Name: קביעת ההוצאה על אנרגיה בזלית והקיבולת של אדיפוציטים תרמוגניים להוצאות אנרגיה בעכברים שמנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: חקור הוצאת אנרגיה בזלית וקיבולת תרמוגנית של אדיפוציטים בעכברים שמנים באמצעות קלורימטריה עקיפה. שיטה זו מסייעת לחוקרים להבין מנגנוני אנרגיה ושינויי משקל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ML ממומן על ידי המחלקה לרפואה באוניברסיטת קליפורניה, מענקי פיילוט מ P30 DK 41301 (UCLA:DDRC NIH) ו P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (UCLA). עכברים קיבלו את התזונה והמים שלהם בכלוב המטבולי, ששוכנו בסביבה מבוקרת טמפרטורה (~21-22 או 30 מעלות צלזיוס) עם מחזור בהיר/כהה של 12 שעות. 8 עכברים נקבות בנות שבוע האכילו דיאטה עתירת שומן או דיאטת צ'או במשך 8 שבועות שימשו למחקר זה.
1. מדידת קצב חילוף החומרים של הבזל (BMR)
<ol><li>מדוד את משקל הגוף הכולל של העכבר באמצעות סולם משקל בדיוק בטווח של 0.1 גרם. הערה: זה חייב להיעשות לפני דיור העכברים בכלובים מטבוליים ואחרי 2-3 ימים של תקופת התאקלמות לכלובים המטבוליים.</li>
	<li>מדוד את הרכב הגוף, כולל שומן ומסה רזה בעכברים שאינם מרדים, באמצעות מערכת ניתוח הרכב הגוף המתאימה (ראה טבלה של חומרים). הערה: מדידות אלה נדרשות כדי לקבוע את ההוצאה האנרגטית ומבוצעות במקביל למדידות משקל הגוף הכוללות (שלב 1.1).</li>
	<li>הגדר את הכלובים המטבוליים ולהתחיל את תקופת ההתאקלמות. הערה: מערכת הכלובים המטבוליים כוללת מארז המאפשר למשתמש לשלוט בטמפרטורת הדיור ובאור של 12 כלובים (איור 1A,B). בכל כלוב יש בקבוק מים, מאכיל ורשת (איור 1C). הרשת מפרידה את העכבר מתחתית הכלוב, ומאפשרת איסוף צואה. לאחר התקנת הכלוב על כל חלל שנקבע מראש, מכסה החותם את הכלוב כולל את חריץ בקבוק המים, את אוויר הדגימה של הצינורות, את מערכת זרימת האוויר ואת חיישן הפעילות הגופנית (איור 1D).<ol>
<li>הפעל את מארז הטמפרטורה, את מערכת זרימת האוויר ואת המחשב 2 שעות לפני תחילת בדיקת ההפעלה.</li>
		<li>לאחר 2 שעות, פתח את התוכנה השולטת במארז (ראה טבלת חומרים) ואת זרימת האוויר ותן לתוכנה לבדוק את התקשורת של המחשב עם הציוד. הערה: תוכנת Oxymax שימשה לעבודה הנוכחית.</li>
		<li>לאחר יצירת התקשורת, לחץ על קובץ ולאחר מכן פתח את תצורת הניסוי (איור 2A) ובחר את תצורת הניסוי שעוצבה מראש על-ידי הספק (או הגדר מבוחן קודם).</li>
		<li>לחץ על הניסוי ולאחר מכן לחץ על מאפיינים, אשר יפתח את החלון מאפייני ניסוי (איור 2B).</li>
		<li>בחלון מאפיינים, הגדר את הפרמטרים של המארז הסביבתי, כולל טמפרטורת הסביבה (21 °C )C) ואת מחזורי האור של 12 שעות. הערה: שמירה על התוכנה פתוחה ופועלת מאפשרת לאוויר לזרום לתוך הכלובים והמארז כדי לשמור על הטמפרטורה ומחזורי האור שנבחרו. לכן, המערכת כולה יכולה לפעול עם עכברים בתוך הכלובים במשך כמה ימים, גם ללא מדידת חמצן ופחמן דו חמצני.
</li>
		<li>לחץ על ניסוי, ולאחר מכן לחץ על ההתקנה, ואת החלון הגדרת ניסוי ייפתח, שבו הפרמטרים של כל כלוב מטבולי מוגדרים.</li>
		<li>הקצה כל מזהה עכבר לכלוב הבודד שבו שוכן העכבר (איור 2C).</li>
		<li>כלול את המסה הרזה או משקל גוף כולל עבור כל עכבר רק אם אין הבדלים במשקל הגוף נצפים בין קבוצות. הערה: השגת ערכים גולמיים של צריכת חמצן והוצאות אנרגיה מקלה על ניתוחי ANCOVA.</li>
		<li>הגדר את קצב זרימת האוויר לכלוב חילוף החומרים ב 0.5-0.6 ליטר / דקה.</li>
		<li>בחלון התקנת ניסוי, בחר את הנתיב והשם לשמירת הקבצים. בחרו בספריית הגיבוי (איור 2D).</li>
		<li>הוסף כמות משוקללת מראש של מזון למאכילים המכסה לפחות צריכת מזון במשך יום אחד. הערה: אם לכלובים יש קשקשים משולבים, ניתן להוסיף את המזון ישירות, והתוכנה תקליט אותו.</li>
		<li>מוסיפים את בקבוקי המים. בדוק כי הבקבוק אטום כראוי ואינו דולף.</li>
		<li>24 שעות לאחר הוספת האוכל, לשקול את האוכל שנותר על הכלוב. הערה: גרם המזון שנוספו פחות גרם המזון שנותר ימדוד את צריכת המזון.</li>
		<li>התחל את מדידות החמצן, הפחמן הדו-חמצני והפעילות (שלב 1.4.10) לאחר שערכי צריכת המזון זהים לאלה של עכברים השוכנים בכלובים רגילים. הערה: כאן, תקופת ההתאקלמות (בדרך כלל 2-3 ימים) הושלמה, ומדידות הוצאות אנרגיה יכולות להתחיל.</li>
	</ol></li>
	<li>מדידות קלורימטריה ופעילות עקיפות להערכת הוצאות האנרגיה<ol>
<li>למדוד את משקל הגוף, שומן, ומסה רזה של כל העכברים לפני תחילת המדידות. הערה: אלה הם משקל הגוף וערכי מסה רזה המשמשים לביצוע ניתוחי ANCOVA.</li>
		<li>כייל את גלאי O2 ו- CO2 של מערכת ה- CLAMS (ראה טבלת חומרים) בריכוז החמצן המומלץ; תמיד לכייל מחדש את הגלאי לפני תחילת ניסוי חדש.</li>
		<li>השתמש בגז כיול של הרכב ידוע (20.50% חמצן ו 0.50% CO2). הערה: ספקי גז לעתים קרובות מתייחסים לגז זה כאל "ציון סטנדרטי ראשוני".</li>
		<li>הפעל ולוודא כי לחץ פלט הטנק הוא ב 5-10 פסאיי.</li>
		<li>פתחו את תוכנת כלי הכיול לכיול ובדיקה של חיישני הגז (איור 2E). לחץ על ניסוי, ולאחר מכן כייל.</li>
		<li>לחץ על התחל. לאחר מכן, המתינו לבדיקת החיישנים ושתוכנה תבקש מהמשתמש לסובב את הכפתורים של חיישן הגז (איור 2F) עד שהערך של זהות O2 יהיה 1 (איור 2G-H). לחץ על הבא לאחר השלמת השלב. הערה: אם כלי הכיול מבצע את כל השלבים הנוכחיים, הכיול ימשיך באופן אוטומטי לשלב הבא כאשר מד ההתקדמות יתמלא.</li>
