Name: בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: למדו שיטה לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים מכבד עכבר באמצעות פרפוזיה עם קולגנאז ובחירה באמצעות חרוזים מגנטיים CD146. השיטה מספקת טוהר של מעל 90% ושימור תפקודי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של ה- NIH (1RO1DK122948 ל- SHI) ומנגנון המענקים של NIH Silvio O. Conte לחקר מחלות עיכול P30 (DK084567). תמיכה ניתנה גם ל- KF על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מלגות מחקר בחו"ל. אנו רוצים גם להודות לד"ר גרגורי ג'יי ג'יי גורס וסטיבן ברונק על התכנון והאופטימיזציה המקוריים שלהם של מנגנון פיזור הקולגנאז.

פרוטוקולים של בעלי חיים נערכו כפי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מאיו קליניק. עכברים זכרים C57BL/6J בני שמונה שבועות נרכשו ממעבדת ג'קסון. העכברים שוכנו במתקן מחזור בהיר-כהה מבוקר טמפרטורה של 12:12 שעות עם גישה חופשית לתזונה.
1. הכנת צלחת או צלחת תרבית מצופה קולגן
<ol><li>כדי לייצר 50 מ"ל של חומצה אצטית של 0.02 מול/ל', יש להוסיף 0.6 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית ל-49.4 מ"ל של H2O.</li>
	<li>הכינו 50 מיקרוגרם/מ"ל קולגן מסוג I בחומצה אצטית 0.02 מול/ל'. הדילול תלוי בריכוז המגרש.</li>
	<li>מצפים מנות תרבית 10 ס"מ עם תמיסת קולגן של 3 מ"ל. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת. הערה: בעת שימוש בצלחת או צלחת אחרת לתרבית, יש להתאים את נפח תמיסת הציפוי בהתאם לאזור התרבית, בדרך כלל להשתמש ב- 6-10 מיקרוגרם / ס"מ2.</li>
	<li>יש להסיר את הנוזל העודף מהמשטח המצופה, ולשטוף עם מלח עם גוש פוספט (PBS) 3 פעמים. אפשרו לכלים להתייבש באוויר.</li>
	<li>אם תמיסת הקולגן אינה סטרילית, עיקרו את הכלים המצופה בקולגן על ידי חשיפה לאור אולטרה סגול (UV) למשך 10 דקות במכסה אדים של תרבית רקמה סטרילית.</li>
</ol>2. הגדרת ציוד
<ol><li>הגדירו את מנגנון הזלוף המחומם והלח, כפי שמוצג באיור 1B.</li>
	<li>שטפו את מערכת הזלוף באמצעות 10% אקונומיקה למשך 5 דקות ולאחר מכן מים סטריליים למשך 10 דקות נוספות.</li>
	<li>מסננים את נוזל השטיפה ככל האפשר לפני שאתם מנקבים את תמיסת הקולגנאז.</li>
	<li>החדירו תמיסת קולגןאז דרך מערכת הזלוף (כפי שמוצג באיור 1B) כדי לחמם אותה מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הגדר את קצב המשאבה במהירות 1 כפי שמוצג בחוגת בקרת המהירות (שווה ערך ל- 40 מ"ל לדקה).</li>
	<li>שמור על מהירות זו זהה לאורך כל ההליך. יש לעשות שימוש חוזר בתמיסת הקולגאז הפועלת במעגל סגור במהלך יום הבידוד של LSEC. הערה: מהירות המשאבה קבועה על 1 כדי למנוע לחץ מכני שעלול להפריע למצב הביולוגי של LSECs.</li>
</ol>3. הליך כירורגי
<ol><li>שקלו את העכבר.</li>
	<li>יש להזריק 90 מ"ג/ק"ג משקל גוף של קטמין ומשקל גוף של 10 מ"ג/ק"ג של קסילאזין תוך-צפקי (IP).</li>
	<li>ברגע שהעכבר אינו פעיל לגירויים כואבים, הצמידו את העכבר למשטח הניתוח, כפי שניתן לראות באיור 1B.</li>
	<li>מרססים את בטן העכבר ב-70% אתנול. באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך באורך של כ -5 ס"מ החל מהחלק התחתון של הבטן ועד לתהליך xiphoid.</li>
