
	<li>חבר את הקצוות הקודליים של החתך הקשת השמאלי והימני באמצעות חתך קורונלי נוסף עם המספריים. הערה: שלושת החתכים יוצרים כעת טרפז ויקלו על הסרת קליפת המוח והקורפוס קאלוזום בשלב הבא.</li>
	<li>הסירו את קליפת המוח ואת הקורפוס קאלוסום המכסים את החדרים הצדדיים באמצעות מלקחיים (איור 1B – 5). לאחר מכן, להסיר את קליפת המוח ואת corpus callosum המכסים את קירות החדר המדיאלי. כאן, לבצע חתכים נוספים אם הרקמה מחוברת לקירות החדר המדיאלי, או פשוט להרים את קליפת המוח ואת corpus callosum עם מספריים כדי לחלץ את הרקמה.</li>
	<li>יש לפזר בזהירות את קירות החדר עם מלקחיים (איור 1B – 6). הסר את מקלעת choroid עם מלקחיים. הערה: הסרה מלאה של מקלעת choroid חשובה כדי למנוע הפרעה עם שלבי הניתוח הבאים ולמנוע זיהום פוטנציאלי של דגימות SEZ / MEZ.</li>
	<li>שים את המוח על שקופית זכוכית ומניחים את שקופית הזכוכית על גבי קרח יבש כדי להקפיא את המוח. שמור על קירות החדר בתצורה הפתוחה. הערה: ודאו מרחק מספיק בין הקירות הצדדיים והמדיאליים של החדר כדי להקל על ניתוח מדויק ובלעדי של SEZ ו-MEZ. אם הרקמה מתכווצת בחזרה לתצורה סגורה, השתמש במלקחיים כדי לתקן את הקירות במצב הרצוי במהלך ההקפאה. הימנע מכל נזק ל- SEZ / MEZ. נסה להפעיל כוח מינימלי, בעיקר בקצה העליון של החדרים הפתוחים.</li>
</ol>2. חתך של המוח המוכן (~ 15 דקות לעכבר)
<ol><li>חותכים 50-100 מיקרומטר קטעים קורונליים בעובי של המוח עד סוף החדר לרוחב באמצעות cryostat ולהרכיב את החלקים על מגלשות זכוכית. ודא כי המוח מחובר ללוח ההתקשרות cryostat ב hindbrain עם מדיום OCT וכי אין OCT בא במגע עם המוח הקדמי, במיוחד בחדרים. הערה: מדיום OCT יפריע למדידות טרשת נפוצה. עם זאת, אם הרקמה תשמש לבדיקת נוגדנים, אין צורך לא לכלול מדיום OCT. השימוש במגלשות זכוכית מצופה אינו מומלץ. שקופיות מצופות מפעילות יותר מדי כוח דבק על הרקמה, ובכך מעכבות את המעבר של דגימת הרקמה מהמגלשות לצינור המיקרוצנטריפוגה בשלבים הבאים.</li>
</ol>3. ניתוח ביד חופשית של פרוסות המוח (~ 30 דקות לעכבר)
<ol><li>הניחו את מגלשות הזכוכית עם חלקי המוח על קרח יבש מתחת למיקרוסקופ ניתוח (איור 1C - 1).</li>
	<li>הכן את צינורות microcentrifuge על קרח יבש, ולוודא כי הצינורות להישאר על קרח יבש לפחות 1 דקות כדי להיות קר מספיק לפני העברת דגימה. הערה: השתמש בצינורות microcentrifuge באיכות גבוהה, כמו צינורות באיכות נמוכה מסוימים עשויים לשפוך פלסטיק בשלבי העיכול הבאים של הרקמות הקשורים מדידות טרשת נפוצה.</li>
	<li>הרימו את הפרוסות מהקרח היבש למשך 15-30 שניות כדי להשיג הפשרה קצרה ולא שלמה כדי להפוך את המיאלין הקומפקטי של הסטריאטום לנצפות כנקודות לבנות צפופות. הערה: איתור הגבול בין ה-SEZ לסטריאטום הופך לאפשרי (איור 1C – 2, ראו איור 2A להרחקת המיאלין ולהשוואה עם שיטת הטעינה כולה). אם הפשרה אורכת זמן רב מדי, ניתן להאיץ את התהליך על-ידי לחיצה על אצבע מכוסה כפפה בצד הנגדי של מגלשת הזכוכית. עם זאת, תמרון זה צריך להיות מתורגל כמו הפשרה מוגזמת מתרחשת בקלות.</li>
	<li>הפרד את ה-SEZ עם אזמל מקורר מראש מהסטריאטום הסמוך (איור 1C, D).</li>
	<li>מעבירים את ה- SEZ כחתיכה שלמה או מחולקים ל -2-4 חלקים לצינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות הקצה הקהה של האזמל המקורר. אם הרקמה תשמש לסוג אחר של ניתוח שאינו MS, העבר את דגימת הרקמה למיכל המתאים במקום זאת (למשל, צלחת של 96 בארות). הערה: חיתוך הרקמה הקפואה לחלוטין עלול להוביל לפירוק מהיר של הרקמה ולנפילה מהמגלשה. חיתוך רקמה מופשרת לחלוטין מוביל להתפוררות הרקמה. ודא כי הרקמה אינה קפואה לחלוטין או מופשרת לחלוטין.</li>
</ol>

