Name: המיקרוסקופיה מבוססת אסאי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: חקור את דינמיקת האנדוזומים הממוחזרים בתאי מלנוציטים של עכברים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ו-GFP-STX13. שיטה זו מאפשרת ניתוח כימות של התמצאות חלבונים באברונים ותרומה להבנת מנגנוני יצירת מלנוזומים והפרעות פיגמנטציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 ל-SRGS); ועדת מחקר מדע והנדסה (CRG/2019/000281 ל-SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 ל-SRGS) ותוכנית השותפות IISc-DBT (ל-SRGS). התשתית במחלקה נתמכה על ידי DST-FIST, DBT ו- UGC. AMB נתמך על ידי DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).

הפרוטוקול כרוך זריעת מלנוציטים ואחריו טרנספקטו של plasmids. צעדים נוספים כוללים קיבעון, חיסונים, הדמיה וניתוח של התאים כדי למדוד את האורך והמספר של REs. התיאור המפורט של הפרוטוקול ניתן להלן.
1. זריעת מלנוציטים של עכברים על כיסויים שטופלו מראש
<ol><li>מצפים את כיסויי הזכוכית בצלחת פטרי (כלומר, 4 - 5 בצלחת 35 מ"מ) עם מטריצת ממברנה במרתף בינונית (1:20 במדיום RPMI מלא: RPMI + 10% חום מומת FBS + 1x גלוטמין + תערובת אנטיביוטיקה 1x) ולייבש אותו במכסה המנוע תרבית הרקמות במשך 15 דקות. יש לשטוף את כיסויי הכיסוי פעם אחת עם 1x PBS לפני השימוש.</li>
	<li>שמור על מלנוציטים מסוג עכבר בר (melan-Ink4a-Arf-1 מ- C57BL/6J, a/a, Ink4a-Arf-/- עכברים, המתוארים ב-20 וזמינים בבנק תא הגנומיקה הפונקציונלי של Welcome Trust) בצלחת פטרי (כלומר, צלחת 35 או 60 מ"מ) בתוספת מדיום RPMI מלא.<ol>
<li>לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS ולהוסיף 0.5 או 1 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25%) פתרון עבור תאים טריפסינים. לדגור על התאים ב 37 °C (5 °F) במשך 2 - 5 דקות עבור הניתוק מן צלחת פטרי.</li>
		<li>הוסף 1 - 2 מ"ל של מדיום RPMI מלא, להשעות ולאחר מכן להעביר את התאים לצינור צנטריפוגה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צנטריפוגה השעיית התא ב 4 °C (5 °F), 376 x g במשך 5 דקות ולאחר מכן resuspend הכדור ב 1x PBS.</li>
	<li>חזור על שלב הצנטריפוגה והגדל מחדש את התאים ב- 1 מ"ל של מדיום RPMI מלא.</li>
	<li>זרע את התאים על קרום המרתף כיסויים בציפוי בינוני ב 50-60% conהשפעה (כ 6 x 105 תאים על צלחת תרבית תאים 35 מ"מ המכיל 4 - 5 כיסויים). תמיד להוסיף 200 ננומטר של PMA (להוסיף 5 μL של מלאי עובד 40 μM phorbol 12-myristate 13-אצטט) להשעיית תא מצופה במדיום RPMI מלא.</li>
	<li>לאחר זריעה, לדגור על הצלחת ב 37 °C (50 °F) במשך 12-24 שעות.</li>
</ol>2. טרנספקטציה של תאים עם פלסמידים STX13
<ol><li>השתמש ריאגנטים הבאים: pEGFP-C1-STX13WT ו pEGFP-C1-STX13Δ129 (מתואר ב12). mCherry-Rab11, הייתה מתנה חביבה מגראסה רפוסו, מכון קירי, פריז (מתואר בהפניה19). נוגדן נגד TYRP1 מ-ATCC (TA99).</li>