	<li>לאחר מכן, לעשות שני חתכים לרוחב באמצעות מספריים קשתית קטנה בכל צד של הבטן כדי לחשוף באופן מלא את איברי הבטן.</li>
	<li>מניחים את הנדן של הצנתר התוך ורידי (IV) מתחת לגב החיה כדי להרים וליישר את הבטן.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים קבועים של חבישה מעוקלת, משכו בעדינות את המעיים ואת הבטן משמאל לבעל החיים.</li>
	<li>מניחים תפר כירורגי 5-0 מתחת לווריד הנבוב התחתון (IVC) ממש מתחת לכליה השמאלית החשופה. קשרו תקלה רופפת בתפר.</li>
	<li>מניחים עוד תפר כירורגי 5-0 סביב וריד פורטל הכבד (PV) ממש מעל נקודת ההסתעפות של וריד הטחול מה-PV הכבדי. קשרו תקלה רופפת בתפר.</li>
	<li>באמצעות תפר PV כמתח, הכנס את קטטר 20 G IV בכבד PV 1 ס"מ מתחת למקום שבו הוא מסתעף ימינה ושמאלה PV כבד.</li>
	<li>החליקו את הצנתר במעלה הווריד אך שמרו אותו מתחת לאזור ההסתעפות. אפשרו לדם לנוע במורד הצנתר עד שהוא מתחיל לטפטף החוצה.</li>
	<li>עם חלק מהמאגר A (טבלה 1) בבקבוק תוך ורידי (IV) הממוקם מעל האזור הניתוחי, השתמש בקו עירוי והצמד אותו לצנתר. יש לשטוף את הכבד בתמיסה זו תוך הימנעות מכניסת אוויר למערכת.</li>
	<li>קשרו את התפר סביב הווריד הנבוב התחתון מתחת לכליה. זה יאפשר לכבד לחדור רטרו.</li>
	<li>חותכים את ה-IVC מתחת לתפר כדי לאפשר לבעל החיים לדמם החוצה. הערה: שלב זה חייב להתבצע במהירות כדי למנוע גודש של הכבד.</li>
	<li>אבטחו את צנתר ה-IV עם תפר ה-PV.</li>
	<li>לאחר ההחדרה, חותכים את הקיבה, המעיים, הטחול ושאר הפתחים המחוברים לכבד.</li>
	<li>חותכים את הסרעפת ואת כלי הדם העיקריים מחלל בית החזה. מוציאים את הכבד מבעל החיים ומניחים אותו על מגש הזלוף.</li>
	<li>יש להסיר בזהירות את קו ה- IV ולחבר את תמיסת הקולגןאז בתא המשחזר. הערה: שלבים 3.16-3.18 צריכים להיעשות תוך 5 דקות, כך שהכבד לא יוחדר זמן רב מדי עם Buffer A. היזהר מאוד לא לאפשר בועות אוויר לתוך הכבד.</li>
	<li>אפשרו לכבד לחלחל עד שהקפסולה הופכת מנומרת ונראית מטושטשת (10-15 דקות או יותר, המחזור משתנה בהתאם למגוון ההמון של הקולגנאז).</li>
	<li>בזמן שהכבד נמצא בזלוף, יש לוודא שבעל החיים מת לפני השלכתו בשקית נמק.</li>
	<li>לאחר העיכול, מוציאים את הכבד מהתא ומניחים אותו בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ עם כ-20 מ"ל של מדיום הנשרים המהונדסים (DMEM) של דולבקו ללא סרום.</li>
	<li>לקטוף בעדינות את הכבד עם כמה קצוות פיפטה ולהשליך את עץ המרה.</li>
	<li>מסננים את תרחיף הכבד דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה תרחיף התא ב 50 x g במשך 2 דקות ב- RT. לאסוף את supernatant המכיל תאים כבדים שאינם פרנצ'ימליים. הערה: הפטוציטים מואצים בכדור, אשר ניתן לטהר עוד יותר באמצעות צנטריפוגה גרדיאנט כפי שתואר קודם לכן15.</li>
</ol>4. הפרדת תאי כבד לא-פרנצ'ימליים וטיהור LSECs
הערה: טהרו את ה-CD146+ LSECs באמצעות החרוזים האימונומגנטיים, בהתאם להוראות היצרן.
<ol><li>צנטריפוגה את supernatant ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>אסוף את גלולת התא ובצע החייאה ב- 1 מ"ל של מאגר בידוד (טבלה 1), קבע את מספר התא באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C, לשאוף את supernatant לחלוטין.</li>
	<li>בצעו החייאה של הכדור עם 90 μL של מאגר בידוד לכל 107 תאים בסך הכל.</li>