<ol><li>Goodman, T., Hajihosseini, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+tanycytes-masters+and+servants+of+metabolic%2C+neuroendocrine%2C+and+neurogenic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic tanycytes-masters and servants of metabolic, neuroendocrine, and neurogenic functions.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 387(2015).</li>
<li>Chaker, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+neurogenesis+persists+in+the+aging+brain+and+is+controlled+by+energy-sensing+IGF-I+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic neurogenesis persists in the aging brain and is controlled by energy-sensing IGF-I pathway.</a> Neurobiology of Aging. 41, 64-72 (2016).</li>
<li>Kuhn, H. G., Toda, T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+hippocampal+neurogenesis%3A+a+coming-of-age+story%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult hippocampal neurogenesis: a coming-of-age story.</a> Journal of Neuroscience. 38 (49), 10401-10410 (2018).</li>
<li>Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+origin%2C+heterogeneity+and+regulation+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain.</a> Development. 146 (4), (2019).</li>
<li>Obernier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+is+sustained+by+symmetric+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).</li>
<li>Bordiuk, O. L., Smith, K., Morin, P. J., Semënov, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+neurogenesis+in+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and neurogenesis in adult mouse brain.</a> PloS One. 9 (11), 111453(2014).</li>
<li>Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+and+three-dimensional+organization+of+the+subventricular+germinal+zone+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 17 (13), 5046-5061 (1997).</li>
<li>Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+ventricular-subventricular+zone+%28V-SVZ%29+and+olfactory+bulb+%28OB%29+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The adult ventricular-subventricular zone (V-SVZ) and olfactory bulb (OB) neurogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), 018820(2016).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+microglia+on+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of microglia on neurogenesis.</a> Glia. 63 (8), 1394-1405 (2015).</li>
<li>Tavazoie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).</li>
<li>Sirko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfates+are+required+for+fibroblast+growth+factor-2-dependent+proliferation+and+maintenance+in+neural+stem+cells+and+for+epidermal+growth+factor-dependent+migration+of+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfates are required for fibroblast growth factor-2-dependent proliferation and maintenance in neural stem cells and for epidermal growth factor-dependent migration of their progeny.</a> Stem Cells. 28 (4), 775-787 (2010).</li>
<li>Mercier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractones%3A+extracellular+matrix+niche+controlling+stem+cell+fate+and+growth+factor+activity+in+the+brain+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Fractones: extracellular matrix niche controlling stem cell fate and growth factor activity in the brain in health and disease.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (24), 4661-4674 (2016).</li>
<li>Mercier, F., Kitasako, J. T., Hatton, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+brain+neurogenic+zones+revisited%3A+fractones+and+the+fibroblast%2Fmacrophage+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the brain neurogenic zones revisited: fractones and the fibroblast/macrophage network.</a> Journal of Comparative Neurology. 451 (2), 170-188 (2002).</li>
<li>Nascimento, M. A., Sorokin, L., Coelho-Sampaio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractone+bulbs+derive+from+ependymal+cells+and+their+laminin+composition+influence+the+stem+cell+niche+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fractone bulbs derive from ependymal cells and their laminin composition influence the stem cell niche in the subventricular zone.</a> Journal of Neuroscience. 38 (16), 3880-3889 (2018).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+for+brain+and+spinal+cord+repair%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming for brain and spinal cord repair.</a> eNeuro. 2 (5), 0106-0115 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., Chen, W., Tan, S., Lin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+modeling+and+therapy+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Stem cells for modeling and therapy of Parkinson's disease.</a> Human Gene Therapy. 28 (1), 85-98 (2017).</li>
<li>Wei, C., Xiong, S., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+fibroblasts+to+neural+stem+cells+by+a+chemical+cocktail%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of fibroblasts to neural stem cells by a chemical cocktail.</a> Methods in Molecular Biology. 2117, 265-270 (2020).</li>
<li>Tian, Z., Zhao, Q., Biswas, S., Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+reactivation+and+reprogramming+of+neural+stem+cells+for+neural+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of reactivation and reprogramming of neural stem cells for neural repair.</a> Methods. 133, 3-20 (2018).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2-mediated+conversion+of+NG2+glia+into+induced+neurons+in+the+injured+adult+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Sox2-mediated conversion of NG2 glia into induced neurons in the injured adult cerebral cortex.</a> Stem Cell Reports. 3 (6), 1000-1014 (2014).</li>
<li>Masserdotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mechanisms+of+proneural+factors+and+REST+in+regulating+neuronal+reprogramming+of+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).</li>
<li>Seidenfaden, R., Desoeuvre, A., Bosio, A., Virard, I., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+conversion+of+SVZ-derived+committed+neuronal+precursors+after+ectopic+grafting+into+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Glial conversion of SVZ-derived committed neuronal precursors after ectopic grafting into the adult brain.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (1-2), 187-198 (2006).</li>
<li>Lepko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus-derived+miR-204+regulates+the+number+of+quiescent+neural+stem+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus-derived miR-204 regulates the number of quiescent neural stem cells in the adult brain.</a> EMBO Journal. 38 (17), 100481(2019).</li>
<li>Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+niche+signals+from+the+choroid+plexus+regulate+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).</li>
<li>Angelidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+the+aging+lung+mapped+by+single+cell+transcriptomics+and+deep+tissue+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An atlas of the aging lung mapped by single cell transcriptomics and deep tissue proteomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 963(2019).</li>
<li>Kjell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+adult+neural+stem+cell+niche+proteome+identifies+key+regulators+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Defining the adult neural stem cell niche proteome identifies key regulators of adult neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 26 (2), 277-293 (2020).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subventricular+zone+en-face%3A+wholemount+staining+and+ependymal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), e1938(2010).</li>
<li>Kulak, N. A., Geyer, P. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-less+nano-fractionator+for+high+sensitivity%2C+high+coverage+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Loss-less nano-fractionator for high sensitivity, high coverage proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 16 (4), 694-705 (2017).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction%2C+termed+MaxLFQ%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li>
<li>Perez-Riverol, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PRIDE+database+and+related+tools+and+resources+in+2019%3A+improving+support+for+quantification+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 442-450 (2019).</li>
<li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344 (6181), 319-324 (2014).</li>
<li>Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-+and+brain+region-resolved+mouse+brain+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell type- and brain region-resolved mouse brain proteome.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1819-1831 (2015).</li>
<li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+Big+data+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li>
<li>Kerever, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+extracellular+matrix+structures+in+the+neural+stem+cell+niche+capture+the+neurogenic+factor+fibroblast+growth+factor+2+from+the+extracellular+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Novel extracellular matrix structures in the neural stem cell niche capture the neurogenic factor fibroblast growth factor 2 from the extracellular milieu.</a> Stem Cells. 25 (9), 2146-2157 (2007).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1D+and+2D+annotation+enrichment%3A+a+statistical+method+integrating+quantitative+proteomics+with+complementary+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12(2012).</li>
<li>Daynac, M., Morizur, L., Chicheportiche, A., Mouthon, M. -A., Boussin, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+neurogenesis+decline+in+the+subventricular+zone+is+associated+with+specific+cell+cycle+regulation+changes+in+activated+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-related neurogenesis decline in the subventricular zone is associated with specific cell cycle regulation changes in activated neural stem cells.</a> Scientific Reports. 6, 21505(2016).</li>
<li>Navarro Negredo, P., Yeo, R. W., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+rejuvenation+of+neural+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging and rejuvenation of neural stem cells and their niches.</a> Cell Stem Cell. 27 (2), 202-223 (2020).</li>
<li>Smith, L. K., White, C. W., Villeda, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+systemic+environment%3A+at+the+interface+of+aging+and+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The systemic environment: at the interface of aging and adult neurogenesis.</a> Cell and Tissue Research. 371 (1), 105-113 (2018).</li>
<li>Neuberger, E. J., Swietek, B., Corrubia, L., Prasanna, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dentate+neurogenesis+after+brain+injury+undermines+long-term+neurogenic+potential+and+promotes+seizure+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhanced dentate neurogenesis after brain injury undermines long-term neurogenic potential and promotes seizure susceptibility.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 972-984 (2017).</li>
<li>Fisch, U., Brégère, C., Geier, F., Chicha, L., Guzman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+hypoxia-ischemia+in+rat+elicits+a+region-specific+neurotrophic+response+in+SVZ+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Neonatal hypoxia-ischemia in rat elicits a region-specific neurotrophic response in SVZ microglia.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 26(2020).</li>
<li>Götz, M., Sirko, S., Beckers, J., Irmler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+as+neural+stem+or+progenitor+cells%3A+In+vivo+lineage%2C+In+vitro+potential%2C+and+Genome-wide+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes as neural stem or progenitor cells: In vivo lineage, In vitro potential, and Genome-wide expression analysis.</a> Glia. 63 (8), 1452-1468 (2015).</li>
<li>Kernie, S. G., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+neurogenesis+after+focal+Ischemic+and+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Forebrain neurogenesis after focal Ischemic and traumatic brain injury.</a> Neurobiology of Disease. 37 (2), 267-274 (2010).</li>
<li>Pous, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+induces+neural+stem+cell+differentiation+into+astrocytes+in+the+subventricular+zone+via+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen induces neural stem cell differentiation into astrocytes in the subventricular zone via BMP signaling.</a> Nature Communications. 11 (1), 630(2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים

שיטת CSD אפשרה לחלץ במדויק רקמת SEZ וליצור פרוטאום אמין עם עומק משמעותי באמצעות MS. CSD מציג יתרון ברור בהשוואה לחיתוך מלא במונחים של זיהום סטריאטלי מופחת מאוד של דגימות SEZ והעשרת חלבונים חוץ תאיים. כפי שניתן גם לזהות מספר דומה של חלבונים בדגימות בודדות (~ 6,500 חלבונים לדגימה) עם CSD וחיתוך מלא, הזמן הנוסף עבור CSD שווה את המאמץ. LCM מספק ניתוח SEZ מדויק יותר אך הגיע לעומק פרוטאום נמוך יותר, עם רק 3,500 חלבונים לדגימה למרות שהשתמש באותו פרוטוקול MS כמו CSD (התאמת ספריה וכימות ללא תוויות). חשוב לציין שהשונות הייתה גדולה בהרבה, כנראה בגלל זמן ההכנה הארוך פי שמונה לדגימה. PCA של הדגימות שהושגו על ידי LCM ו- CSD חושף הפרדה ברורה של שתי השיטות עם אשכולות הדוקים ספציפיים לאזור המופרדים בחוזקה זה מזה. לעומת זאת, דגימות LCM הציגו התפלגות מפוזרת יותר, אשר כנראה בחלקה בשל אורך ההכנה. לא ברור אם איסוף דגימות רבות יותר על פני תקופה ארוכה יותר היה מניב פרוטאום של חוסן ועומק שווים עם LCM. חישוב הערכה, איסוף נפח מדגם דומה כפי שנעשה עבור CSD ייקח 5-8 פעמים יותר עם LCM, אפילו עד פי 15 יותר אם דגימות שסופקו עבור ספריות ספקטרום פפטיד נכללו, וחלק גדול ממנו בתנאים מופשרים. יתר על כן, בהתחשב בהפרעות הנוספות של הרקמה הדרושה ל- LCM (כתמי רקע, ניתוח לייזר), LCM סיפק מעט, אם בכלל, רווח על פני CSD. לפיכך, CSD יכול להיחשב מתאים יותר למחקר פרוטאום חוץ תאי, במיוחד עבור SEZ.
ראוי לציין, אם אזור העניין קטן יותר מאשר SEZ (למשל, חוקר רק את שכבת התא ependymal), גישה חופשית נופלת מאחורי הדיוק של LCM. לדוגמה, השימוש ב- CSD להפרדת האפנדימלי לשכבה התת-קרקעית קשה מכיוון שהשכבה האפנדימלית היא רק קוטר תא רחב, והתיחום כלפי השכבה התת-כספית אינו גלוי לעין בלתי ברקמה קפואה טרייה. לפיכך, LCM יהיה בחירה טובה יותר מאשר CSD אם ניתוח מדויק בקנה מידה מתחת 50 מיקרומטר חשוב יותר מאשר רקמה ללא הפרעה או שמירה על זמן הניתוח קצר. עבור אזורים עם רוחב של 50 מיקרומטר ויותר, עם זאת, הדיוק של CSD דומה לזה של LCM לניתוח חלבון ECM.
CSD כבר הוכיח להיות שימושי על ידי תרומה לחקירה של התפקיד התפקודי של ECM בנישה neurogenic25. לפיכך, המשך היישום של CSD ב- SEZ עבור חקירות חלבון ופרוטום שונים (או אפילו רצף RNA גרעין יחיד) עשוי להוביל לאיתור של ויסות נוירוגנזה נוספים, סמני הפעלת תאי גזע, והבנה עמוקה יותר של פיזיולוגיית נישה של תאי גזע SEZ. בהתחשב בירידה של neurogenesis בהזדקנות SEZ37, ניתוח תמציתי של שינויים ECM של SEZ של עכברים בגיל לעומת צעירים עשוי לקדם את ההבנה של מנגנוני נישה מדויקים טיפוח פיתוח ותחזוקה NSC38,39. יתר על כן, ההשפעה של דלקת ופציעה על נוירוגנזה SEZ מבוססת היטב40,41,42,43. ההעשרה של פיברינוגן שמקורו בדם ב- SEZ לאחר פגיעה מוחית בקליפת המוח והשפעתה על אסטרוגלוגנזה SEZ והיווצרות צלקת44 מדגישה את ההשפעה הפוטנציאלית של שינויי מיקרו-סביבה הנגרמים מטראומה על הפיזיולוגיה של תאי הגזע SEZ. לפיכך, חקירת פרוטאום SEZ-ECM בשיתוף עם פגיעה מוחית באמצעות CSD יכול לעזור להבהיר את המנגנונים שבאמצעותם פגיעה ודלקת להשפיע על neurogenesis. חשוב לציין, השיטה יכולה להיות ישימה גם נישות neurogenic המוח האנושי בבריאות ומחלות כמו רקמה קפואה טרי לעתים קרובות ניתן להשיג מניתוחים. יתר על כן, בהתחשב בהבדלים המינים נוירוגנזה בוגרת, זה יהיה גם מרתק ליישם את שיטת CSD על מינים אחרים, למשל, בשיתוף נוירוגנזה striatal. יתר על כן, עם שיטות אחרות לזיהוי חלבונים, הבדלים בגורמי גדילה המיוצרים באופן מקומי ניתן לחקור במדויק וביעילות באמצעות CSD עבור SEZ ו- MEZ (למשל, ELISA).
לבסוף, הליך הניתוח יכול להיות שונה באופן פוטנציאלי עבור מיצוי מדויק של אזורי מוח אחרים, גם עבור שאלות מחקר שאינן קשורות neurogenesis. לדוגמה, CSD כולל צעד הפשרה למחצה קצר, שבמהלכו מיאלין קומפקטי נראה כאזורים לבנים הנבדלים מרקמת המוח השיורית השקוף יותר. עם שינוי פשוט של השיטה, תכונה זו תאפשר את הניתוח המדויק של רקמת מיאלין קומפקטית קורפוס callosum בלבד, אשר יכול להיות נתון לניתוח פרוטאומי של שינויים הקשורים לפציעה. הצעה לשינוי פרוטוקול שיאפשר את הניתוח הקשוח של הקורפוס היא להשמיט את שלבים 1.5-1.9 של הפרוטוקול ולהמשיך ישירות להכנת קטעי הקורונה במקום לפתוח את החדרים כדי להפוך את SEZ ו MEZ נגישים. לאחר מכן, מניחים את החלקים על קרח יבש, להרים לזמן קצר ולהפשיר למחצה את הפרוסות, ופשוט להסיר את קורפוס callosum עם אזמל. הכנה זו צריכה להיות מוכנה כעת לכל ניתוח הדורש ניתוח יעיל של רקמת קורפוס קאלוזום מקומית.
לסיכום, מחקר זה מציג שיטת מיקרו-ניתוח שיכולה לשמש לניתוח פרוטאום נישה נוירוגנית חדרית אמינה. הנתונים מדגישים את התאימות והתועלת של שיטת CSD יחד עם ניתוח פרוטאומי מבוסס MS של מיקרו-סביבה SEZ. השילוב של דיוק, יעילות וסטירת רקמות מינימלית הופכים את ה- CSD להרחבה רבת ערך של שיטות קיימות.

