איסוף, הרחבה והתמיינות של מודלים ראשוניים של תאי אפיתל באף אנושי לכימות תדירות פעימות הריסונים

אנו מתארים את איסוף תאי הגזע של דרכי הנשימה מרירית האף. תאים אלה מורחבים ומתמיינים לאפיתל פסאודו-שכבתי במעבדה. זוהי התרחבות והתמיינות במבחנה, הדומה לדרכי הנשימה שלנו in vivo, מה שאומר שישנם תאים מתמחים, כגון תאים ciliated, נוכחים שיכולים לשמש לכימות תדירות פעימות הריסונים.

כדי לאפשר כימות עקבי וניתן לשחזור של תדירות פעימות הריסונים בין אנשים שונים ובתגובה לתרופות שונות, אנו יוצרים סטנדרטיזציה של תנאי תרבית ורכישת תמונה. מדידות תדר פעימות ריסונים משמשות ככלים קליניים במחלות כגון דיסקינזיה ראשונית. אנו מקווים לבסס זאת כסמן קליני לסיסטיק פיברוזיס.

המדגימות את ההליך הן קייטלין אלן ולורה פוסט, דוקטורנטיות מהמעבדה שלי, וד"ר שרון וונג, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. התחילו בכך שתבקשו מהמשתתפים לנשום דרך הפה. לאחר מכן לוקחים מברשת ציטולוגיה ביד הדומיננטית ומניחים את הספרה החמישית על הסנטר של המשתתף כדי לעגן את היד, מכניסים את המברשת הציטולוגיה למעבר האף של המשתתף בזווית של 45 מעלות לפנים של המשתתף, ומעבירים אותה דרך בשר האף.

לאחר סיבוב המברשת זקופה, כך שתהיה בניצב לפנים של המשתתף, מקדמים את המברשת בעדינות, אך בחוזקה, כנגד הדופן הצדדית של האף מתחת לטורבינציה התחתונה עד שהיא נמצאת בחלק האמצעי עד האחורי של הטורבינציה הנחותה. סובבו את המברשת ב-360 מעלות עד שלוש פעמים. לאחר מכן להסיר אותו בעדינות, היפוך תמרון החדרה, כך התאים לא נעקרו מן המברשת.

הכניסו את המברשת לתוך צינור האיסוף המוכן עם מדיה לאיסוף תאי האף, והניחו את צינור האיסוף על קרח. לאחר מערבולת עדינה כדי לעקור תאים מהמברשת, העבירו את צינור האיסוף שעל הקרח בחזרה לארון הבטיחות הביולוגית. באמצעות פיפטה סרולוגית, מעבירים את המדיה מצינור האיסוף לצינור חדש, ומשאירים מאחור את המברשות הציטולוגיות.

ואז צנטריפוגה את הדגימה. לאחר צנטריפוגה, השהה מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיית תא תכנות מחדש מותנית. לאחר מכן באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, מעבירים את התאים דרך מסננת תאים המונחת על גבי צינור 50 מיליליטר בתנועה מעגלית.

כדי לקבל השעיה של תא בודד, לאסוף את המתלה מתחתית הצינור, ולהעביר אותו דרך המסננת מספר פעמים. לאחר מכן יש להשליך את מסננת התא. כדי לזרוע את תאי האפיתל של דרכי הנשימה על תוספות התמיכה החדירות שהוכנו, ערבבו היטב את התאים מבלי ליצור בועות, כדי להבטיח שהם הומוגניים ובתרחיף.

לאחר מכן להוסיף 150 microliters של ההשעיה התא לצד apical של מוסיף תמיכה חדיר מוכן. כדי להתמיין בין תאי אפיתל דרכי הנשימה בממשק האוויר-נוזל, תרבית אותם בהתמיינות, או במדיה ALI במשך יומיים. לאחר מכן שאפו את המדיה, והוסיפו 750 מיקרוליטרים של מדיית ALI רק לתא הבסיסי כדי ליצור ממשק אוויר-נוזל.

כדי לזרוע את תאי אפיתל דרכי הנשימה בכיפות ECM, יש לתלות תאי אפיתל מנותקים של דרכי הנשימה בנפח המתאים של 90% ECM. לאחר מכן מחזיק את הפיפטה אנכית בזווית של 90 מעלות קרוב ככל האפשר לתחתית הבאר, מחלקים 50 מיקרוליטרים של השעיית תא ECM למרכז הבאר. לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות עד ECM מתמצק.

בזמן שה-ECM מתמצק, יש לחמם את מדיית הזריעה האורגנואידית של דרכי הנשימה, או AOSM, לטמפרטורת החדר כדי למנוע ממנה לגרום לנזילה חוזרת, והתפוררות כיפת ה-ECM עם ההספה. לאחר הדגירה, הוסף 500 מיקרוליטרים של AOSM מחומם לכל באר על ידי חלוקה לאורך קיר הבאר. אין להקפיץ את המדיה ישירות על כיפת ה-ECM.