	<li>הוסף 10 μL של חרוזים מגנטיים CD146 לכל 107 תאים בסך הכל. מערבבים היטב ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כדי לשטוף את התאים, להוסיף 1-2 מ"ל של מאגר בידוד לכל 107 תאים, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשאוף את supernatant לחלוטין.</li>
	<li>יש לבצע שימוש חוזר של עד 109 תאים ב-500 μL של מאגר בידוד (טבלה 1). הערה: עבור מספרי תאים גבוהים יותר, הגדל את נפח המאגר בהתאם.</li>
	<li>הכן את עמוד ההפרדה, שטפו אותו עם 3 מ"ל של חיץ בידוד.</li>
	<li>החל את תרחיף התא על העמודה הערומה עם מסנני קדם-הפרדה של 70 מיקרומטר.</li>
	<li>שטפו את העמודה עם 3 מ"ל של מאגר בידוד 3 פעמים. הערה: בעת שטיפת העמודה, יש להוסיף את מאגר הבידוד ברגע שמאגר העמודות מתרוקן.</li>
	<li>הסר את העמודה מהמפריד והנח אותה על צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. פיפט 5 מ"ל של חיץ בידוד על העמודה.</li>
	<li>כדי לשחזר את החרוזים המגנטיים המסומנים בתאים, דחפו בחוזקה את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. LSECs מוכנים לבדיקה מיקרוסקופית וניתוח במורד הזרם.</li>
</ol>5. LSECs אימונופנוטיפ והערכת טוהר על ידי ציטומטריית זרימה
<ol><li>קבע את מספרי התאים של LSECs מבודדים באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 300 x g במשך 5 דקות, לשאוף את supernatant לחלוטין.</li>
	<li>קח 1 x 106 תאים / צינור ו resuspend עם 90 μL של מאגר צביעה (טבלה 1).</li>
	<li>הוסף 10 μL / שפופרת של בלוק FcR עכבר ו 1 μL של צבע כדאיות, דגירה ב 4 ° C למשך 10 דקות.</li>
	<li>הכתימו את התאים בשילוב של נוגדני CD45, CD146 ו-stabilin-2 המדוללים בשעה 1:50 עם מאגר צביעה. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של חיץ צביעה וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשאוף את supernatant לחלוטין.</li>
	<li>בצעו החייאה של התאים עם 300 μL של מאגר צביעה והעבירו דרך ציטומטר הזרימה.</li>
</ol>6. תרבות ובחינה של LSECs
<ol><li>זרע 1 x 106 תאים/באר בצלחת של 6 בארות ותרביב אותו עם מדיום גדילה של תאי אנדותל המורכב מ-5% סרום בקר עוברי (FBS), תוסף גדילה של תאי אנדותל 1% ותמיסת פרימוצין של 1%.</li>
	<li>בחנו את ה-LSECs המבודדים על ידי מיקרוסקופיית אור. רכוש תמונות בשדה בהיר עם הגדלה של פי 10.</li>
</ol>7. מורפולוגיה של LSECs ובדיקת fenestrae על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים
<ol><li>ציפוי מראש של תרבית התאים (גודל נקבובית של 3 מיקרומטר) בתמיסת קולגן.</li>
	<li>LSECs מבודדים בתרבית (120,000 תאים) על התוספת עם מדיום גדילה של תאי אנדותל בצלחת של 24 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס חמה ולחה. אפשרו לתאים להתיישב ולהיצמד למשך שעתיים.</li>
	<li>לקיבוע תאים, הוסיפו נפח שווה ערך של 37 מעלות צלזיוס המקבע של טראמפ לתקשורת תרביות התאים.</li>
	<li>לאחר הדגירה במשך 10 דקות, החליפו 50% מהקיבעון המדולל של טראמפ בקיבעון של טראמפ.</li>
	<li>לתקן את התאים ב-Trump fixative במשך 2 שעות, ואז לדגום במשך שעה אחת ב-1% אוסמיום טטרוקסידים.</li>
	<li>המשך עם התייבשות הדגימות, ייבוש בהתקן ייבוש נקודה קריטית, הרכבה, ציפוי ניתור ובדיקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.</li>
</ol>