		<li>אמת את תוצאות הכיול לאחר השלמת כל השלבים והתוצאות מוצגות.</li>
		<li>כבה את גז הכיול.</li>
		<li>החליפו מזון והוסיפו מספיק מזון לתקופה של 48-72 שעות. הערה: למרות כלובים ניתן לפתוח במהלך מדידות הוצאות האנרגיה כדי לפקח על משקל הגוף ולשנות את המזון מדי יום, עכברים יכולים להיות לחוצים על ידי מניפולציות אלה, ומדידות הולכים לאיבוד כאשר הכלובים נפתחים. לכן, מומלץ להימנע מכל מניפולציה במהלך תקופת המדידה.</li>
		<li>בתוכנה, לחץ על ניסוי ולאחר מכן הפעל כדי להפעיל את מדידות החמצן, הפחמן הדו-חמצני והפעילות (איור 3A). הערה: ניתן לעקוב אחר ביצוע המדידות בזמן אמת בתיבה הממוקמת בחלק הימני התחתון של התוכנה (מלבן אדום, איור 3B). המלבן האדום באיור 3B מראה שהמערכת מודדת את הכלוב מספר 1 במרווח מס' 3, כלומר המדידה השלישית. מדידה אחת בכלוב אחד יכולה להימשך כדקה אחת. לכן, עם 12 כלובים מחוברים, צריכת חמצן ניתן למדוד בערך כל 12 דקות. מומלץ לבצע מדידות רציפה של מינימום 48 שעות.</li>
		<li>הפסיקו את הניסוי על ידי לחיצה על הניסוי ולאחר מכן עצרו (איור 3C).</li>
		<li>פתח את הכלובים, שקול את העכברים ואת האוכל. לאסוף את הצואה כדי לחשב את מספר הקלוריות והשומנים המופרשים על פני תקופת המדידות 48-72 שעות. הערה: ניתן לאחסן צואה ב- -20 °C (70 °F) עבור ניתוחים מאוחרים יותר. לא ניתן להשתמש בכלובים אלה ביעילות לאיסוף שתן.</li>
		<li>לחץ על ניסויים ולאחר מכן על ייצוא וייצוא של כל הנושאים כקובץ CSV (איור 3D). הערה: כדי להקל על ניתוחי ANCOVA, זה חיוני כדי לייצא צריכת חמצן גולמי (VO2) ו CO2 ייצור ערכים (VCO2) מבלי להיות מנורמל על ידי משקל הגוף.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח נתונים ובקרת איכות<ol>
<li>בגיליון CSV המיוצא (איור 3D) (החל מהשלב 1.4.13), השתמש בערכים הגולמיים של צריכת החמצן (VO2) וייצור CO2 (VCO2) הנמדדים כל 12 דקות בתקופה של 2-3 ימים המפורטים באופן אוטומטי על-ידי התוכנה וכוללים חותמת זמן, כלומר השעה והתאריך שבהם הם נמדדו. הערה: ערכי VO2 ו- VCO2 יתוקנו באופן אוטומטי אם יוסיפו משקל גוף או ערכי מסה רזה.</li>
		<li>בגיליון CSV המיוצא, השתמש בערכים הגולמיים של יחס חילופי הנשימה (RER: VCO2/VO2) המחושב באופן אוטומטי ומפורטים על ידי התוכנה בהתאם לחותמת הזמן שלהם. הערה: ערכים קרובים ל- 1 מראים שהעכבר בעיקר מחמצן פחמימות, בעוד שערכים קרובים יותר ל- 0.7 מייצגים שהעכבר בעיקר מחמצן שומן. RER מעל 1 יכול להתרחש במהלך פעילות אנאירובית, כמו הגוף מגרש יותר CO2 כדי לפצות על חמצת הנגרמת על ידי לקטט. RER גבוה מ- 1 יכול להצביע על מתח. קובץ CSV המיוצא מכיל גם את הערכים הגולמיים מהוצאות אנרגיה (EE) או ייצור חום בקלוריות לדקה לעכבר, הנמדדים כל 12 דקות ב -2-3 הימים. כאן, כל הערכים המפורטים כוללים חותמת זמן.</li>
		<li>מכיוון שערכי EE יחידים לעכבר נדרשים עבור ANCOVA, ממוצע ערכי ה- EE שנרשמו בין השעות 09:00-16:00 עבור שלב האור (היום) ו- 19:00-04:00 עבור השלב הכהה (לילה) בעכבר וביום. הערה: ניתן לעשות זאת באופן ידני באמצעות Excel או Graph Pad. בחירת חלונות פעמיים אלה מונעת ממוצע של ערכי EE בינוניים, הדרגתיים ולא יציבים המשויכים למעבר הפאזה הכהה בהיר.</li>
		<li>עבור תקופה של 48 שעות, חשב את הממוצע של שני ערכי אור יום ואת שני ערכי הפאזה הכהה לעכבר באמצעות Excel או Graph Pad.</li>
		<li>כדי לכמת את הפעילות הגופנית הכוללת, השתמש ב- Excel או ב- Graph Pad כדי לסכם את ספירת מעברי הקרן x, Y ו- z הנמדדים בכלובים המטבוליים ומפורטים בקובץ CSV עבור כל עכבר. הערה: הפעילות הכוללת x,y,z מחושבת על-ידי ביצוע תחילה הערך הממוצע של כל X, Y, Z לעכבר ומחזור. לאחר מכן, הסכום של כל ערכי X, Y, Z ממוצעים לעכבר ומחזור נקבע להתוות את הנתונים כמו באיור 5E (בממוצע של יומיים).</li>
		<li>לחלופין, ייצג את הנתונים המציגים כל ערך מדידה לאורך זמן, מה שיוצר עקומות הממחישות את השינויים ב- EE במהלך המעבר ממחזורים בהירים וכהים. הערה: עיין בסעיף הדיון על אופן ומתי לבצע ניתוחי ANCOVA, והנוסחאות השונות המשמשות לחישוב VO2, VCO2 ו- EE מסופקות בקובץ משלים 1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מדידת הקיבולת של אדיפוציטים תרמוגניים להוציא אנרגיה
<ol><li>הגדר את המדידות וטיפולי העכבר. ראה שלב 1 לקבלת פרטים על ההכנות הניסיוניות לניטור צריכת החמצן, שכן קיבולת תרמוגנית באדיפוציטים נקבעת בעקיפין על ידי צריכת חמצן בעקבות שלבים 2.1.1-2.2.2. הערה: פרוטוקול זה דורש הרדמה עכבר וטיפול אקוטי עם אגוניסט קולטן בטא 3 CL-316,243 (ראה טבלה של חומרים), נותן הערכה מהירה של יכולת תרמוגנית BA.<ol>
<li>בצע ניתוח הרכב הגוף ולשקול את העכברים. הפעל את CLAMS, להגדיר את הטמפרטורה ב 30 °C (תרמונוטרליות), ולחכות 2 שעות עבור המערכת כולה להתחמם.</li>
		<li>הגדר את שאר תנאי הבחינה, כולל אור, להקצות מזהה עכבר לכל כלוב ולהוסיף ערך משקל גוף של כל עכבר בכלוב המתאים אם אין הבדל במשקל הגוף הוא ציין בין קבוצות.</li>
		<li>כייל את גלאי החמצן/CO2 כמו בשלבים 1.4.2-1.4.7.</li>
		<li>התחל את הניסוי בתוכנה.</li>
		<li>הזריקו לכל עכבר פנטוברביטל (60-120 מ"ג/ק"ג) והכניסו כל עכבר לכלוב המטבולי שהוקצה לו (שלב 2.1.2). הערה: המינון של pentobarbital הנדרש כדי לשמור על עכברים ישנים ב thermoneutrality (30 °C) משתנה עם זן העכבר ואת הגנוטיפ. מומלץ לבדוק מינונים שונים pentobarbital מ 50 כדי 120 מ"ג/ק"ג ובחר את אחד שמירה על העכבר מרדים במהלך 2-3 שעות ב 30 °C (50 °F). הרדמה יעילה חיונית כדי להסיר את התרומה של פעילות גופנית להוצאות האנרגיה.</li>