	<li>לאחר 12 - 24 שעות של זריעה, לבצע חלוקה של התאים עם plasmids באמצעות ריאגנט transfection מבוסס שומנים בדם. עבור צלחת 35 מ"מ, לקחת 5 μL של ריאגנט transfection ב 250 μL של OPTI-MEM בינוני בצינור microcentrifuge ולקחת כ 200 ננוגרם של כל plasmid ב 250 μL של OPTI-MEM.</li>
	<li>לדגור על הצינורות המכילים DNA ואת ריאגנט transfection במשך 5 דקות. לערבב ללא pipetting חוזר (נפח כולל יהיה כ 500 μL). דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בצע הקשה ידנית של הצינור כל 10 דקות במשך 30 דקות ב RT.</li>
	<li>במהלך הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS, פעם אחת עם OPTI-MEM ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של OPTI-MEM לתאים.</li>
	<li>לאחר 30 דקות של דגירה, להוסיף את תערובת ריאגנט-DNA transfection לתאים בצורה טיפה חכם על ידי כיסוי המנה.</li>
	<li>לדגור על התאים ב 37 °C (6 °F) במשך 6 שעות. שאפו את המדיום OPTI-MEM עם ריאגנט טרנס-זיהום והוסיפו מדיום RPMI מלא בתוספת 200 ננומטר של PMA.</li>
	<li>לדגור על התאים ב 37 °C (55 °F) עבור 48 שעות.</li>
</ol>3. קיבעון התאים
הערה: ההליך הבא מבוצע מחוץ למכסה המנוע של תרבית הרקמות.
<ol><li>לאחר 48 שעות של transfection, לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS ולאחר מכן לתקן את התאים עם 3% פורמלדהיד (מוכן טרי 1x PBS) במשך 30 דקות.</li>
	<li>לאחר קיבעון, לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS ולאחסן את כיסויים ב 1x PBS עד לשימוש נוסף. לחלופין, תאים יכולים להיות מותקנים על שקופיות זכוכית (ראה להלן) או מאוחסנים ב 4 °C (70 °F).</li>
</ol>4. חיסונים של התאים
<ol><li>מכינים תא לח: מניחים חתיכת סרט פרפין חתוכה על נייר סינון לח בצלחת פטרי, מכוסה בנייר אלומיניום.</li>
	<li>הכן 25 μL של פתרון נוגדנים ראשוני (0.2% סאפונין ב 1x PBS, 0.1% BSA ב 1x PBS ו 0.02% נתרן אזיד ב 1x PBS). הוסף נוגדן בדילול של 1: 200. הוסף פתרון זה כטיפה על סרט פרפין בחדר לח.</li>
	<li>הרימו בזהירות את כיסוי המכסה במלקחיים, הפוך אותו על טיפה זו של תמיסה מכתימה נוגדנים ראשונית ולאחר מכן לכסות את המכסה של התא לח. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
	<li>באופן דומה, להכין את פתרון הנוגדנים המשני בדילול של 1:500 ולהניח אותו על סרט פרפין ליד כיסוי בתא לח. להכתמת הגרעין, הוסף DAPI (1:20,000 עד 1:30,000) לפתרון.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים, הרימו בזהירות את כיסוי הכיסוי מתמיסת הנוגדנים העיקרית וטובלים אותו שלוש פעמים ב-1x PBS (בכוס זכוכית).</li>
	<li>הקש על כיסוי על נייר טישו כדי להסיר את PBS עודף על כיסוי. מניחים אותו על תמיסת כתמי נוגדנים משנית בתא הלח ולא חושפים אותו לאור בשל נוכחותם של נוגדנים מתויגים פלואורסצנטית בתמיסה.</li>
	<li>לדגור על כיסוי שוב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. אנא שימו לב תמיד לצד כיסוי הכולל את התאים לאורך שלבים אלה.</li>