<ol><li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells%3A+isolation%2C+purification%2C+characterization+and+interaction+with+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Revisiones+Sobre+Biologia+Celular%3A+RBC%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li>
<li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li>
<li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells%3A+Physiology+and+role+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li>
<li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li>
<li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li>
<li>Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li>
<li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li>
<li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation%3A+Cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li>
<li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), Basel. 395(2020).</li>
<li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li>
<li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945(2016).</li>
<li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li>
<li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li>
<li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+%CE%B2%281%29-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li>
<li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599(2013).</li>
<li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li>
<li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284(2021).</li>
<li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cell%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li>
<li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649(2019).</li>
<li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice%3A+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li>
<li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li>
<li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li>
<li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li>
<li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors%2C+cytokines%2C+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060(2015).</li>
<li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells%3A+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li>
<li>Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll%2C+and+selective+substrate+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li>
<li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+CD146%2FMCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li>
<li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356(2017).</li>
<li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li>
</ol>

לכל המחברים אין קונפליקטים לחשוף.

בכתב היד הנוכחי אנו מתארים פרוטוקול לבידוד LSEC מכבד עכברים המורכב מפרפוזיית קולגןאז דו-שלבית ומיון תאים המופעלים על ידי מגנטית (MACS) לאחר מכן. פרוטוקול זה מורכב משלושת השלבים הבאים: (1) פרפוזיה דרך ה-PV עם מאגר נטול סידן ואחריו מאגר המכיל קולגן כדי להשיג פיזור תאי כבד; (2) הרחקה של הפטוציטים עם צנטריפוגה במהירות נמוכה; ו-(3) בחירה חיובית מבוססת MACS של LSECs מתאים לא-פרנצ'ימליים (NPCs) באמצעות חרוזים מגנטיים נגד CD146. ניתן היה להשלים את כל ההליך תוך 3 שעות. יתר על כן, העלות עבור הליך זה, כולל כל החומרים המתכלים, היא ב...

תאי אנדותל סינוסואידליים בכבד (LSECs) מרפדים את דפנות הסינוסואידים הכבדים והם התאים הלא-פרנכימליים הנפוצים ביותר בכבד1. LSECs נבדלים מתאי אנדותל נימיים אחרים במקומות אחרים בגוף על ידי נוכחות של fenestrae והיעדר קרום מרתף קלאסי או דיאפרגמה 2,3. לפיכך, LSECs הם בעלי מאפיינים פנוטיפיים ומבניים ייחודיים המשפרים את חדירותם ואת יכולתם האנדוציטית לחסל מגוון של מקרומולקולות במחזור הדם, כולל שומנים וליפופרוטאינים. LSECs ממלאים תפקיד מרכזי בהצלבה בין תאים פרנכימליים ולא-פרנצ'ימליים, כגון תאי סטלה ותאי מערכת החיסון. LSECs הם המפתח לשמירה על הומאוסטזיס בכבד על ידי שמירה על תאי הסטלטים ותאי קופפר במצבשקט 4. LSECs מווסתים את הרכב אוכלוסיות תאי החיסון בכבד על ידי תיווך הידבקות והגירה טרנס-אנדותל של לויקוציטים במחזור 5,6. במהלך פגיעה חריפה וכרונית בכבד7, כולל פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI)8, סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH)9, וקרצינומה הפטוצלולרית (HCC), LSECs עוברים שינויים פנוטיפיים הידועים בשם קפילאריזציה המאופיינים בהתגוננות והיווצרות של קרום מרתף10. שינויים פנוטיפיים אלה ב-LSECs קשורים לתפקוד לקוי של LSECs ולרכישת תכונות פרותרומבוטיות, פרו-דלקתיות ופרופילוגניות.
מספר שיטות לבידוד של LSECs מכבד העכבר פותחו11. טכניקות מסוימות תלויות בהפרדת תאים לא-פרנכימליים ופרנכימליים ולאחר מכן צנטריפוגת גרדיאנט צפיפות כדי לטהר את ה-LSECs משברים לא-פרנצ'ימליים. המגבלה של שיטה זו היא נוכחות של מקרופאגים מזהמים בשלבים האחרונים של בידוד LSECs, אשר יכול להשפיע על טוהר של LSECsמבודדים 12. פרוטוקול זה מבוסס על זלוף קולגןאז של כבד העכבר ועל בחירה חיובית של חרוזים מגנטיים CD146+ של תאים לא-פרנצ'ימליים לטיהור LSECs. LSECs שבודדו בשיטה זו מראים טוהר גבוה ומורפולוגיה ומשומרת וכדאיות. LSECs אלה הם אופטימליים למחקרים פונקציונליים, כולל בדיקת חדירות והידבקות, כמו גם מחקרים במורד הזרם עבור מסלולי עניין. יתר על כן, עם העניין הגובר ביצירת מערכי ביג דאטה הן במחקר קליני והן במדע הגילוי, ניתן לאגד או להשתמש בנפרד ב-LSECs באיכות גבוהה אלה המבודדים מכבדים בריאים וחולים עם סטאטוהפטיטיס לא-אלכוהולית (NASH) או מצבים אחרים, מה שמאפשר יצירת נתונים מרובי-אומיקה והשוואה בין בריאות למחלות 13,14 . בנוסף, ניתן להשתמש ב-LSECs המבודדים כדי לפתח מודלים דו-ממדיים כמו גם תלת-ממדיים במבחנה כמו אורגנואידים כדי לפענח את מסלול האיתות המופעל ב-LSECs ואת התקשורת הבין-תאית שלהם עם תאי כבד אחרים תחת גירויים רעילים שונים ובתגובה להתערבויות טיפוליות שונות.