		<li>כדי להבטיח הרדמה, להתבונן בעכברים לאחר הזרקת pentobarbital עד שהם ישנים לחלוטין שלהם שיעורי צריכת החמצן ירד להיות יציב.</li>
		<li>המתן כדי להשיג לפחות 3 שיעורי צריכת חמצן יציבים רצופים לפני הזרקת CL-316,243. הערה: בזמן ההמתנה לייצוב צריכת החמצן, להכין את המזרקים עם CL-316,243 עבור כל עכבר (1 מ"ג / קילוגרם).</li>
		<li>פתח כלוב #1 והזרק CL-316,243 באופן תת עורי מיד לאחר מדידת VO2 ו- VCO2 אחת התרחשה בכלוב #1. החזר את העכבר לכלוב #1 מיד לאחר ההזרקה. הערה: המדידות מסומנות בזמן אמת בחלק הימני התחתון של התוכנה (איור 3B, מלבן אדום).</li>
		<li>המתן עד שכלוב #2 יימדד (איור 3B, מלבן אדום) ולאחר מכן המשך כמו בשלב 2.1.8 לכלוב #2. הערה: הזרקת CL-316,243 מיד לאחר מדידה מאפשרת שמירה על קבוע הזמן בין זריקות. לדוגמה, אם יש 12 עכברים / כלובים פועלים, עם מדידות שנאספו בכלובים בודדים ברצף ואת האוסף שנמשך 55 s לכלוב, אז אתה צריך להזריק עכבר אחד בכל דקה. עם שיעורי הזרקה אלה, המדידה הראשונה תתרחש לאחר 12 דקות לאחר הזרקה בכל 12 הכלובים.</li>
		<li>המשך מדידות הוצאות האנרגיה עד לערכי הוצאות האנרגיה לרמה של 5-6 מדידות רצופות, בדרך כלל 90-180 דקות לאחר ההזרקה. הערה: עכברים יכולים להתעורר מההרדמה במהלך הניסויים. יש להסיר את העכברים האלה מהניתוח. לכן, בדיקת מינונים pentobarbital מראש יגביר את היעילות של המחקרים.</li>
		<li>עצרו את מדידות ההוצאה האנרגטית, אך שמרו עכברים בכלובים שלהם ב-30 מעלות צלזיוס, עד שהם יתעוררו.</li>
		<li>לאחר שהעכברים ערים לחלוטין, בדוק את בריאות העכברים והחזיר אותם לכלובים הראשוניים שלהם.</li>
		<li>יצא את הנתונים של כל עכבר כקובץ CSV באמצעות תוכנת הציוד, כמתואר בסעיף 1.4.13.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח נתונים הערה: ניתוח הנתונים בוצע על ידי Excel או Graphpad<ol>
<li>התווה את הערכים הרצופים 3-5 של VO2, VCO2 ו- EE יציבים וקבועים לאורך זמן, מכיוון שאלו הערכים המייצגים את קצב חילוף החומרים כאשר עכברים נמצאים במיון מלא.</li>
		<li>לאחר מכן, התווה את מדידות VO2, VCO2 ו- EE הרצופות הבאות שהושגו לאחר ההזרקה. הערה: הערכים המוחלטים של EE ואת הגידול הקיפול EE המושרה על ידי הזרקה מצביעים על פונקציה תרמוגנית BA7.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Heymsfield, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+energy+expenditure%3A+advances+in+organ-tissue+prediction+models%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models.</a> Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).</li>
<li>Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+tissue%2Forgan+energy+expenditure+to+metabolic+fluxes+in+mouse+and+human%3A+experimental+data+integrated+with+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling.</a> Physiological Reports. 2 (9), 12159(2014).</li>
<li>Tschop, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+analysis+of+mouse+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A guide to analysis of mouse energy metabolism.</a> Nature. 9 (1), 57-63 (2011).</li>
<li>Mina, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CalR%3A+A+Web-Based+Analysis+Tool+for+Indirect+Calorimetry+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments.</a> Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).</li>
<li>Shum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCB10+exports+mitochondrial+biliverdin%2C+driving+metabolic+maladaptation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity.</a> Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).</li>
<li>Assali, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCLX+prevents+cell+death+during+adrenergic+activation+of+the+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue.</a> Nature Communication. 11 (1), 3347(2020).</li>
<li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+Report%3A+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).</li>
<li>Schena, G., Caplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everything+You+Always+Wanted+to+Know+about+beta3-AR+%2A+%28%2A+But+were+afraid+to+ask%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask).</a> Cells. 8 (4), 357(2019).</li>
<li>Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+adipose+tissue+contributes+to+UCP1-independent+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).</li>
<li>Szentirmai, E., Kapas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+brown+adipose+tissue+in+beta3-adrenergic+receptor+activation-induced+sleep%2C+metabolic+and+feeding+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses.</a> Scientific Reports. 7 (1), 958(2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים לנייר פרוטוקול זה. M.L. הוא מייסד שותף ויועץ עבור Enspire Bio LLC.