	<li>לאחר הדגירה, בזהירות להרים את כיסוי מפתרון הנוגדנים המשני ולאחר מכן לטבול אותו שלוש פעמים ב 1x PBS. יתר על כן, הקש על כיסוי על נייר טישו כדי להסיר את PBS עודף על כיסוי.</li>
	<li>מניחים 12 μL של ריאגנט הרכבה פלואורומאונט-G על מגלשת זכוכית ומניחים בזהירות את כיסויי הצבע (הפונים לכיוון הזכוכית) על ריאגנט הרכבה. הפוך את שקופית הזכוכית על נייר טישו ולאחר מכן לחץ בעדינות.</li>
</ol>5. מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של התאים
<ol><li>צלם את התאים המוכתמים תחת מסנני שדה בהיר (BF) ופלואורסצנטיות (IF) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד במצלמת CCD באמצעות מטרה אפיכרומטית 60x (שמן) או כל מיקרוסקופ אחר עם תצורה דומה.</li>
</ol>6. כימות חפיפה בין החלבונים המותאמים לשפות רה ומלנוזומים:
הערה: השלבים הבאים מתבצעים לכימות מקדם החפיפה של מנדר בין החלבונים באמצעות תוכנת פיג'י (להורדה חופשית מהקישור: https://imagej.net/software/fiji/). השתמש בתמונת TIFF עם ערוצים מרובים.
<ol><li>
פתח את התמונה הגולמית. עבור אל האפשרות תמונה, בחר צבע | פצל ערוצים והשתמש בשני הערוצים לניתוח.</li>
	<li>פתח את תוסף JACoP באפשרות תוסף.</li>
	<li>הגדר את הסף עבור שני הערוצים כך שכל הנקודות הבהירות נבחרו והרקע יבוטל.</li>
	<li>עבור אל האפשרות ניתוח, בחר מקדמי M1 ו- M2 לקבלת מקדם החפיפה של מנדר.</li>
	<li>לחץ על האפשרות נתח בתוסף JACoP וראה את התוצאה המציגה את מקדם החפיפה של מנדר.</li>
</ol>7. כימות המספר והאורך הצינוריים של אנדוזומים:
הערה: השלבים הבאים מתבצעים לכימות המספר והאורך של הצינורות באמצעות תוכנת פיג'י.
<ol><li>פתחו את האפשרות 'עבור לתמונה' של התמונה, בחרו 'צבע |' פצל ערוצים והשתמש בערוץ הרצוי לניתוח.</li>
	<li>עבור שוב לתמונה , בחר הקלד | המר לתמונת 8 סיביות.</li>
	<li>לאחר מכן עבור אל תוספים, בחר ניתוח | צינורות. הגדר את ערך סיגמא ב- 0.1075 . לחץ על בסדר.</li>
	<li>עבור שוב לתמונה , בחר הקלד | המר לתמונת 8 סיביות.</li>
	<li>עבור אל | תמונה כוונון | Threshold (השתמש באותם ערכי סף עבור כל התמונות). תמונות צריכות להיות בעוצמה שווה בקירב).</li>
	<li>עבור אל עיבוד | | בינארי המר למסיכה.</li>
	<li>עבור אל תהליך, בחר בינארי ולאחר מכן בחר שלד.</li>
	<li>עבור אל ניתוח, בחר שלד ובחר ניתוח שלד. בתוצאה ובפלט | בחר (א) חשב את הנתיב הקצר ביותר | (ב) להציג מידע מפורט | (ג) שלד תצוגה שכותרתו. לחץ על בסדר. הערה: התוצאה תיפתח בתבנית המנוולת בכרטיסיות. העמודה של אורך הענף הממוצע מציגה את אורך כל הצינורות השונים בתא שנבחר (הגדר קנה מידה לקבלת ערכים במיקרומטרים).</li>
	<li>לקבלת מספר הצינורות בתא, עבור אל ניתוח ובחר באפשרות נתח חלקיקים . לחץ על בסדר. הערה: בתוצאות שהושגו, עמודת הספירה מציגה את מספר הצינורות בתא מסוים זה.</li>
	<li>שמור את הנתונים וניתח.</li>
</ol>