כמו neurogenesis מוגבל במוח הבוגר, אסטרטגיות שונות לתיקון מערכת העצבים המרכזית ייהנו מאוד הבנה מוגברת של היסודות של תחליף עצבי למבוגרים. מכרסמים עזרו לנו להבין את המנגנונים הבסיסיים של נוירוגנזה לאחר הלידה, אם כי יש לציין כי נוירוגנזה בוגרת תלויה מאוד במינים. בעכברים, יש שלוש נישות של תאי גזע עצביים בוגרים (NSC). ההיפותלמוס הוא נישה בוגרת של המועצה לביטחון לאומי עם פוטנציאל נוירוגני 1,2, בעוד נוירוגנזה בוגרת מתמשכת מוגבלת בעיקר להיפוקמפוס3 ול- SEZ של הקירות הצדדיים של החדרים לרוחב4,5,6. ה- SEZ הוא אזור הנבטים הגדול ביותר המכיל NSCs (תאי סוג B) המתפתחים לנוירובלסטים (תאים מסוג A) באמצעות תאי אב מגבירי מעבר (תאי C מסוג C). ה-SEZ מכיל 20-35% מתאי סוג B, 1-15% מתאי סוג C, 1-30% מתאי סוג A ו-25-50% מתאי אפנדימאל7. ה- SEZ כולל מיקרו-ארכיטקטורה מורכבת, עם תאי אנדותל, תאים מיקרוגליאליים ותאים אפנדימליים המתגוררים ומשפיעים על נישה של תאי הגזע8,9,10. למרות נוירונים נדירים SEZ, אקסונים הנובעים ממקורות רחוקים כגון סטריאטום, אזור הטגמנטום הגחוני, או ההיפותלמוס להגיע ולהשפיע על סוג B תאים4. מאפיין ייחודי של נישה זו של תאי גזע הוא ההפרדה בין אתר ההתפשטות לבין אתר הבידול. לאחר התפשטות, האבות העצביים נודדים כמה מילימטרים מה- SEZ לנורת הריח, שם הם מתבדלים באופן סופני לנוירונים ומשתלבים במעגלים עצביים קיימים. חקירות של תוכניות תאי-מהותיות הקשורות נוירוגנזה כבר סיפקו ידע חשוב עבור תכנות מחדש של תאים טיפוליים ניסיוניים ואסטרטגיות השתלה15,16,17,17,18,19,20. עם זאת, אותות חיצוניים של תאים גם לווסת neurogenesis, סביבות רקמות יכול לקבוע את הגורל הנוירוגני של תאי גזע11,12,14,21,22,23. כתוצאה מכך, חקירת המיקרו-סביבה של הגומחות הנוירוגניות והאינטראקציה שלה עם תאי הגזע היא בעלת חשיבות מכרעת.
המטריצה החוץ-תאית (ECM) וחלבונים מופרשים אחרים הם חלק גדול מהמיקרו-סביבה. לזיהוי וכימות מדויקים, גישה פרוטאומית מתאימה יותר מגישה תמלולית לקביעת הרכב ECM בשל המתאם הנמוך בין התמלול לרמות החלבון עבור ECM24,25. יתר על כן, יש ראיות משמעותיות כי רגולטורים נישה SEZ אינם מיוצרים באופן בלעדי על ידי תאים המאכלסים את הנישה עצמה. במקומות מרוחקים יותר, כגון מקלעת הכורואידים, מפרישים אותות אפנון המועברים לתאי הגזע באמצעות הנוזל השדרתי22,23. חקירת פרוטאום נישה יכול לעזור לזהות רגולטורים נישה נוכח נישה עצמאית של אתר הייצור שלהם, בהתחשב בכך חלק ניכר של microenvironment חוץ תאי מורכב על ידי חלבונים.
כדי לאסוף את אזור חדרי המורין לניתוח פרוטאומי לא משוחד, נדרשת שיטה עם דיוק גבוה, לכידת סרט paraventricular דק כ -50 מיקרומטר המכיל תאי גזע תוך אי הכללת הרקמה של הסטריאטום הסמוך. יתר על כן, הפרעה רקמות במהלך הניתוח חייב להיות מינימלי לניתוח microenvironment חוץ תאי כי חלבונים מסיסים, כולל גורמי גדילה או ציטוקינים, ניתן לשטוף בקלות. למרות שניתן לנתח את ספקטרום המסה של רקמה קבועה, הסוכן הנדרש, כגון paraformaldehyde, יפחית את עומק זיהוי החלבון ועשוי לגרום לשינויים פוסט-טרנסלנטיים. ניתוח SEZ שלם נפוץ, למשל, עבור אוסף של תאים לניתוח מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, מסיר את כל ה- SEZ עם מספריים26. ביתור סטנדרטי זה הוא מהיר עם הפרעה מינימלית לרקמות. עם זאת, זיהום striatal של הדגימות לא ניתן להימנע. לעומת זאת, ל- LCM יש את היתרון יוצא הדופן של דיוק ניתוח מעולה. עם זאת, LCM עשוי להציג הפרעות רקמות, למשל, עקב כתמי רקע או denaturation חלבון שנגרם בלייזר. כדי לשלב את נקודות החוזק של הניתוח כולו ו- LCM, פותחה שיטה חדשנית התואמת לטרשת נפוצה, המכונה קריו-קטע-חתך (CSD), (איור 1A-D). ה- CSD מאפשר את החילוץ של SEZ ואת הניתוח של SEZ של הקירות המדיאליים של החדרים לרוחב (MEZ), שהוא אזור בקרה אידיאלי, בעיקר לא נוירוגני עבור SEZ (ראה הפרוטוקול). פרוטאום הנישה שהושג על ידי השילוב של CSD ושיטות MS חדישות הוכיח להיות שימושי עבור אפיון וזיהוי של רגולטורים חדשים בנישה זו NSC למבוגרים 25. לפיכך, שיטה זו תהיה שימושית לקביעת הרכב חלבון רקמת SEZ.