קלורימטריה עקיפה שימשה במשך שנים להערכת הוצאות האנרגיה של כל הגוף4. פרוטוקול זה המתואר כאן מספק שיטה פשוטה למדידת קצב חילוף החומרים של הבזל וקביעת יכולת תרמוגנית BA ב vivo באמצעות כלובים מטבוליים.
שיטת הקלורימטריה העקיפה המתוארת כאן מאשרת כי חלוקת ערכי הוצאות האנרגיה לפי ערכי משקל הגוף יכולה להטעות. לדוגמה, זה יכול להסיק כי ההוצאה על אנרגיה נמוכה באופן שיטתי בכל דגמי העכבר עם השמנת יתר. עם זאת, ההוצאה הכוללת על אנרגיה יכולה להיות גבוהה יותר במודלים מסוימים של ע...

חילוף החומרים יכול להיות מוגדר כשילוב של התגובות הביוכימיות האחראיות על ספיגת חומרים מזינים, אחסון, טרנספורמציה, ופירוק כי תאים להשתמש כדי לגדול ולבצע את הפונקציות שלהם. תגובות מטבוליות הופכות את האנרגיה הכלולה בחומרים מזינים לצורה שיכולה לשמש תאים לסנתז מולקולות חדשות ולבצע עבודה. תגובות ביוכימיות אלה אינן יעילות מטבען בהפיכת אנרגיה זו לצורה שמיש כדי לקיים חיים1. חוסר יעילות כזה גורם לפיזור אנרגיה בצורה של חום, עם ייצור חום זה משמש כדי לכמת את קצב חילוף החומרים הסטנדרטי (SMR) של אורגניזם1. המצב הסטנדרטי הוגדר באופן קלאסי כייצור חום המתרחש במבוגר ער אך נח, לא בליעת או עיכול מזון, בתרמונוטרליות וללא כל מתח1. קצב חילוף החומרים הבסיסי (BMR) או הוצאות אנרגיה הבסיסית בעכברים מכונה SMR אך אצל אנשים בולעים ומעכלים מזון תחת לחץ תרמי קל (טמפרטורות הסביבה 21-22 מעלות צלזיוס)1. האתגרים והקשיים של מדידת ייצור חום ישירות הפכו את ה- BMR לעקיף, כלומר לחשב את ייצור החום ממדידות צריכת חמצן, כדי להפוך לגישה הפופולרית ביותר לקביעת ה- BMR. חישוב ה- BMR מצריכת חמצן אפשרי מכיוון שחמצון החומרים המזינים על ידי המיטוכונדריה לסנתז ATP אחראי ל -72% מכלל החמצן הנצרך באורגניזם, עם 8% מצריכת החמצן הכוללת המתרחשת גם במיטוכונדריה אך מבלי ליצור ATP (נשימה לא מנוקבת)1. ניתן לייחס את רוב 20% הנותרים של החמצן הנצרך לחמצון מיזים במקומות תת-תאיים אחרים (חמצון חומצת שומן פרוקסיזומלית), תהליכים אנבוליים ויצירת מינים תגובתיים של חמצן1. כך, בשנת 1907, לאסק הקים משוואה, המבוססת על מדידות אמפיריות, בשימוש נרחב כדי להפוך את צריכת החמצן וייצור CO2 לפיזור אנרגיה כחום. אצל בני אדם, המוח מהווה ~ 25% של BMR, מערכת השלד והשרירים עבור ~ 18.4%, הכבד עבור ~ 20 %, הלב עבור ~ 10%, ורקמת השומן עבור ~ 3-7%2. בעכברים, תרומת הרקמה ל- BMR שונה במקצת, כאשר המוח מייצג ~ 6.5%, שריר השלד ~ 13%, הכבד ~ 52%, הלב ~ 3.7%, ורקמת השומן ~ 5%3.
למרבה הפלא, התגובות הביוכימיות המגדירות את ה- BMR אינן קבועות ומשתנות בתגובה לצרכים שונים, כגון עבודה חיצונית (פעילות גופנית), פיתוח (צמיחת רקמות), לחצים פנימיים (זיהומים נגד, פציעות, מחזור רקמות) ושינויים בטמפרטורת הסביבה (הגנה קרה)1. אורגניזמים מסוימים מגייסים באופן פעיל תהליכים ליצירת חום בחשיפה לקור, מה שמרמז על כך שהחום המיוצר על ידי חילוף החומרים אינו רק תוצר לוואי מקרי. במקום זאת, האבולוציה בחרה מנגנוני רגולציה שיכולים במיוחד להגביר את ייצור החום על ידי שינוי קצב התגובות המטבוליות1. לכן, אלה מדידות צריכת חמצן ניתן להשתמש כדי לקבוע את היכולת של אורגניזם לייצר חום בתגובה לקור.
שני תהליכים עיקריים תורמים לייצור חום עם חשיפה לקור. הראשון הוא רועד, אשר מייצר חום על ידי הגדלת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס בשריר כדי לכסות את העבודה הפיזית שנעשתה על ידי התכווצות שרירים לא רצונית. לכן, חשיפה לקור תגדיל את צריכת החמצן בשרירים1. השני הוא תרמוגנזה לא רועדת, המתרחשת באמצעות עלייה בצריכת חמצן באדיפוציטים חומים ובז '(BA). פיזור האנרגיה לחום ב- BA מתווך על ידי חלבון מתפרק מיטוכונדריאלי 1 (UCP1), המאפשר כניסה מחדש של פרוטון למטריצה המיטוכונדריאלית, ומפחית את שיפוע הפרוטון המיטוכונדריאלי. פיזור שיפוע הפרוטונים המיטוכונדריאלי על ידי UCP1 מגביר את ייצור החום על ידי הגובה בהעברת אלקטרונים וצריכת חמצן והאנרגיה המשתחררת על ידי פיזור פרוטונים כשלעצמו מבלי ליצור ATP (לא מנוטרל). יתר על כן, BA תרמוגני יכול לגייס מנגנונים נוספים להעלות את צריכת החמצן מבלי לגרום פיזור גדול בשיפוע פרוטון, על ידי הפעלת סינתזת ATP חמצוני חסר תועלת ומחזורי צריכה. הכלובים המטבוליים המתוארים כאן, כלומר מערכת CLAMS-Oxymax מקולומבוס אינסטרומנטס, מציעים את האפשרות למדוד את הוצאות האנרגיה בטמפרטורות סביבה שונות. עם זאת, כדי לקבוע את יכולת התרמוגנית של BA באמצעות מדידות צריכת חמצן בכל הגוף, יש: (1) לחסל את התרומה של רועד, ותהליכים מטבוליים אחרים שאינם BA להוצאות אנרגיה, ו -(2) במיוחד להפעיל פעילות תרמוגנית BA ב vivo. לכן, פרוטוקול שני מתאר כיצד להפעיל באופן סלקטיבי BA ב vivo באמצעות פרמקולוגיה בעכברים מורדמים ב thermoneutrality (30 °C), עם הרדמה תרמונוטרליות המגבילה תהליכים תרמוגניים אחרים שאינם BA (כלומר, פעילות גופנית). האסטרטגיה הפרמקולוגית להפעלת BA היא טיפול בעכברים עם אגוניסט קולטן β3-adrenergic CL-316,246. הסיבה לכך היא כי חשיפה קרה מקדמת תגובה אוהדת משחרר נוראדרנלין להפעיל קולטנים β-adrenergic ב BA, אשר מפעיל UCP1 חמצון שומן. יתר על כן, ביטוי קולטן adrenergic β3 מועשר מאוד ברקמת שומן בעכברים.