<ol><li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+building+BLOC%28k%29s+of+lysosomes+and+related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).</li>
<li>Raposo, G., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanosomes--dark+organelles+enlighten+endosomal+membrane+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).</li>
<li>Ohbayashi, N., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+melanogenesis+in+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes.</a> F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-608 (2020).</li>
<li>Theos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+adaptor+protein+%28AP%29-3+and+AP-1+in+tyrosinase+sorting+from+endosomes+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).</li>
<li>Di Pietro, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-1+interacts+with+BLOC-2+and+the+AP-3+complex+to+facilitate+protein+trafficking+on+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).</li>
<li>Setty, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-1+is+required+for+cargo-specific+sorting+from+vacuolar+early+endosomes+toward+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).</li>
<li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AP-1+and+KIF13A+coordinate+endosomal+sorting+and+positioning+during+melanosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).</li>
<li>Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-2%2C+AP-3%2C+and+AP-1+proteins+function+in+concert+with+Rab38+and+Rab32+proteins+to+mediate+protein+trafficking+to+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).</li>
<li>Sitaram, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+a+dileucine-based+sorting+signal+by+AP-1+and+AP-3+reveals+a+requirement+for+both+BLOC-1+and+AP-3+in+delivery+of+OCA2+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).</li>
<li>Nag, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4A+organizes+endosomal+domains+for+sorting+cargo+to+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles.</a> Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).</li>
<li>Dennis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-2+targets+recycling+endosomal+tubules+to+melanosomes+for+cargo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).</li>
<li>Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STX13+regulates+cargo+delivery+from+recycling+endosomes+during+melanosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis.</a> Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).</li>
<li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab22A+recruits+BLOC-1+and+BLOC-2+to+promote+the+biogenesis+of+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes.</a> EMBO Reports. 19 (12), 45918(2018).</li>
<li>Bowman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BLOC-1-AP-3+super-complex+sorts+a+cis-SNARE+complex+into+endosome-derived+tubular+transport+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers.</a> Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173(2021).</li>
<li>Wei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hermansky-Pudlak+syndrome%3A+a+disease+of+protein+trafficking+and+organelle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function.</a> Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).</li>
<li>Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+lysosome-related+organelles%3A+Insights+from+Hermansky-Pudlak+syndrome+and+other+rare+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases.</a> Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).</li>
<li>Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+13+mediates+cycling+of+plasma+membrane+proteins+via+tubulovesicular+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).</li>
<li>Mahanty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab9A+is+required+for+delivery+of+cargo+from+recycling+endosomes+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).</li>
<li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+endosome+tubule+morphogenesis+from+sorting+endosomes+requires+the+kinesin+motor+KIF13A%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A.</a> Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).</li>
<li>Ha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF+functions+as+a+melanoma+tumor+suppressor+by+inducing+p53-independent+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).</li>
<li>Soldati, T., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Powering+membrane+traffic+in+endocytosis+and+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Powering membrane traffic in endocytosis and recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).</li>
<li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li>
<li>Hsu, V. W., Prekeris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+at+the+recycling+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transport at the recycling endosome.</a> Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).</li>
<li>Taguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of recycling endosomes.</a> Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).</li>
<li>Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recycling endosomes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).</li>
<li>Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-related+organelles+as+functional+adaptations+of+the+endolysosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system.</a> Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).</li>
<li>Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+active%3A+protein+sorting+in+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting active: protein sorting in endocytic recycling.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).</li>
<li>Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tethering+complex+for+endosomal+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A modular tethering complex for endosomal recycling.</a> Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).</li>
<li>Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanosome+biogenesis+in+the+pigmentation+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Integrated+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin.</a> Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים.