<table><tbody><tr><td>Cryostat CM3050S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont no. 5SF מלקחיים, Inox סופר דק</td><td>קצה Fine Science</td><td>Tools cat. 11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s תמיסת מלח מאוזנת עם CaCl2 ו-MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>cat. מס' 24020</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חיץ HEPES (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>cat. מס' 15630</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>RS צרפת</td><td>cat. no. BPB018</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נעילה בטוחה, PCR נקי 2.0 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>cat. מס' 0030123344</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים, Vannas-Tubingen 5 מ"מ</td><td>Fine Science Tools</td><td>cat. מס' 15003-08</td><td></td></tr><tr><td>אזמל חד פעמי כירורגי</td><td>B. Braun</td><td>cat. מס' 5518083</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות 60 מ"מ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>cat. מס' 633180</td><td></td></tr><tr><td><חזק> נוגדנים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים משניים של Alexa Fluor (488, 555) (1/1,000)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>cat. מס' A-11001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>cat. מס' D9542</td><td></td></tr><tr><td>שרקנים פוליקלונליים אנטי-DCX 1:500</td><td>Millipore</td><td>cat. no. AB2253,</td><td></td></tr> <tr><td>עכבר חד-שבטי אנטי-GFAP 1:500</td><td>סיגמא</td><td>חתול. מס' G3893</td><td></td></tr><tr><td>עכבר חד-שבטי אנטי-MAG 1:400</td><td>Millipore</td><td>cat. MAB1567</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism גרסה 9</td><td>תוכנת GraphPad, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב</td><td></td><td>www.graphpad.com</td></tr><tr><td>פרסאוס גרסה 1.6.10.50</td><td>מכון מקס פלאנק לביוכימיה, מינכן, בוואריה, גרמניה</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://maxquant.net/perseus/ ZEN תוכנת הדמיה</td><td>קארל זייס</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח החלק ההקפאה של האזור התת-כספי למבוגרים לניתוח פרוטאום כמותי מדויק ועמוק

