יצירת אורגנוידים של לב אנושי המורכבים בעצמם המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

פרוטוקול זה מאפשר לנו ליצור מבנה תלת-ממדי מורכב הדומה מאוד ללב האנושי המתפתח בצורה חסכונית פשוטה, שניתן לשכפל על פני קווי תאים. זה מורכב פרוטוקול אחד עם שלושה שלבים של בידול, אשר מעורר את כל סוגי התאים של הלב, כולל תאים ורשת כלי דם. טכניקה זו מאפשרת לנו לדגמן מגוון רחב של מחלות לב וכלי דם אנושיים ולמסך טיפולים תרופתיים יעילים.

הודות לאופי התפוקה הגבוה של העיצוב שלה. שיטה זו שימושית לחקירת הלב האנושי המתפתח, כמו גם מחלות הקשורות אליו בדרך כלל. אחד מהם הוא מומים מולדים בלב.

פרוטוקול זה דורש מיומנויות בסיסיות של תרבית תאים. אנו ממליצים על צנרת קשובה ועדינה, כמו גם טיפול עדין באורגנוידים. התחל על ידי יצירת גופים עובריים או EBs יומיים לפני בידול.

לשטוף HPSCs תת-מפגש עם DBPS למשך 10 שניות לפחות. ואז לשאוף DPBS. הוסף מיליליטר אחד של טמפרטורת החדר ACUTA והקש בעדינות על הצלחת כחמש פעמים בכל דקה במשך שלוש עד חמש דקות כדי לגרום לניתוק, תוך כדי בדיקה מתחת למיקרוסקופ.

לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של PSC בינוני ותיאס Avin או תיאס כדי לעצור את התגובה. Pipette התקשורת למעלה ולמטה בבאר, פעמיים עד שלוש פעמים כדי ליצור השעיה תא אחד ולאסוף את התאים. לאחר מכן להעביר את ההשעיה תא יחיד לצינור צנטריפוגה להסתובב במשך חמש דקות ב 300 פעמים G.Aspirate supernatant ולבלות מחדש את התאים במיליליטר אחד של PSC בינוני ותיאס.

לדלל את התאים ב- DPBS. לספור את התאים באמצעות מונה התא או ציסטומטר hemo לדלל את התאים במדיום PSC עם תיאס לריכוז של 100, 000 תאים למיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטרים של השעיית תאים מדוללים לכל באר של צלחת אולטרה נמוכה תחתית עגולה 96.

צנטריפוגות הלוח ב 100 פעמים G במשך שלוש דקות ודגורה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות בזהירות להסיר 50 microliters של בינוני מכל באר ולהוסיף 200 הליבה המלטה של בינוני PSC טרי, חם ל 37 מעלות צלזיוס עבור נפח של 250 microliters לבאר. לדגור על התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

הסר 166 microliters או שני שליש בינוני מצד אחד של כל באר, ולהוסיף 166 microliters של RPMI 1640 המכילים תוסף B27 ללא אינסולין, שישה 990211 לעודד מיקרומולר, 0.875 ננוגרם למיליליטר של חלבון מורפוגנטי עצם ארבעה ו 1.5 ננוגרם למיליליטר של Activin A.Incubate במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות להסיר 166 microliters של בינוני מצד אחד של כל באר ולהוסיף 166 microliters של RPMI טרי 1640 עם תוסף B27 ללא אינסולין. דגירה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

כדי לגרום למפרט mesoderm לב ביום השני, להסיר 166 microliters של בינוני מכל באר ולהוסיף 166 microliters של RPMI 1640, המכיל תוסף B27 ללא אינסולין ושלושה מיקרומולר Wnt-C59 ולהמשיך דגירה במשך 48 שעות. ביום הרביעי, להסיר 166 microliters של בינוני מכל באר ולהוסיף 166 microliters של RPMI טרי 1640 עם תוסף B27 ללא אינסולין, ולאחר מכן לדגור עוד 48 שעות. ביום השישי, להסיר 166 microliters של בינוני מכל באר ולהוסיף 166 microliters של RPMI 1640 עם תוספת B27.