מיחזור אנדוזומים הם קבוצה של אברונים אנדוציטיים, והם מתווכים את מיחזור המטען למשטח התא בכל סוגי התאים21,22,23,24,25. בסוגי תאים מיוחדים כגון מלנוציטים, אברונים אלה מסיטים חלקית את נתיב הסחר שלהם לכיוון המלנוזומים עבור הביוגנזה שלהם3,16,26. יתר על כן, REs נוצרים לאחר מ...

ביוסינטזה של פיגמנטים מלנין מתרחשת מלנוזומים, אברון ספציפי מלנוציטים (LRO) כי קיים יחד עם ליזוזומים קונבנציונליים. המערכת האנדוציטית ממלאת תפקיד מרכזי בביוגנזה של מלנוזומים, הנדרשת לצבע עור והגנה פוטו-הגנתית מפני קרינה מייננת1,2,3. במהלך תהליך זה, אנזימי סינתזה מלנין ממוינים על אנדוזומים מוקדמים / מיון ולאחר מכן מועברים מלנוזומים מוקדמים באמצעות אנדוזומים צינוריים או אופניים הנקראים אנדוזומים מיחזור (REs)4,5,6,7,8,9,10. פילוח והיתוך של אברונים אלה לווסת את ההתבגרות של מלנומוזומים פיגמנטיים פונקציונליים לחלוטין7,11,12,13,14. פגמים בהיווצרות של אברונים אלה או מיון מטען לאברונים אלה גורמים לבקנות oculocutaneous ופנוטיפים קליניים אחרים, שנצפו תסמונת הרמנסקי-Pudlak15,16.
כאן אנו מתארים טכניקה פשוטה המבוססת על מיקרוסקופיה כדי ללמוד ולנתח את REs. בשיטה זו, ניצלנו חלבון transmembrane, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13 התב"ע המונה על מיחזור אנדוזומים17 ומחזורים בין מיון אנדוזומים ומלנוזומים במלנוציטים12,18. יתר על כן, מחיקה של N-terminal לא מובנה דומיין רגולטורי (כלומר SynN או STX13Δ129) מאפשרת SNARE להיתקע melanosomes, אשר מודד את מסלול הסחר קדימה לכיוון melanosome12. השתמשנו בסמן אנדוסומאלי ידוע מיחזור Rab GTPase (Rab)11 במחקרים שלנו14,19. הדמיית פלואורסצנטיות של החלבונים GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 ו- TYRP1 במלנוציטים מסוג בר ואחריו כימות הלוקליזציה היחסית שלהם תספק את הטבע והדינמיקה של REs בנוסף למיקודם למלנוזומים. לכן, זוהי טכניקה פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לדמיין ולמדוד את הדינמיקה של REs במלנוציטים.

<table><tbody><tr><td>נוגדן נגד TYRP1 (TA99)</td><td>ATCC</td><td>HB-8704</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668-500</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת מטריג'ל</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>022600-050</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12- myristate 13-אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI בינוני 1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-022</td><td></td></tr></tbody></table>

המיקרוסקופיה מבוססת אסאי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר snare

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

מיחזור אנדוזומים (REs) הם אברונים צינוריים-ארסיים שנוצרו מאנדוזומים מוקדמים /מיון בכל סוגי התאים. אברונים אלה ממלאים תפקיד מפתח בביוגנזה של מלנוזומים, אברון הקשור ליזוזום המיוצר על ידי מלנוציטים. REs לספק את המטען ספציפי מלנוציט למלנוזומים מוקדמים במהלך היווצרותם. חסימה בדור של REs, נצפתה במספר מוטציות של תסמונת הרמנסקי-Pudlak, גורמת hypopigmentation של העור, השיער, והעין. לכן, לימוד הדינמיקה (מתייחס למספר ולאורך) של REs שימושי כדי להבין את הפונקציה של אברונים אלה במצבים נורמליים ומחלות. במחקר זה, אנו שואפים למדוד את הדינמיקה RE באמצעות תושב SNARE STX13.

כימות של לוקליזציה מוטנטית STX13Δ129 למלנוזומים מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של STX13 במלנוציטים מסוג בר עכברים הראתה GFP-STX13WT מקומי כמבנים ריסקוליים וצינוריים ו- GFP-STX13Δ129 המותאמים לשפות מקומיים כמבנים דמויי טבעת בנוסף למשטח התא (איור 1A). יתר על כן, GFP-STX13Δ129 דמוי טבעת תאית הראה colocalization עם חלבון מלנום TYRP1 (איור 1A) ומלנוזומים בתמונה בהירה (נת...

מיחזור אנדוזומים הם חלק מהרשת הצינורית האנדוסומית. כאן אנו מציגים שיטה לכמת את הדינמיקה של מיחזור אנדוזומים באמצעות GFP-STX13 כסמן אברונים.

