בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

כאן, אנו מדגימים את הפרוטוקול שלנו של בידוד תאים סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר או בידוד LSECs. הפרוטוקול מורכב מזיוף קולגן בכבד ואולטרה-צנטריפוגציה במהירות נמוכה לטיהור תאים שאינם פרנכימליים ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. שיטת הבידוד LSEC שלנו יעילה ביותר וישימה לכבד עכברים בריא וחולה.

ה-LSECs המבודדים מציגים טוהר גבוה ומשמרים את המבנה והתפקוד. LSECs המבודדים באמצעות פרוטוקול זה הם אופטימליים למחקרים פונקציונליים ומולקולריים ולהפקת נתונים מרובי אומיקה. פרוטוקול זה יעזור לחקר התקשורת הבין-תאית בכבד.

התחילו בציפוי מנות תרבית באורך 10 ס"מ בשלושה מיליליטרים של תמיסת קולגן. לאחר מכן, דגירה את הכלים בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לאחר שעה, הסר את הנוזל העודף מהמשטח המצופה.

שטפו את הכלים עם PBS שלוש פעמים ואפשרו להם להתייבש באוויר. הגדירו את מנגנון ההעתקה המחומם והלח. יש לשטוף את מערכת הזלוף באמצעות 10% אקונומיקה למשך חמש דקות.

לאחר מכן, יש לשטוף את המערכת שוב במים סטריליים למשך 10 דקות נוספות. מסננים את נוזל השטיפה ככל האפשר לפני ההחדרה לתמיסת קולגן. מחדירים את תמיסת הקולגאזאז דרך מערכת הזלוף כדי לחמם אותה מראש ל-37 מעלות צלזיוס.

הגדר את קצב המשאבה למהירות אחת בחוגת בקרת המהירות. שמור על המהירות זהה לאורך כל ההליך. שקול את העכבר לצורך ההליך.

לאחר מכן הצמידו אותו למשטח הניתוחי. מרססים את בטן העכבר ב-70% אתנול. באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך של כחמישה סנטימטרים החל מהחלק התחתון של הבטן ועד לתהליך xiphoid.

לאחר מכן, לעשות שני חתכים לרוחב באמצעות מספריים קשתית קטנה בכל צד של הבטן כדי לחשוף את איברי הבטן באופן מלא. מניחים את הנדן של קטטר האינפוזיה מתחת לגב החיה כדי להרים וליישר את הבטן. באמצעות מלקחיים קבועים של חבישה מעוקלת, משכו בעדינות את המעיים ואת הבטן משמאל לבעל החיים.

לאחר מכן, הניחו תפר כירורגי 5-0 מתחת לווריד הנבוב התחתון, או IVC, ממש מתחת לכליה השמאלית החשופה. קשרו תקלה רופפת בתפר. לאחר מכן, הניחו עוד תפר כירורגי 5-0 סביב וריד פורטל הכבד.

מניחים את התפר ממש מעל נקודת ההסתעפות של וריד הטחול של וריד פורטל הכבד. שוב, קשרו תקלה רופפת בתפר. תוך שימוש בתפר הווריד הפורטלי כמתח, הכניסו את הצנתר IV בעל 20 המדים לווריד פורטל הכבד סנטימטר אחד מתחתיו, שם הוא מסתעף לווריד פורטל הכבד הימני והשמאלי.

לאחר מכן, החליקו את הצנתר במעלה הווריד, אך שמרו אותו מתחת לאזור ההסתעפות. אפשרו לדם לנוע במורד הצנתר עד שהוא מתחיל לטפטף החוצה. אבטח את קטטר IV עם תפר הווריד הפורטלי.

השתמש בקו IV כדי לחבר בקבוק IV עם חיץ A לצנתר. לאחר מכן, לשטוף את הכבד עם פתרון זה תוך הימנעות כניסת אוויר לתוך המערכת. קשרו את התפר סביב ה-IVC שמתחת לכליה.

לאחר מכן, חותכים את ה- IVC מתחת לתפר כדי לאפשר לבעל החיים לדמם החוצה. לאחר ההחדרה, חתכו את הקיבה, המעיים, הטחול ושאר הפתחים המחוברים לכבד. לאחר מכן, חתכו את הסרעפת ואת כלי הדם העיקריים מחלל בית החזה.