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

הנישה הנוירוגנית התת-פננדימלית מורכבת מרצועת מפרקים של קיר החדר לרוחב של החדר הצדדי. האזור התת-קרקעי (SEZ) הוא אזור דק ומובחן החשוף לחדרים ולנוזל השדרתי. הבידוד של נישה זו מאפשר ניתוח של מיקרו-סביבה נוירוגנית של תאי גזע. עם זאת, מיצוי של רקמות קטנות לניתוח פרוטאום הוא מאתגר, במיוחד לשמירה על עומק מדידה ניכר והשגת חוסן אמין. שיטה חדשה המכונה cryo-סעיף-ניתוח (CSD), המשלב דיוק גבוה עם הפרעת רקמות מינימלית, פותחה כדי להתמודד עם אתגרים אלה. השיטה תואמת לשיטות ספקטרומטריית מסה (MS) חדישות המאפשרות זיהוי של רגולטורים נישה בשפע נמוך. מחקר זה השווה את ה- CSD ואת נתוני הפרוטאום שלו לשיטה ולנתונים המתקבלים על ידי מיקרודיסקציה של לכידת לייזר (LCM) וחתך סטנדרטי שלם. שיטת ה- CSD הביאה לעומק כימות כפול בפחות ממחצית זמן ההכנה בהשוואה ל- LCM ובו זמנית עלתה בבירור על דיוק הניתוח של הניתוח כולו. לפיכך, CSD היא שיטה מעולה לאיסוף SEZ לניתוח פרוטאום.