המיקרוסקופיה מבוססת אסאי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

המיקרוסקופיה מבוססת על בדיקות כדי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE. אלה מלנוציטים מעור. האברונים בצבע שחור שרואים בתוך התאים נקראים מלנומוזומים.מלנוזומים ידועים כמעמד של אברונים הנקראים אברונים הקשורים לליזוזום או LRO. מיחזור אנדוזומים הם אברונים אופניים צינוריים מתחילת או מיון אנדוזומים בכל סוגי התאים. אברונים אלה ממלאים תפקיד מפתח בביוגנזה של מלנוזומים, אברון הקשור ליזוזום המיוצר על ידי מלנוציטים.אנדוזומים למיחזור מספקים את המטען הספציפי למלנוציטים למלנוזומים מוקדמים במהלך היווצרותם. הדור של אנדוזומים מיחזור שנצפו במספר תסמונות הוא תאים היפרפיגמנטציה של העור, השיער, והעין. לכן, לימוד הדינמיקה של מיחזור אנדוזומים שימושי כדי להבין את הפונקציה של אברונים אלה במצבים נורמליים ומחלות.מחקר זה נועד למדוד את הדינמיקה של אנדוזומים מיחזור באמצעות עצירת תחביר SNARE-13. הצעד הראשון הוא זריעת מלנוציטים של עכברים על כיסויים שטופלו מראש. מצפים את כיסויי הזכוכית בצלחת פטרי במדיום מטריצת הממברנה במרתף.ולייבש אותו במכסה המנוע תרבית הרקמות במשך 15 דקות. יש לשטוף את כיסויי הכיסוי פעם אחת עם 1X PBS לפני השימוש. זרע את התאים על קרום המרתף כיסויים מצופים בינוניים ב 50 עד 60% כשירות.תמיד להוסיף 200 nanomolars של PMA השעיית תא מצופה במדיה RPMI מלאה. לאחר זריעת התאים, לדגור על המנה המכילה תאים באינקובטור CO2 במשך 12 עד 24 שעות. השלב השני הוא טרנספקטציה של תאים עם תחביר-13 פלסמידים.לדגור על הטיפים המכילים DNA ריאגנט transfection, לערבב במשך חמש דקות ומערבבים ללא pipetting חוזר. הקש על הצינור ביד כל עשר דקות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS, פעם אחת עם OPTI-MEM, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליון של OPTI-MEM לתאים.לאחר 30 דקות של דגירה, להוסיף את תערובת DNA ריאגנט transfection לתאים בצורה טיפה חכם על ידי כיסוי המנה. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שש שעות. שאפו את המדיום OPTI-MEM עם ריאגנט transfection ולהוסיף מדיום RPMI מלא בתוספת 200 nanomolars של PMA.לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. השלב השלישי הוא קיבעון התאים. אנא שימו לב כי ההליך הבא מתבצע מחוץ למכסה המנוע של תרבית הרקמות.לאחר 48 שעות של טרנספקטציה, לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS ולאחר מכן לתקן את התאים עם 3%פורמלדהיד במשך 30 דקות. לאחר קיבעון, לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS ולאחסן את כיסויים ב 1X PBS עד לשימוש נוסף. לחלופין, תאים יכולים להיות מותקנים על לוחות זכוכית או מאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס.השלב הרביעי הוא חיסון התאים. הכן תא לח. מניחים חתיכת חיתוך פרפילם על נייר מסנן עכברים בצלחת פטרי.מכסים בנייר אלומיניום. הכן 25 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים העיקרי. הוסף נוגדן בדילול של אחד עד 200.הוסף פתרון זה כטיפה על parafilm בתא לח. הרימו בזהירות את כיסוי המכסה במלקחיים. הפוך אותו על טיפה של פתרון כתמי נוגדנים ראשוניים, ולאחר מכן לכסות את המכסה של התא לח.דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. באופן דומה, להכין את פתרון הנוגדנים המשני בדילול של אחד עד 500 ולהניח אותו על parafilm ליד כיסוי בתא לח. להכתמת הגרעין, הוסף DAPI בדילול של 120, 000 עד 130,000 לפתרון.בעזרת מלקחיים, הרימו בזהירות את כיסוי הכיסוי מתמיסת הנוגדנים העיקרית וטבלו אותו פעמיים ב-PBS 1X. הקש על כיסוי על נייר טישו כדי להסיר את PBS עודף על כיסוי. מניחים אותו על תמיסת כתמי הנוגדנים המשנית בתא הלח ואינם חושפים אותו לאור, בשל נוכחותם של נוגדנים צבועים פלואורסצנטית בתמיסה.