<table><tbody><tr><td>CLAMS-Oxymax System</td><td>Columbus Instruments</td><td>מזין מרכז CLAMS-ENC</td><td>כולל מארז סביבתי וחיישן חמצן זירקוניה</td></tr><tr><td>מחשב שולחני עם תוכנת Oxymax</td> HP<td>/Columbus</td><td>N/A</td><td>PC יש לרכוש בנפרד</td></tr><tr><td>קנקן דריריט (סידן גופרתי עם מחוון קובלט כלוריד)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-116681</td><td>נחוץ לייבוש הגז הנכנס לחיישן החמצן, לחות עלולה לפגוע בחיישן</td></tr><tr><td>NMR להרכב הגוף</td><td>אקו-MRI</td><td>אקו-MRI 100</td><td>מדוד מסת רזה ושומן בעכברים חיים. זה הכרחי לניתוחי ANCOVA.</td></tr><tr><td>CL-316-243</td><td>Sigma</td><td>C5976</td><td>מוזרק לעכברים תת עורית להפעלת תרמוגנזה</td></tr><tr><td>דיאטה עתירת שומן</td><td>דיאטות מחקר</td><td>D12266B</td><td>ניתנות לעכברים לפני ובמהלך המדידות</td></tr><tr>בית מרקחת<td>פנטוברביטל/נמבוטל</td><td>ב-DLAM</td><td>N/A</td><td>הרדמה לעכברים</td></tr><tr><td>גז בדרגה סטנדרטית ראשונית (מיכל ווסת)</td> <td>Praxair</td><td>NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590</td><td>20.50% חמצן, 0.50% CO2 מאוזן עם חנקן המשמש לכיול</td></tr></tbody></table>