<table><tbody><tr><td>2.0 אינץ' 20 גרם קטטר תוך ורידי (IV)</td><td>Terumo, SOmerset, NJ, ארה"ב</td><td>SR-OX2051CA</td><td></td></tr><tr><td>2&ndash; מגש פרפויון בגודל 3 אינץ' עם חור במרכז</td><td></td><td></td><td>מותאם אישית; תוצרת בית</td></tr><tr><td>405/520 צבע כדאיות</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, גרמניה</td><td>130-110-205</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים רגילים בגודל 4 אינץ'</td><td>Fisher Brand</td><td>FS16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>5-0 תפר משי פרמה-יד</td><td>Ethicon, Raritan, NJ, ארה"</td>ב <td>A182H</td><td></td></tr><tr><td>Anti-stabilin-2 (עכבר) mAb-Alexa Fluor&אטילדה; 488</td><td>MBL International , וובורן, MA, ארה"ב</td><td>D317-A48</td><td></td></tr><tr><td>BSA stock</td><td>Miltenyi , ברגש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, נגד עכבר</td><td>Miltenyi , ברגיש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-118-407</td><td></td></tr><tr><td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td><td>Miltenyi , ברגש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-Viogreen, נגד עכבר</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, גרמניה</td><td>130-110-803</td><td></td></tr><tr><td>קולגן מסוג I</td><td>קורנינג, קורנינג, ניו יורק, ארה"ב</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז II</td><td>Gibco, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>מדיום גידול תאי אנדותל</td><td>מעבדות מחקר ScienCell, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב</td><td>211-500</td><td></td></tr><tr><td>מגיב חוסם FCR, עכבר</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, גרמניה</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת FlowJo, גרסה 10.6</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים מוקשים</td><td>F.S.T, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב</td><td>14091-11</td><td></td></tr><tr><td>מחומם (37 & deg; ג) ומנגנון זלוף מחזור לח המצויד בהזרקת חמצן בקצב של 10psi.</td><td></td><td></td><td>מותאם אישית; תוצרת בית</td></tr><tr><td>היטאצ'י S 4700 מיקרוסקופ אלקטרונים סורק</td><td>היטאצ'י בע"מ, פלזנטון, קליפורניה, ארה"</td>ב <td>SEM096</td><td></td></tr><tr><td>עמודות LS</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, גרמניה</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>מסנני הפרדה מוקדמים של MACS (70 &mu; m)</td><td>Miltenyi , ברגש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>מאגר שטיפה MACS</td><td>Miltenyi , ברגש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>מסננת חכמה MACS (70 &mu; m)</td> <td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, גרמניה</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>MACSQunt flow</td><td>cytometer Miltenyi, Bergisch Gladbach, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Insert</td><td>Millipore Sigma, ברלינגטון, MA, ארה"ב</td><td>PITP01250</td><td></td></tr><tr><td>Nexcelom cell counter</td><td>Nexcelom bioscience, לורנס, MA, ארה"ב</td><td>צלומטר אוטומטי T4 פלוס</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare, שיקגו, אילינוי, ארה"ב</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>F.S.T, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים קטנים מאוד</td><td>F.S.T, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב</td><td>11063-07</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