עבור זה ואת כל השינויים הבאים מדיה, להשתמש תוסף B27 עם אינסולין, דגירה עוד 24 שעות. ביום השביעי, תרבות התא מוכנה לבידול מקצועי. הסר 166 מיקרוליטרים של בינוני מכל באר והוסף 166 מיקרוליטרים של RPMI 1640 טרי המכיל תוספת B27 ושלושה מיקרומולרים לעודד 99021.

לאחר מכן בדגרה במשך שעה אחת, לאחר שעה אחת להסיר את הצלחת מן האינקובטור, להסיר 166 microliters של בינוני מצד אחד של כל באר ולהוסיף 166 microliters של RPMI טרי 1640 המכיל תוספת B27 להמשיך דגירה עוד 48 שעות. חזור על תהליך זה כל 48 שעות עד איסוף. Organoids מוכנים ניתוחים וניסויים ביום 15 כדי להעביר את האורגנוידים כולו, לחתוך את הקצה של פיפטה P200, חמישה עד 10 מילימטרים מהפתח עם קוטר של כשני עד שלושה מילימטרים.

לחץ על בוכנה pipette ולהכניס את הקצה אנכית לתוך התחתית העגולה היטב עם organoid. קח בערך 100 עד 200 מיקרוליטרים של בינוני מספיק כדי לאסוף את organoids ולהעביר אותם ליעד היעד. לפני בידול EBS מופיעים כמו שחורים מסות כדוריות תהליך הבידול מתחיל ביום אפס עם הפעלת מסלול Wnt ותוספת גורם גדילה בדיוק 24 שעות.

בהמשך העריכה של Wnt C59 ביום השני גורמת להגדלת האורגנויד מכ-200 מיקרומטר למקסימום של מילימטר אחד. האורגנוידים של הלב האנושי החלו לפעום כבר ביום השישי ו-100% מהאורגנואידים הראו מכות נראות לעין ביום העשירי. תמונות הגדלה גבוהה של אורגנויד יום שביעי גילו כי רוב היד אחת מבטאת תאים היו cardiomyocyte במקור ויד שתיים היו תאים שאינם myosite מן שדה הלב השני, תאי האב.

תמלילי RNA הן ביד אחת והן ביד השנייה באו לידי ביטוי מהיום השלישי ואילך בנתוני ריצוף הרנ"א. סמני ה- FHF התבטאו מאוד בימים 3 ו -11 בעוד סמן SF בא לידי ביטוי גבוה יותר לאחר היום ה -13. כתם אימונופלואורסצנטיות חשף את נוכחותן של שושלות שונות מסוג תאי הלב האנושיים המרכיבות את הלב האנושי.

כגון רקמת שריר הלב והאפיקרדיה, תאי אנדוקרדיים, תאי אנדותל ופיברובלסט לבבי. הסמנים המבטאים את שושלות התאים לעיל נצפו גם בפרופילי ביטוי הגנים RNA SAC. הדמיית סידן חיה של תאים בודדים באורגנוידים שלמים שימשה למדידת התפקוד האלקטרופיזיולוגי של האורגנוידים.

עוצמת הפלואורסצנטיות של Fluo-4 השתנתה עם הזמן עקב יציאת כניסת סידן מהתא החושפת פוטנציאל פעולה קבוע. מפות חום המציגות עוצמות סידן מעל אזור הגדלה גבוה של האורגנויד, מראות עוצמה מוגברת עקב סידן ארעי ותאים בודדים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי EBs ו organoids הבאים אינם מחוברים לתחתית הצלחת, ואנו לנוע עם ההסרה בנוסף מדיה הדורשת שינויים תקשורתיים קשובים.

Organoids יכול להיות תרבות לתקופות זמן ארוכות יותר הציג טכניקות התבגרות, או אפילו חשוף לגירויים חיצוניים, כגון מיזוג מכני או חשמלי, ואפילו גורמי לחץ כגון רעלים. טכניקה זו מאפשרת גישה לשלבים של התפתחות הלב העוברי האנושי שאינם נגישים אחרת במחקר, וסוללת את הדרך לתובנות חדשות על התפתחות הלב ואטיולוגיה של מחלות.