קביעת ההוצאה על אנרגיה בזלית והקיבולת של אדיפוציטים תרמוגניים להוצאות אנרגיה בעכברים שמנים

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

מדידות הוצאות אנרגיה נחוצות כדי להבין כיצד שינויים בחילוף החומרים יכולים להוביל להשמנת יתר. ניתן לקבוע את ההוצאה על אנרגיה בזלית בעכברים על ידי מדידת צריכת חמצן בכל הגוף, ייצור CO2 ופעילות גופנית באמצעות כלובים מטבוליים. אדיפוציטים חומים/בז' תרמוגניים (BA) תורמים באופן משמעותי להוצאות האנרגיה של מכרסמים, במיוחד בטמפרטורות סביבה נמוכות. כאן, מדידות של הוצאות אנרגיה בזאליות ויכולת BA כוללת להוציא אנרגיה בעכברים שמנים מתוארים בשני פרוטוקולים מפורטים: הראשון המסביר כיצד להקים את הבדיקה כדי למדוד את ההוצאה על אנרגיה בזלית באמצעות ניתוח של covariance (ANCOVA), ניתוח הכרחי בהתחשב בכך שהוצאות האנרגיה משתנות בהתאם למסת הגוף. הפרוטוקול השני מתאר כיצד למדוד את יכולת ההוצאה האנרגטית של BA בעכברים . הליך זה כרוך בהרדמה, הדרוש כדי להגביל את ההוצאה הנגרמת על ידי פעילות גופנית, ואחריו הזרקת אגוניסט בטא3-adrenergic, CL-316,243, אשר מפעיל את ההוצאה האנרגטית BA. שני פרוטוקולים אלה ומגבלותיהם מתוארים בפירוט מספיק כדי לאפשר ניסוי ראשון מוצלח.

איור 4 מציג ערכי פעילות גופנית של VO2, VCO2, ייצור חום/אנרגיה (EE), יחס חילופי נשימה (RER) וערכי פעילות גופנית של X, Y, Z המתקבלים באמצעות הכלובים המטבוליים של מערכת CLAMS. VO2 ו- VCO2 המסופקים על ידי מערכת CLAMS הוא נפח הגז (mL) לדקה וניתן כבר לחלק אותו לפי משקל הגוף או ערכי המסה הרזה על ידי הזנת ערכי משקל אלה בתוכנת CLAMS לפני תחילת המדידות. עם זאת, אין להזין ערכי משקל גוף אם נצפים הבדלים במשקל הגוף בין קבוצות של עכברים, שכן יש צורך בניתוח ANCOVA...

כתב יד זה מתאר פרוטוקול למדידת קצב חילוף החומרים של הבזל ואת היכולת החמצונית של אדיפוזיטים תרמוגניים בעכברים שמנים.