תאי אנדותל סינוסואידליים בכבד (LSECs) הם תאי אנדותל מיוחדים הממוקמים בממשק שבין מחזור הדם לבין הפרנכימה של הכבד. ל-LSECs יש מורפולוגיה מובחנת המאופיינת בנוכחות של fenestrae ובהיעדר קרום מרתף. LSECs ממלאים תפקידים חיוניים בהפרעות פתולוגיות רבות בכבד, כולל חוסר ויסות מטבולי, דלקת, פיברוזיס, אנגיוגנזה וקרצינוגנזה. עם זאת, מעט מאוד פורסם על הבידוד והאפיון של LSECs. כאן, פרוטוקול זה דן בבידוד של LSEC מעכברים בריאים ולא אלכוהוליים של מחלת כבד שומני (NAFLD). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן של כבד העכבר ועל בחירה חיובית של חרוזים מגנטיים של תאים לא-פרנצ'ימליים לטיהור LSECs. מחקר זה מאפיין LSECs באמצעות סמנים ספציפיים על ידי ציטומטריה של זרימה ומזהה את התכונות הפנוטיפיות האופייניות על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים. LSECs שבודדו בעקבות פרוטוקול זה יכולים לשמש למחקרים פונקציונליים, כולל מבחני הידבקות וחדירות, כמו גם מחקרים במורד הזרם עבור מסלול עניין מסוים. בנוסף, ניתן לאגד או להשתמש ב-LSECs אלה בנפרד, מה שמאפשר יצירת נתונים מרובי-אומיקות, כולל תפזורת RNA-seq או תא בודד, פרוטאומי או פוספו-פרוטאומיקה, ובדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז באמצעות ריצוף (ATAC-seq), בין היתר. פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור חוקרים החוקרים את התקשורת של LSECs עם תאי כבד אחרים בבריאות ובמחלות ויאפשר הבנה מעמיקה של תפקידם של LSECs במנגנונים הפתוגניים של פגיעה חריפה וכרונית בכבד.

שרטוטים ניסיוניים והתקנת ציוד: בפרוטוקול זה, כבד העכברים עוכל באמצעות מעגל פרפוזיה סגור, ואז תאים לא-פרנצ'ימליים והפטוציטים הופרדו על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ב-50 x g במשך 2 דקות. LSECs ראשוניים בודדו באמצעות בחירת חרוזים מגנטיים CD146 מהשבר הלא-פרנצ'ימלי. הסכימות הניסיוניות מוצגות באיור 1A. הצינורית הונחה דרך ה-PV בזמן שהווריד הנבוב התחתון נקשר כדי להבטיח זילוף חד-כיווני של קולגן דרך הכבד (איור 1B). תא הזלוף הפנימי מצויד במערכת ...