לאחר הדגירה, הרימו בזהירות את כיסוי הכיסוי מתמיסת הנוגדנים המשנית ולאחר מכן טובלים אותו פעמיים ב- PBS 1X. יתר על כן, הקש על כיסוי על נייר טישו כדי להסיר את PBS עודף על כיסוי. מניחים 12 מיקרוליטרים של ריאגנט הדמיה על מגלשת זכוכית ומניחים בזהירות את כיסוי הויטראז' על ריאגנט הרכבה.הפוך את שקופית הזכוכית על נייר הטישו ולאחר מכן לחץ בעדינות. לאחר מכן, צלם את כיסוי הכיסוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומנתח את התמונות באמצעות ImageJ. השלב השישי הוא כימות החפיפה בין המיחזור חלבונים מקומיים אנדוזומים ומלנוזומים.כימות תחביר-13 דלתא-129 colocalization עם מלנוסומים. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של syntaxin-13 במלנוציטים מסוג בר עכברים הראתה GFP-syntaxin-13 מסוג בר לוקליזציה כמבנים ארסקולריים וצינוריים. ו- GFP-syntaxin-13 delta-129 לוקליזציה של מבנים דמויי טבעת בנוסף לפני השטח של התא.יתר על כן, טבעת תאית דמוית GFP-syntaxin-13 דלתא-129 הראה colocalization עם חלבון מלנום TYRP1 במלנוזומים בתמונה שדה בהירה. כפי שמוצג קודם לכן, קבוצה של סוג בר GFP-syntaxin-13 בביטוי יתר נצפתה במלנוסומים. כדי למדוד את הלוקליזציה היחסית של סוג כללי של תחביר-13 ו- GFP-syntaxin-13 delta-129 למלנוזומים, נעשה שימוש בתוכנת פיג'י וניתוח נעשה עם תוסף JACOP.מקדם החפיפה של מנדר הנמדד, כלומר MOC, בין GFP-syntaxin-13 delta-129 עם TYRP1 גבוה בכ-1.5 לעומת סוג פראי GFP-syntaxin-13 עם TYRP1. מעניין, TYRP1 הראה 2.9 מקפלים ערכי MOC גבוהים יותר עם GFP-syntaxin-13 delta-129 בהשוואה לסוג פראי GFP-syntaxin-13. נתונים אלה מצביעים על כך שהלוקליזציה של מלנומוזומים דלתא-129 של GFP-syntaxin-13 גבוהה יחסית לסוג הבר GFP-syntaxin-13 במצב יציב.כימות של לוקליזציה מסוג בר של תחביר-13 של אנדוזומים למיחזור. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של סוג בר GFP-syntaxin-13 הראתה colocalization עם חלבון אנדוסומאלי מיחזור ידוע Rab11. ה- MOC בין סוג הפרא GFP-syntaxin-13 עם mCherry-Rab11 גבוה בכ-1.4 לעומת mCherry-Rab11 עם סוג פראי GFP-syntaxin-13.כדי למדוד את המספר והאורך של GFP-syntaxin-13 סוג פראי טוביות אנדוסומליות חיוביות, תוכנת פיג'י שימשה כמתואר בסעיף הפרוטוקול. mCherry-Rab11 משמש שליטה חיובית בניסויים. מלנוציטים שהודבקו בסוג בר GFP-syntaxin-13 הראו מספר גבוה יותר של צינורות לתא בהשוואה לתאים המבטאים mCherry-Rab11.עם זאת, הצינורות מצטמצמים על שיתוף פעולה של סוג בר GFP-syntaxin-13 ו mCherry-Rab11 בתאים. השלב השביעי הוא כימות המספר והאורך הצינוריים של אנדוזומים. הצינורות מצטמצמים על דו-קיום של סוג הבר GFP-syntaxin-13 ו mCherry-Rab11 בתאים.מעניין, אורך הצינור הממוצע הן מסוג GFP-syntaxin-13 והן mCherry-Rab11 דומה זה לזה בתאים המבטאים בנפרד או יחד. יחד, נתונים אלה מראים כי GFP-syntaxin-13 סוג בר לוקליזציה למיחזור אנדוזומים דומים Rab11. מחקר זה הראה כי משלוח N-מסוף של מוטציה syntaxin-13, כלומר GFP-syntaxin-13 דלתא-129, לוקליזציה למלנוזום GFP-syntaxin-13 דלתא-129 יכול לשמש ככתב לסחר ברכבים ממחזור אנדוזומים אל פני התא ו- LRO.לעומת זאת, סוג בר GFP-syntaxin-13 לוקליזציה למיחזור אנדוזומים דומים Rab11. מחקר זה המחיש כי סוג בר GFP-syntaxin-13 יכול לשמש גם לסימון אנדוזומים מיחזור במלנוציטים. סוג פראי GFP-syntaxin-13 עשוי להיות סמן אנדוסומאלי מיחזור טוב יותר מאשר Rab11, שכן Rab11 משנה את הדינמיקה האנדוסומית.בסך הכל, סוג הבר GFP-syntaxin-13 פועל סמן אנדוסומאלי מיחזור פוטנציאלי כדי ללמוד את הדינמיקה בתנאי מצב יציבים.