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקר לקבוע אם יש הבדלים באיזון האנרגטי של עכברים, אשר יכול לעזור לזהות את התהליכים הפיזיולוגיים האחראים לשינוי במשקל הגוף. זה יכול לשמש גם כדי לקבוע את היכולת של שומן חום להוציא אנרגיה. טכניקה זו כימתה את החמצן הנצרך ואת CO2 המיוצר על ידי עכבר בודד בסביבה מבוקרת.זה מאפשר למשתמשים לחשב את ההוצאה האנרגטית בעכבר בודד זה ולקבוע אם טיפולים שונים או מניפולציות גנטיות יכולים לשנות את הוצאות האנרגיה. כדי להתחיל, פתח את התוכנה השולטת במארז ובתזרים האוויר ותן לתוכנה לבדוק את תקשורת המחשב עם הציוד. לאחר יצירת התקשורת, לחץ על קובץ ולאחר מכן פתח את תצורת הניסוי ובחר את תצורת הניסוי שתוכננה מראש על-ידי הספק או מוגדר מבוחן קודם.לאחר מכן, לחץ על הניסוי ולאחר מכן לחץ על מאפיינים כדי לפתוח את חלון מאפייני הניסוי. בחלון המאפיינים, הגדר את הפרמטרים של המתחם הסביבתי כולל טמפרטורת הסביבה ומחזורי אור של 12 שעות. לאחר מכן לחץ על הניסוי, ואחריו ההתקנה כדי לפתוח את חלון ההתקנה הניסוי שבו הפרמטרים של כל כלוב מטבולי מוגדרים.לאחר מכן, הוסיפו כמות מזון ששקלה מראש למאכילים בכלובים המטבוליים המאכלסים עכברות בנות שמונה שבועות. כמו כן, מניחים את בקבוקי המים ובדקו שהבקבוקים אטומים כראוי ואינם דולפים. לאחר 24 שעות, לשקול את המזון שנותר בכלובים ולשקול את העכברים.יומיים עד שלושה ימים לאחר שהעכברים שוכנו במערכת, התחל קלורימטריה עקיפה ומדידות פעילות. ראשית, כייל את מערכות CLAMS חמצן וגלאי זירקוניה פחמן דו חמצני באמצעות גז כיול של הרכב ידוע. לאחר הדלקה והבטחה כי לחץ פלט הטנק הוא בין 5 ל 10 פאונד לאינץ 'מרובע, לפתוח את תוכנת השירות כיול לכיול ובדיקת חיישני הגז.לחץ על הניסוי ולאחר מכן כייל ולחץ על התחל. המתן לבדיקת החיישנים ושתוכנה תבקש מהמשתמש לסובב את הכפתורים של חיישן הגז עד שהערך של זהות החמצן יהיה כזה. לחץ על הבא לאחר השלמת השלב.לאחר מדידת משקל הגוף והרכב העכברים, התחל את מדידות החמצן, הפחמן הדו-חמצני והפעילות על-ידי לחיצה על הניסוי והריצה. לאחר מינימום של 48 שעות, להפסיק את הניסוי על ידי לחיצה על הניסוי, ולאחר מכן להפסיק. כדי לייצא את הנתונים, לחץ על הקובץ ולאחר מכן יצא וייצוא של כל הנושאים כקובץ CSV.במהלך השלב החשוך, לעכברים יש צריכת חמצן גבוהה יותר וייצור פחמן דו חמצני, ולכן יש להם הוצאות אנרגיה גבוהות יותר. עכברים על דיאטה רגילה ומצב הפד עם בליעת מזון המתרחשת במחזור הכהה מאופיינים בערכי יחס חילופי נשימה קרוב לאחד, המציין העדפה לשימוש בפחמימות. במהלך מחזור האור כאשר עכברים בעיקר לישון ולכן מהר, יש מעבר חמצון שומן עם ערכי RER להיות קרוב יותר 0.7.בהתאם, פעילות גופנית נמדדת כמו שבר קרן לייזר XYZ סופרת במהלך השלב הכהה ויורד במהלך שלב האור. תזונה עתירת שומן האכלה מגבירה את משקל הגוף ואת מסת השומן מבלי לשנות את המסה רזה. עכברים עתירי שומן הניזונים מתזונה אכלו יותר קילוגרמים ביום, בעיקר בשל צפיפות קלורית גבוהה יותר לגרם מזון.עם זאת, פעילות גופנית דומה בין האוכל לעכברים עתירי שומן המוזנים בתזונה גם בתקופה האפלה. ערכי יחס מקדם הנשימה התחתון של עכברים עתירי שומן הניזונים מתזונה מצביעים על העדפה להשתמש בשומן כמצע העיקרי לחמצון. צריכת חמצן, אך לא ייצור פחמן דו חמצני, עולה בעכברים עתירי שומן המוזנים בתזונה, מה שמביא לעלייה משמעותית בהוצאות האנרגיה לעכבר.ההוצאה האנרגטית גדלה על ידי הזרקת אגוניסט בטא-3, בעיקר כתוצאה מההפעלה האדרגית של אדיפוציטים תרמוגניים, אשר מעלה את צריכת החמצן, ייצור פחמן דו חמצני, ובכך את ההוצאה האנרגטית עצמה. כדי למדוד את הוצאות האנרגיה עם CLAMS, הכיול חייב להיות מלא ומשקל הגוף צריך להימדד כדי לבצע את ניתוח ANCOVA. כמו כן, יש למדוד את צריכת המזון הן בתקופת ההסתגלות והן במהלך המדידות.תקופת ההסתגלות נגמרה כאשר עכברים לשחזר את צריכת המזון הראשונית ואת משקל הגוף. הליך זה יכול לשמש גם כדי לבדוק את ההשפעות החריפות של תרופות על פעילות העכבר והתנהגות. אנו משתמשים גם במערכת זו במחקר משותף שהוכיח איזו אוכלוסייה של נוירונים שלטה טכניקה זו חיונית לחקר מחלות הקשורות לעלייה במשקל ולזיהוי תהליכים השולטים בהעדפה תזונתית כמו גם בפעילות גופנית, תרמוגנזה ואיזון אנרגיה.

determining-basal-energy-expenditure-capacity-thermogenic-adipocytes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה של ​​הדמיה תפקודית של רקמת שומן חום עכבר (BAT) מתוארת שבספיגה קרה מגורה-18F של-fluorodeoxyglucose (FDG) בBAT היא הלא פולשני הוערך עם פרוטוקול micro-PET/CT טופל. שיטה זו היא חזקה ורגישה כדי לזהות הבדלים בפעילות BAT במודלים של עכברים.