מוציאים את הכבד מבעל החיים ומניחים אותו על מגש הזלוף. יש להסיר בזהירות את קו ה- IV ולחבר את תמיסת הקולגןאז בתא המשחזר. אפשרו לכבד לחלחל עד שהקפסולה תהפוך למודל ותיראה מטושטשת.

זה אמור להימשך בדרך כלל 10 עד 15 דקות. לאחר העיכול, מוציאים את הכבד מהתא ומניחים אותו על צלחת פטרי באורך 10 ס"מ עם כ-20 מיליליטר של DMEM ללא סרום. לקטוף בעדינות את הכבד עם כמה קצוות פיפטה ולהשליך את עץ המרה.

לאחר מכן, לסנן את תרחיף הכבד דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה של השעיית התא ב-50 פעמים G למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לאסוף את supernatant המכיל תאים כבד שאינם parenchymal.

צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לאסוף את גלולת התא ולהחיות אותו במיליליטר אחד של חיץ בידוד. קבע את מספר התא באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.

לאחר מכן, צנטריפוגה את מתלה התא. לשאוף את הסופרנטנט לחלוטין ולהחזיר את הכדור עם 90 מיקרוליטרים של מאגר בידוד לכל 10 מיליון תאים. הוסף 10 מיקרוליטרים של CD146 MicroBeads לכל 10 מיליון תאים בסך הכל.

מערבבים אותו היטב ודוגרים במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לשטוף את התאים, הוסיפו אחד עד שני מיליליטרים של מאגר בידוד לכל 10 מיליון תאים. צנטריפוגה הפתרון ב 300 פעמים G במשך 10 דקות.

לאחר מכן, שאפו את הסופרנאטנט לחלוטין והחזירו עד מיליארד תאים ב-500 מיקרוליטרים של מאגר בידוד. לאחר מכן, הכינו את עמוד ההפרדה על ידי שטיפתו בשלושה מיליליטרים של מאגר בידוד. החל את מתלה התא על העמודה הערומה עם מסנני קדם-הפרדה של 70 מיקרומטר.

לשטוף את העמוד עם שלושה מיליליטרים של חיץ בידוד שלוש פעמים. לאחר מכן, הסר את העמוד מהמפריד והנח אותו על צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. פיפט חמישה מיליליטרים של חיץ בידוד על העמוד.

כדי לשחזר את התאים המסומנים בחרוזים מגנטיים, דחפו בחוזקה את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים. לבסוף, צנטריפוגה של התאים ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. טוהר LSECs מבודדים וסמני פני השטח הוערכו באמצעות ציטומטריית זרימה.

ניתוח נתונים ואסטרטגיית גידור עבור LSECs וסינגלטים מגודרים מבוססים על נתוני פיזור קדימה ופיזור צד. LSECs מבודדים הוכתמו בצבע כדאיות ושילוב של נוגדנים CD45, CD146 ו-Stabilin-2. LSECs בני קיימא היו מגודרים על אוכלוסייה שלילית CD45 ונותחו עבור ביטוי CD146 ו- Stabilin-2.

מנתונים אלה, אושר כי LSECs מבודדים היה יותר מ 94% כדאיות ו יותר מ 90% טוהר. הפנוטיפ הספציפי ל-LSEC של התאים המבודדים אושר עוד יותר באמצעות מיקרוסקופיית אור ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק. LSECs מבודדים עברו תרבית במדיום הצמיחה המלא במשך שש שעות ונבחנו על ידי מיקרוסקופיית אור.

החצים הלבנים בתמונת SEM מציינים את LSEC fenestrae, שהוא מאפיין מורפולוגי אופייני של LSECs. הצעדים הקריטיים להבטחת זלוף מלא של רקמת הכבד הם מיקום נכון של סרט קטטר, הימנעות מהכנסת אוויר לצנתר, והתזמון האופטימלי של עיכול הקולגנאז. LSEC באיכות גבוהה שנרכשה באמצעות הפרוטוקול שלנו תקל על זיהוי המנגנון המולקולרי של תפקוד LSEC ותשפר את הבנתנו את תפקידם בתקשורת בין-תאית בכבד, בבריאות ובמחלות.