קריו-סעיף-ניתוח מאפשר הכנה טרייה, קפואה של הנישה הנוירוגנית הגדולה ביותר במוח מורין לניתוח פרוטאום כמותי עמוק. השיטה מדויקת, יעילה וגורמת להפרעה מינימלית לרקמות. לכן, הוא מתאים באופן אידיאלי לחקר המיקרו-סביבה המולקולרית של נישה זו, כמו גם איברים, אזורים ומינים אחרים.

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

שיטת הניתוח שלנו מאפשרת בידוד מדויק של הנישה הנוירוגנית בחדר, ולכן מתאימה היטב לחקר המיקרו-סביבה המולקולרית של נישה זו. היתרון העיקרי של שיטת ניתוח זו הוא שהיא מדויקת, יעילה וגורמת להפרעה מינימלית של רקמות תוך שהיא עדיין תואמת לספקטרומטריית מסה לניתוח פרוטאום. בפרוטוקול זה, אנו מחלצים את הנישה הנוירוגנית של החדר ממוח עכבר, אך שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על מינים אחרים ובמצבים שונים של בריאות ומחלות.הטכניקה עשויה לדרוש הכשרה מסוימת. במיוחד עם חתכי האזמל בעת חשיפה וחילוץ נישה נוירוגנית חדרית. לאחר המתת חסד של עכבר זכר C57 שחור/6 בן 8 עד 10 שבועות, לחלץ את המוח על ידי ביתור ידני ולהניח אותו בכלי תרבות המכיל מדיום ניתוח קר כקרח.באמצעות אזמל, להסיר את הנורה חוש הריח על ידי ביצוע חתך קורונל ישר בין הנורה חוש הריח ואת הקוטב הפנימי של קליפת המוח. לאחר מכן, להסיר את הקוטב הקדמי של קליפת המוח על ידי ביצוע חתך coronal, להבטיח כי החדרים לרוחב גלויים במישור coronal. לאחר מכן, באמצעות מספריים, לפתוח את שני החדרים לרוחב מלמעלה, החל החלק קשתי מפני השטח קליפת המוח אל לומן החדר.להאריך את החתך הזה בצורה בצורת C בעקבות כיפוף החדר. לאחר מכן, חבר את הקצוות הקואודליים של החתך הקשת השמאלי והימני, תוך שימוש בחתך קורונלי נוסף. לאחר מכן, להסיר את קליפת המוח ואת corpus callosum המכסה את קירות החדר המדיאלי.אם הרקמה מחוברת לדפנות החדר המדיאלי, לבצע חתכים נוספים או להרים את קליפת המוח ואת corpus callosum עם מספריים כדי לחלץ את הרקמה. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, להסיר את קליפת המוח ו corpus callosum המכסה את החדרים לרוחב. באמצעות מלקחיים, בזהירות להפיץ את קירות החדר ולהסיר את מקלעת choroid.לאחר מכן, לשים את המוח על שקופית זכוכית ולהניח את השקופית על גבי קרח יבש כדי להקפיא את המוח עם קירות החדר בתצורה הפתוחה. לפני החיתוך, ודאו שהמוח מחובר ללוחית ההצמדה של הקריוסטט במוח האחורי עם מדיום מוטבע לרקמות קפואות. בנוסף, ודא כי אין מדיום מוטבע בא במגע עם המוח הקדמי, במיוחד בחדרים.לאחר מכן, לחתוך 50-100 מיקרומטר עבה חלקים של המוח עד סוף החדר לרוחב, ולהרכיב את החלקים על שקופיות הזכוכית. מניחים את מגלשות הזכוכית על קרח יבש תחת מיקרוסקופ ביתור. הרימו את הפרוסות מהקרח היבש למשך 15 עד 30 שניות כדי להשיג הפשרה קצרה ולא שלמה, מה שהופך את המיאלין הקומפקטי של הסטריאטום לנצפות כנקודות לבנות צפופות.לאחר מכן, באמצעות אזמל מקורר מראש, להפריד את האזור subependymal מן הסטריאטום הסמוך, ולהעביר אותו כמו חתיכה שלמה או מחולק לשניים עד ארבעה חלקים לתוך צינור microcentrifuge באמצעות הקצה קהה של אזמל מקורר. לאחר מכן לעשות את אותו הדבר עבור אזור החדר המדיאלי. כמוסות פנימיות הקשורות למיאלין, גליקופרוטאין חיוביות של הסטריאטום זוהו בדגימות המלאות, אך לעתים רחוקות בדגימות ההקפאה-סעיף-ניתוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה.זיהום סטריאטלי בדגימות כולן אושר על ידי העשרה של חלבוני מיאלין באזור התת-כספי, בהשוואה לדגימות קליפת המוח הסומטו-חושית. לעומת זאת, השוואות של חלבוני סמן מיאלין אלה בדגימות ההקפאה-סעיף-ניתוח לא הראו הבדלים משמעותיים באזור התת-ת-פדנדימלי ובדגימות קליפת המוח הסומאטו-חושית. כאשר משווים את תוצאות הספקטרומטריה של המסה בין ניתוח החלק ההקפאה למיקרודיסקציה של לכידת לייזר, מיקרודיסקציה לכידת לייזר הניבה כמחצית ממספר החלבונים המכונמים, אם כי זמן איסוף הרקמות היה בערך פי שניים.ניתוח רכיבים עקרוני מגלה כי יש שונות גדולה יותר בין דגימות שנאספו עם microdissection לכידת לייזר, המתואר ריבועים, מאשר בין אלה שנאספו עם קריו-קטע-כריתה, המתוארים כעיגולים. בדיקת העשרת ביאורים דו-ממדית בין ניתוח קריו-קטע ללכידת לייזר למיקרודיסקציה לאזורים התת-אפינדימליים והמדיאליים חשפה העשרה דומה בשתי השיטות והאזורים לחלבונים הקשורים למרחב החוץ-תאי. ניתוח החלק של Cryo מספק זיהוי וכימות חזקים יותר של נוירוגנזה בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים הקשורים לאזור תת-אופן.במקרה של טנסין-C, רק קריו-סעיף-ניתוח הציג העשרה באזור תת-ependymal בהשוואה לאזור ependymal המדיאלי. ודא כי קטעי המוח על השקופיות לא להיות מופשר לחלוטין. בסך הכל, זה טוב לתרגל את השלבים בהליך הניתוח לקבלת תוצאה עקבית.שיטת הניתוח יכולה לשמש גם עם שיטות ניתוח חלבונים אחרות שיכולות לזהות בקלות חלבונים בשפע נמוך מאוד, כגון גורמי גדילה וציטוקינים. שיטת מיקרודיסקציה זו אפשרה לנו לזהות רגולטור נוירוגנזה חדש, ואנו מאמינים שהיא תאפשר לאחרים לזהות רגולטורים אחרים של נוירוגנזה בהקשרים שונים.