הדמיה תפקודית של שומן חום בעכברים עם FDG micro-PET/CT

השיטה המוצגת כאן משתמשת 18 F-fluorodeoxyglucose (18 F-FDG) טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה / ממוחשבת (PET-CT) והדמיה שומן-מים מופרדים בתהודה מגנטית (MRI), כל שנסרקו הבא 2 חשיפה לשעת thermoneutral (24 ° C ) ותנאים קרים (17 מעלות צלזיוס) כדי למפות רקמת שומן חומה (BAT) בבני אדם בוגרים.

בסיס מיון רקמה האנושי בראון שומן בדיקה מחולק באופן אוטומטי על ידי פוזיטרון פליטת טומוגרפיה / טומוגרפיה ממוחשבת ורשום תמונות תהודה מגנטית

פרוטוקול זה מתאר את השיטה של ​​קביעת lipolysis basal ו-forskolin מגורה ב pads שמנים השתן המתקבל דיאטה chow נורמלי (NCD) או דיאטה שומן גבוהה (HFD) ± capesicin מזין עכברים סוג בר. כמדד לליפוליזה, שחרור גליצרול נמדד מתוך רפידות שומן שומניות.

מדידה של ליפוליזה מגורה של Basal ו- Forskolin במרפאות שומן אדיפוז

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מנתח בהרכב הגוף ומערכת חילוף החומרים בעלי חיים ניטור לאפיין הרכב הגוף ופרמטרים מטבולית בעכברים. מודל השמנת יתר הנגרמת על ידי האכלה עתירי שומן משמש כדוגמה עבור היישום של טכניקות אלה.

הרכב הגוף וניתוח מטבולית שכולאת בעכברים פד שומן גבוה

הבידול של adipocytes לבן ובייז של רקמת שומן אבות כלי הדם נושא פוטנציאל שיפור חילוף החומרים ההשמנה. נתאר פרוטוקולים של CD34 + CD31 + בידוד תאי אנדותל של שומן אנושי ואת הבאים במבחנה הרחבה, בידול לתוך לבן ובייז adipocytes. הם דנו מספר יישומים במורד הזרם.

בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

מאמר זה מספק שלוש גישות קלות ונגישות להערכת חילוף החומרים של השומנים בעכברים.

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

הדמיה פונקציונלית וכמות של מחסני שומן תרמוגניים בעכברים באמצעות גישה מבוססת הדמיה מיקרו-PET /MR.

הדמיה וכימות של רקמות שומן חום ובז' בעכברים באמצעות [18F]FDG מיקרו-PET/MR הדמיה

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לכימות המשמעות הפיזיולוגית של השפעת פעילות רקמת השומן החום (BAT) על חילוף החומרים האנושי. זה מושג על ידי שילוב העמסת פחמימות וקלורימטריה עקיפה עם מדידות של שינויים supraclavicular בטמפרטורה. גישה חדשנית זו יכולה לסייע בפיתוח יעד פרמקולוגי לתרמוגנזה BAT בבני אדם.

שימוש בשילוב של קלורימטריה עקיפה, תרמוגרפיה אינפרא אדומה ורמות גלוקוז בדם כדי למדוד תרמוגנזה של רקמת שומן חום בבני אדם

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות רקמת השומן החום לאחר ארוחה בבני אדם ובחיות מעבדה.

תרמוגרפיה אינפרא אדומה לאיתור שינויים בפעילות רקמת השומן החומה

בפרוטוקול זה מתוארות שיטות רלוונטיות למטבוליקה עורקית מותאמת ל-BAT באמצעות GC-MS במודל עכבר. שיטות אלה מאפשרות רכישת תובנות יקרות ערך לגבי חילופי מטבוליטים בתיווך BAT ברמת האורגניזם.

מטבולומיקה עורקית למדידה בחילוף מטבוליטים של Vivo ברקמת שומן חומה

כאן אנו מציגים פרוטוקול השתלת רקמת שומן לבן וחום המציע אסטרטגיה מבטיחה להיפוך תת-פוריות, השמנת יתר והיפרגליקמיה, תוך שיפור תפקוד הכליות בעכברי BTBR סוכרתיים והשמנת יתר.

שתלי שומן לבנים וחומים: גישה לתיקון ליקויים רבייתיים, מטבוליים וכלייתיים בעכברים שמנים שחורים ושזופים (BTBR)

חקור הוצאת אנרגיה בזלית וקיבולת תרמוגנית של אדיפוציטים בעכברים שמנים באמצעות קלורימטריה עקיפה. שיטה זו מסייעת לחוקרים להבין מנגנוני אנרגיה ושינויי משקל.

קביעת ההוצאה על אנרגיה בזלית והקיבולת של אדיפוציטים תרמוגניים להוצאות אנרגיה בעכברים שמנים

גלה סרטונים נוספים