the-microscopy-based-assay-to-study-analyze-recycling-endosomes-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פתחנו assay איחוי תאים שמכמת אירועי איחוי המלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז.

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

סחר בממברנה כרוך בהובלה של חלבונים מקרום הפלזמה לפנים התא (כלומר אנדוציטוזיס) ואחריו סחר לליזוזומים לפירוק או לקרום הפלזמה למיחזור. השיטות המתוארות במאמר זה נועדו לחקור אנדוציטוזיס ומיחזור של חלבוני ממברנת פלזמה.

מבחני הגנת L-גלוטתיון מבוססי תאים לחקר אנדוציטוזיס ומיחזור של חלבוני ממברנת פלזמה

סחר קולט מודולציה היענות איתות ותא לligands והוא, עצמו, מגיב לתנאי תא, כוללים איתות מושרה ליגנד. כאן אנו מתארים טכניקה חזקה וגמישה לכמותית הערכת סחר קולט תוצאת משימוש בסמים באמצעות immunolabeling וניתוח colocalizational.

מעקב אחר שינויים בהשפעת סמים בסחר פוסט-הפנמת קולטן על ידי ניתוח Colocalizational

החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית ​​נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

אנו מתארים של assay אופטי עבור שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור בנוירונים בתרבית. שילוב פרוטוקול זה עם תרביות תאים כפול לבטא סמן presynaptic וחלבון עניין מאפשר לנו לאתר אתרי presynaptic, שלהם שלפוחית סינפטית מיחזור קיבולת, ולקבוע את תפקידו של החלבון עניין.

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

יכול להיות מאופנן דעתנית עצביים באמצעות תהליך דינאמי של אנדו - אקסוציטוזה של רצפטורים גלוטמט ionotropic סינאפסות. המתוארים כאן הוא assay הנגיש, תיכון-תוכן לכימות תנועת משטח ופנימיים קולטן האוכלוסייה בריכות.

וזמינותו גבוהים-תוכן עבור ניטור אמפא קולטן סחר

הובלה אנדוציטית ונסיגה של חלבונים מקרום הפלזמה לרשת הטרנס-גולגי חיונית לשמירה על הומאוסטזיס הממברנה ולוויסות האיתות. כאן, אנו מתארים שיטה להדמיה וכימות של הובלה אנדוציטית של חלבוני מטען טרנסממברניים על ידי מיקרוסקופ תאים חיים באמצעות ננו-גופים נגזרים נגד GFP בתאי HeLa.

הדמיית תאים חיים של הובלה אנדוציטית באמצעות ננו-גופים פונקציונליים בתאים מתורבתים

חקור את דינמיקת האנדוזומים הממוחזרים בתאי מלנוציטים של עכברים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ו-GFP-STX13. שיטה זו מאפשרת ניתוח כימות של התמצאות חלבונים באברונים ותרומה להבנת מנגנוני יצירת מלנוזומים והפרעות פיגמנטציה.

המיקרוסקופיה מבוססת אסאי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE

גלה סרטונים נוספים