cryo-section-dissection-adult-subependymal-zone-for-accurate-deep

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בתאי גזע pluripotent הגוברת ההשעיה להתמיין גופים embryoid (EBS). כאן אנו מדגימים כיצד להשיג איכות גבוהה EB cryosections שימושי לחקר ההיבטים תאית ומולקולרית של העובר, תוך שמירה על הארגון שלהם כמו אגרגטים.

ניתוח של בתאי גזע pluripotent באמצעות Cryosections של גופים Embryoid

דופאמין הוא מוסדר בבירור בגרעין המוח התיכון, אשר מכילים תאים הגופות דנדריטים של נוירונים דופאמין. כאן נתאר את הגישה לנתיחה ו מדגם הטיפול על מנת למקסם את התוצאות, ולכן מסקנות ותובנות, על ויסות הדופמין בגרעין המוח התיכון של nigra substantia (SN) ואזור tegmental הגחוני (VTA) במכרסמים.

פרופיל מקיף של הסדרת substantia nigra הדופמין ואזור Tegmental הגחון

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

שיטת אימונוגולד לאחר ההטמעה היא אחת הדרכים היעילות ביותר לספק ניתוחים ברזולוציה גבוהה של לוקליזציה תת-תאית של מולקולות ספציפיות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח כמותי של קולטני גלוטמט בסינפסות סרט הרשתית.

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

הרשתית האנושית מורכבת מולקולרי ושאיכות אזורים הנבדלים זה מזה, לרבות fovea, macula, הרשתית ההיקפית. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות ניקוב ביופסיות להסרה ידנית של רקמות שכבות מן העין האנושית כדי לנתח ולאסוף אלה אזורים הנבדלים זה מזה ברשתית לניתוח פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם.

דיסקציה של הרשתית האנושית ואת RPE-Choroid לניתוח פרוטיאומיה מבנית

מאמר זה מציג פרוטוקול מודולרי עבור ליפידומיקה של רקמות ותעתיק, ושומנים פלזמה במודלים עכבר מחלה נוירולוגית מיקוד שומנים המשמשים דלקת ופעילות עצבית, שומנים ממברנה, שליחים במורד הזרם, ואנזימים קידוד mRNA/קולטנים שבבסיס תפקוד השומנים. הליכי דגימה, עיבוד מדגם, מיצוי וכימות מפורטים.

ליפידומיקה ותעתיק במחלות נוירולוגיות

הליך זה מתאר את אוסף אזורי המוח קפוא בנפרד כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה ו-RNA באמצעות כלים זולים וזמינים בדרך כלל.

אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-קריואיפקס, בה חלבון ממברנה APEX2 מתויג יכול להיות מקומי על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ בתוך מבנה מיטבי משומר התא.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

מקלעת הכורואיד (CP), רקמה שלא נחקרה מספיק במדעי המוח, ממלאת תפקיד מפתח בבריאות ובמחלות של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקת מיקרודיסקציה לבידוד CP ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לקבל מבט כולל על המבנה התאי שלו.

מיקרודיסקציה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק הר שלם הדמיה של מקלעת כורואיד עכבר

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי &lt; 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

למד שיטת קריו-סקשן-דיסקשן לבידוד מדויק של נישה נוירוגנית בחדרי המוח בעכברים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח פרוטאום כמותי עמוק עם מינימום פגיעה ברקמה וזיהוי רגולטורים חדשים של נוירוגנזה.

ניתוח החלק ההקפאה של האזור התת-כספי למבוגרים לניתוח פרוטאום כמותי מדויק ועמוק

גלה סרטונים נוספים