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

כאן, אנו מדגימים את הפרוטוקול שלנו של בידוד תאים סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר או בידוד LSECs. הפרוטוקול מורכב מזיוף קולגן בכבד ואולטרה-צנטריפוגציה במהירות נמוכה לטיהור תאים שאינם פרנכימליים ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. שיטת הבידוד LSEC שלנו יעילה ביותר וישימה לכבד עכברים בריא וחולה.ה-LSECs המבודדים מציגים טוהר גבוה ומשמרים את המבנה והתפקוד. LSECs המבודדים באמצעות פרוטוקול זה הם אופטימליים למחקרים פונקציונליים ומולקולריים ולהפקת נתונים מרובי אומיקה. פרוטוקול זה יעזור לחקר התקשורת הבין-תאית בכבד.התחילו בציפוי מנות תרבית באורך 10 ס"מ בשלושה מיליליטרים של תמיסת קולגן. לאחר מכן, דגירה את הכלים בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לאחר שעה, הסר את הנוזל העודף מהמשטח המצופה.שטפו את הכלים עם PBS שלוש פעמים ואפשרו להם להתייבש באוויר. הגדירו את מנגנון ההעתקה המחומם והלח. יש לשטוף את מערכת הזלוף באמצעות 10% אקונומיקה למשך חמש דקות.לאחר מכן, יש לשטוף את המערכת שוב במים סטריליים למשך 10 דקות נוספות. מסננים את נוזל השטיפה ככל האפשר לפני ההחדרה לתמיסת קולגן. מחדירים את תמיסת הקולגאזאז דרך מערכת הזלוף כדי לחמם אותה מראש ל-37 מעלות צלזיוס.הגדר את קצב המשאבה למהירות אחת בחוגת בקרת המהירות. שמור על המהירות זהה לאורך כל ההליך. שקול את העכבר לצורך ההליך.לאחר מכן הצמידו אותו למשטח הניתוחי. מרססים את בטן העכבר ב-70% אתנול. באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך של כחמישה סנטימטרים החל מהחלק התחתון של הבטן ועד לתהליך xiphoid.לאחר מכן, לעשות שני חתכים לרוחב באמצעות מספריים קשתית קטנה בכל צד של הבטן כדי לחשוף את איברי הבטן באופן מלא. מניחים את הנדן של קטטר האינפוזיה מתחת לגב החיה כדי להרים וליישר את הבטן. באמצעות מלקחיים קבועים של חבישה מעוקלת, משכו בעדינות את המעיים ואת הבטן משמאל לבעל החיים.לאחר מכן, הניחו תפר כירורגי 5-0 מתחת לווריד הנבוב התחתון, או IVC, ממש מתחת לכליה השמאלית החשופה. קשרו תקלה רופפת בתפר. לאחר מכן, הניחו עוד תפר כירורגי 5-0 סביב וריד פורטל הכבד.מניחים את התפר ממש מעל נקודת ההסתעפות של וריד הטחול של וריד פורטל הכבד. שוב, קשרו תקלה רופפת בתפר. תוך שימוש בתפר הווריד הפורטלי כמתח, הכניסו את הצנתר IV בעל 20 המדים לווריד פורטל הכבד סנטימטר אחד מתחתיו, שם הוא מסתעף לווריד פורטל הכבד הימני והשמאלי.לאחר מכן, החליקו את הצנתר במעלה הווריד, אך שמרו אותו מתחת לאזור ההסתעפות. אפשרו לדם לנוע במורד הצנתר עד שהוא מתחיל לטפטף החוצה. אבטח את קטטר IV עם תפר הווריד הפורטלי.השתמש בקו IV כדי לחבר בקבוק IV עם חיץ A לצנתר. לאחר מכן, לשטוף את הכבד עם פתרון זה תוך הימנעות כניסת אוויר לתוך המערכת. קשרו את התפר סביב ה-IVC שמתחת לכליה.לאחר מכן, חותכים את ה- IVC מתחת לתפר כדי לאפשר לבעל החיים לדמם החוצה. לאחר ההחדרה, חתכו את הקיבה, המעיים, הטחול ושאר הפתחים המחוברים לכבד. לאחר מכן, חתכו את הסרעפת ואת כלי הדם העיקריים מחלל בית החזה.מוציאים את הכבד מבעל החיים ומניחים אותו על מגש הזלוף. יש להסיר בזהירות את קו ה- IV ולחבר את תמיסת הקולגןאז בתא המשחזר. אפשרו לכבד לחלחל עד שהקפסולה תהפוך למודל ותיראה מטושטשת.זה אמור להימשך בדרך כלל 10 עד 15 דקות. לאחר העיכול, מוציאים את הכבד מהתא ומניחים אותו על צלחת פטרי באורך 10 ס"מ עם כ-20 מיליליטר של DMEM ללא סרום. לקטוף בעדינות את הכבד עם כמה קצוות פיפטה ולהשליך את עץ המרה.לאחר מכן, לסנן את תרחיף הכבד דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה של השעיית התא ב-50 פעמים G למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לאסוף את supernatant המכיל תאים כבד שאינם parenchymal.צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לאסוף את גלולת התא ולהחיות אותו במיליליטר אחד של חיץ בידוד. קבע את מספר התא באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.לאחר מכן, צנטריפוגה את מתלה התא. לשאוף את הסופרנטנט לחלוטין ולהחזיר את הכדור עם 90 מיקרוליטרים של מאגר בידוד לכל 10 מיליון תאים. הוסף 10 מיקרוליטרים של CD146 MicroBeads לכל 10 מיליון תאים בסך הכל.מערבבים אותו היטב ודוגרים במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לשטוף את התאים, הוסיפו אחד עד שני מיליליטרים של מאגר בידוד לכל 10 מיליון תאים. צנטריפוגה הפתרון ב 300 פעמים G במשך 10 דקות.לאחר מכן, שאפו את הסופרנאטנט לחלוטין והחזירו עד מיליארד תאים ב-500 מיקרוליטרים של מאגר בידוד. לאחר מכן, הכינו את עמוד ההפרדה על ידי שטיפתו בשלושה מיליליטרים של מאגר בידוד. החל את מתלה התא על העמודה הערומה עם מסנני קדם-הפרדה של 70 מיקרומטר.לשטוף את העמוד עם שלושה מיליליטרים של חיץ בידוד שלוש פעמים. לאחר מכן, הסר את העמוד מהמפריד והנח אותו על צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. פיפט חמישה מיליליטרים של חיץ בידוד על העמוד.כדי לשחזר את התאים המסומנים בחרוזים מגנטיים, דחפו בחוזקה את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים. לבסוף, צנטריפוגה של התאים ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. טוהר LSECs מבודדים וסמני פני השטח הוערכו באמצעות ציטומטריית זרימה.ניתוח נתונים ואסטרטגיית גידור עבור LSECs וסינגלטים מגודרים מבוססים על נתוני פיזור קדימה ופיזור צד. LSECs מבודדים הוכתמו בצבע כדאיות ושילוב של נוגדנים CD45, CD146 ו-Stabilin-2. LSECs בני קיימא היו מגודרים על אוכלוסייה שלילית CD45 ונותחו עבור ביטוי CD146 ו- Stabilin-2.מנתונים אלה, אושר כי LSECs מבודדים היה יותר מ 94% כדאיות ו יותר מ 90% טוהר. הפנוטיפ הספציפי ל-LSEC של התאים המבודדים אושר עוד יותר באמצעות מיקרוסקופיית אור ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק. LSECs מבודדים עברו תרבית במדיום הצמיחה המלא במשך שש שעות ונבחנו על ידי מיקרוסקופיית אור.החצים הלבנים בתמונת SEM מציינים את LSEC fenestrae, שהוא מאפיין מורפולוגי אופייני של LSECs. הצעדים הקריטיים להבטחת זלוף מלא של רקמת הכבד הם מיקום נכון של סרט קטטר, הימנעות מהכנסת אוויר לצנתר, והתזמון האופטימלי של עיכול הקולגנאז. LSEC באיכות גבוהה שנרכשה באמצעות הפרוטוקול שלנו תקל על זיהוי המנגנון המולקולרי של תפקוד LSEC ותשפר את הבנתנו את תפקידם בתקשורת בין-תאית בכבד, בבריאות ובמחלות.