שנה את המדיה כל יומיים במשך ארבעה עד שבעה ימים. כדי לשאוף את התקשורת, הטה את הלוח בזווית של 45 מעלות ושאף מהקצה התחתון של הבאר הרחק מכיפת ה- ECM. לאחר ארבעה עד שבעה ימים, התחל הבחנה אורגנואידית על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של מדיית הבחנה אורגנואידית מחוממת של דרכי הנשימה, או AODM, לכל באר, ושנה מדיה כל יומיים במשך שבעה ימים.

מניחים את לוחית התרבית המכילה את דגמי תאי האפיתל של דרכי הנשימה לתוך צלחת המיקרוסקופ, וסוגרים את התא הסביבתי של המיקרוסקופ. אפשרו לדגימה להתאזן בתא המיקרוסקופ המחומם מראש, ששטחו 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני, למשך 30 דקות. בעינית המיקרוסקופ, התמקדו במודל התא.

לאחר מכן באמצעות תוכנת הרכישה, לחץ על L100 כדי להחליף את נתיב האור ליציאה שבה המצלמה מותקנת. לחץ על כפתור Play הירוק כדי לדמיין את שדה הראייה של המיקרוסקופ באמצעות התוכנה. בדקו שהריסונים ממוקדים, והתאימו במידת הצורך.

כדי להשיג תמונות קיטועי זמן מהתפריט, לחץ על רכוש ולאחר מכן על קיטועי זמן מהירים. בחלון המוקפץ, בחר מיקום שמירה, שם קובץ, לרכוש 1, 000 מסגרות. כדי להציג תצוגה מקדימה של הריסונים בשדה הראייה של המיקרוסקופ, לחץ על החל, ולאחר מכן על כפתור Play הירוק.

התאם את מוקד Z במידת הצורך. לאחר מכן לחץ על הפעל עכשיו כדי ללכוד את קיטועי הזמן המהירים. לאחר התקנת התוכנה וארגז הכלים הדרושים, העתק את סקריפטי הניתוח המותאמים אישית ואת תיקיית סקריפטי התמיכה לכונן המקומי של המחשב.

לאחר מכן, על תוכנת המחשוב, לחץ על הכרטיסייה בית, ואחריו הגדר נתיב. בחלון המוקפץ, לחץ על הוסף באמצעות תיקיות משנה. תחת נתיב החיפוש MATLAB, בחר את התיקיה המוצגת.

לאחר מכן לחץ על שמור וסגור. ודא שסקריפטי הניתוח מקושרים לתוכנת המחשוב על-ידי בדיקה שהם מופיעים בחלונית השמאלית. לאחר מכן, העבר את קבצי התמונה הגולמיים לדוגמה שנרכשו לכונן המקומי של המחשב.

לאחר מכן לחץ על BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. m ניתוח קובץ סקריפט בתוכנת המחשוב. כדי להפעיל את התסריט, לחץ על הכרטיסייה עורך, ואחריו כפתור ההפעלה הירוק.

בחלון הבקשה שמופיע, בחר את קובצי התמונה הגולמיים לניתוח. הזן את זמן החשיפה עבור זמן הרכישה לכל מסגרת. לאחר מכן לחץ על אישור. הפעל את GetFirstAmplitude.

m script על התיקייה המכילה את קבצי AveSpectrum. המתן עד שהסקריפט יפיק את ה- FirstAmplitudeStacked. קובץ XLSX, המכיל את תדירות המשרעת הגבוהה ביותר, ונמצא בטווח הפיזיולוגי של מכות ריסונים אפיתל בדרכי הנשימה.

העתק את ערכי התדירות מ- FirstAmplitudeStacked. קובץ XLSX, ולתכנן אותם באמצעות תוכנת ניתוח מדעי. מוצגות התוצאות של תדירות פעימות הריסונים שנמדדו במודלים של תאי אפיתל בדרכי הנשימה ALI שמקורם בשלושה משתתפים עם סיסטיק פיברוזיס ושלושה משתתפי בקרה בריאים.

ביום ה-14 של בידול תרבותי, הכאת ריסים היו נוכחים. מהיום ה-14, היום ה-21 להבחנה בתרבית, לא נצפתה עלייה מובהקת סטטיסטית בתדירות פעימות הריסונים בין קבוצות. ביום ה-21 של התמיינות התרבית, תדירות פעימות הריסונים הממוצעת בקרב משתתפי בקרה בריאים הייתה גבוהה משמעותית מזו של משתתפים עם סיסטיק פיברוזיס.

יתר על כן, כאשר תדירות פעימות הריסונים צולמה באותם מודלים של תאים לאחר הסרת ריר, חלה עלייה מובהקת סטטיסטית בתדירות פעימות הריסונים כאשר הוסרה ליחה במודלים של ALI הן של אנשים בריאים והן של אנשים עם סיסטיק פיברוזיס. סביבת ההדמיה חייבת להיות מוסדרת בקפידה, שכן תפקוד cilia הוא רגיש מאוד לשינויים בגורמים סביבתיים. לפלטפורמה זו יש פוטנציאל להתבסס לצורך בדיקת תרופות ספציפיות למטופל כדי להיות מסוגלת לזהות תרופות המווסתות את תפקוד ה-CFTR.