isolation-characterization-mouse-primary-liver-sinusoidal-endothelial

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) מחוברים זה לזה על ידי חלבוני צומת ספציפיים היוצרים מחסום מווסת מאוד המפריד בין הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שנקרא מחסום דם-מוח (BBB). הבידוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכברים, כפי שנדון בפרוטוקול זה, מאפשר מחקרי מבחנה מפורטים של BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

תאי האנדותל של כלי הדם ממלאים תפקיד משמעותי בהפרעות לב וכלי דם חשובות רבות. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד והרחבה של תאי אנדותל מאבי העורקים של העכבר ללא שימוש בציוד מיוחד. הפרוטוקול שלנו מספק אמצעי יעיל לזיהוי מנגנונים בפיזיופתולוגיה של תאי אנדותל.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

מתוארת טכניקה לבידוד הפטוציטים אנושיים ותאי כבד לא פרנכימליים מאותו תורם. סוגי תאי הכבד השונים בונים את הבסיס למודלים תפקודיים של כבד והנדסת רקמות. שיטה חדשה זו שואפת לבודד תאי כבד בתפוקה גבוהה ובכדאיות.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

פרוטוקול זה מוכן לחלוק את השיטה שלנו לבידוד תאי אנדותל כליליים של עכברים לצורך הדמיה או לביצוע ניסויים ביולוגיים מולקולריים.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג הכדאיות גבוהה, תשואה גבוהה של hepatocytes ותאי אנדותל sinusoidal של הכבד. זו מושגת על ידי פרפוזיה הכבד עם פתרון collagenase IV סוג דרך וריד שער הכבד, ואחריו דיפרנציאלית צנטריפוגה כדי להשיג hepatocytes ותאי אנדותל sinusoidal.

טיהור של Hepatocytes ותאי אנדותל Sinusoidal מן הכבד העכבר זלוף

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של העכבר הראשי בריא ופונקציונליים hepatocytes פרוטוקול. הוראות לגילוי סינתזה של חלבון nascent הכבד על ידי המצע תיוג לא רדיואקטיבי נמסרו כדי לעזור להבין את המנגנונים שבבסיס סינתזת החלבון בהקשר של הומאוסטזיס אנרגיה-מטבוליזם בכבד.

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת"myovascular".

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד של העכבר hepatocytes מתוך כבדי העכבר למבוגרים באמצעות שונה קולגן הטכניקה הפרו הפרזיה. גם תיאר הוא התרבות ארוכת טווח של hepatocytes בקביעת כריך קולגן תלת-ממד, כמו גם immunolabeling של מרכיבים ציטושלד לחקר היווצרות המרה והתגובה שלה לטיפול.

בידוד וכריך קולגן 3D תרבות של העכבר הראשי Hepatocytes כדי ללמוד את התפקיד של שלד ציטוזה היווצרות של המרה בתוך מחוץ לגופית

הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

במאמר זה, תאי אנדותל ריאתיים ראשוניים בודדו וגודלו בתרבית מעכברים ילודים.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי אנדותל עכבר מלבלב שלם.

בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר

למדו שיטה לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים מכבד עכבר באמצעות פרפוזיה עם קולגנאז ובחירה באמצעות חרוזים מגנטיים CD146. השיטה מספקת טוהר של מעל 90% ושימור תפקודי.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

גלה סרטונים נוספים