בדיקת מיקרו-פטרנינג למדידת כיראליות תאים

בדיקת כיראליות תאי באסט מיקרו-פטרנינג היא כלי רב עוצמה לחקר מורפוגנזה כיראלית רב-תאית בהתפתחות מחלות. זה חשוב גם למחקר בתאים. מערכת macropattern זו קלה לייצור ולשימוש, מסוגלת להפיק תוצאות אמינות ביותר וניתנות לחזרה, והיא גם תואמת לעיבוד אוטומטי בתפוקה גבוהה לגודל מדגם גדול.

התחילו בחיתוך המגלשה המצופה בזהב טיטניום לחתיכות מרובעות קטנות בגודל של כ-12 על 12 מילימטרים. באמצעות חותך זכוכית, החליקו על פני השטח כדי להשאיר מסילה מעוותת, ואז החזיקו את מגלשת הזכוכית משני הצדדים והתכופפו לעבר השקע כדי לפרוץ לרבעים קטנים. כדי לנקות את המגלשה, משרים אותה עם הצד המוזהב כלפי מעלה ב-100% אתנול הכלול בצלחת פטרי על שייקר מסלולי למשך 10 דקות לפחות.

לאחר שאיפת האתנול, ייבשו את המגלשה על ידי נשיפה עם זרם חנקן. נקו את חותמות הפולידימתילסילוקסן או PDMS במי סבון לפני ייבוש החותמת בגז חנקן. ממיסים 5.74 מיליגרם של אוקטאדקנתיול או C18 ב-10 מיליליטרים של 100% אתנול כדי ליצור תמיסת C18 של שני מילימולר, ולאחר מכן מנקים את חותמות ה-PDMS עם 100% אתנול.

השרו את חותמת ה-PDMS כאשר משטח התבנית פונה כלפי מטה בתמיסת C18 למשך 10 שניות ולאחר מכן ייבשו אותה בעדינות בגז חנקן למשך 60 שניות. לאחר הייבוש, הניחו את הבול הפונה כלפי מטה אל מגלשת הזהב למשך 60 שניות לפני ההסרה. כדי להבטיח הטבעה נכונה, הקישו בעדינות על הפינצטה על החותמת כדי להעביר את התבניות כראוי.

לאחר מכן, הכינו את תאי הלחות על ידי צנרת מיליליטר אחד של 70% אתנול למכסה צלחת פטרי הפוך. ובעזרת הפינצטה, הניחו חתיכת פרפילם כדי לכסות את פני השטח ולהבטיח שלא יישארו בועות. הסר את האתנול העודף במידת הצורך.

הוסיפו 40 טיפות מיקרוליטר של תמיסת EG3 עבור כל רבע החלקת זכוכית על הפרפילם בתא הלחות, והשאירו מספיק מקום בין הטיפות כדי לקחת בחשבון את המרווח של שקופיות הזהב. השתמש בפינצטה כדי למקם את שקופית הזהב המודפסת C18 הפונה כלפי מטה אל הטיפה, ולהבטיח שלא יישארו בועות מתחת לשקופית. דחפו בעדינות את המגלשות זו לזו מבלי להרים אותן כדי למזער את האידוי.

לאחר אטימת צלחת הפטרי בחוזקה עם פרפילם, השאירו אותה בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות לפחות. בארון בטיחות ביולוגית, משרים ושוטפים את מגלשת הזהב הפונה כלפי מעלה שלוש פעמים ב-70% אתנול כדי להסיר EG3, ואז משאירים את האתנול למשך 10 דקות לעיקור. לאחר שאיפת האתנול, הוסיפו PBS סטרילי.

הכינו תא לחות נוסף עם PBS במקום אתנול כפי שהודגם. לאחר מכן, הוסיפו 50 טיפות מיקרוליטר של תמיסת פיברונקטין עבור כל רבע החלקה על הפרפילם, והשאירו רווח מסוים בין הטיפות. לאחר מכן הניחו את המגלשה הפונה כלפי מטה אל הטיפה כפי שהוכח קודם לכן והשאירו את צלחת הפטרי בארון הבטיחות הביולוגית למשך 30 דקות.

לאחר שטיפת המגלשה המצופה זהב, הניחו את המגלשה הפונה כלפי מעלה ב-PBS. לפני זריעת התאים, חממו את המדיה והטריפסין באמבט מים התמזג בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לחיבור טוב יותר של התאים, משרים את שקופית התבנית בצלחת בת 12 בארות המכילה מדיית תרבית ומחממים אותה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.

לאחר שהתאים עוברים טריפסיניזציה, מנטרלים את התאים עם FBS המכיל מדיה, מפילים את התאים ב-100 פעמים G למשך שלוש דקות ואז מנצלים מחדש את גלולת התא במדיה טרייה. לספור את התאים ולדלל את תרחיף התא כדי להשיג את הריכוז של 200, 000 תאים למיליליטר. הוסיפו 0.5 מיליליטרים של תרחיף התא לכל באר המכילה מגלשת זהב אחת.

יש לנער בעדינות את הצלחת מספר פעמים לצורך זריעת תאים אחידה לפני דגירה למשך 15 דקות לחיבור התא. לאחר 15 דקות, בדוק את חיבור התא תחת מיקרוסקופ, ובמידת הצורך, דגירה למשך זמן נוסף. לאחר חיבור התאים, שאפו החוצה את המדיה המכילה תאים לא מחוברים מכל באר והוסיפו מיליליטר אחד של מדיית תרבית טרייה.

תרבית את התאים באינקובטור במשך 24 שעות ובדוק את המפגש כדי לקבוע אם נוצרה כיראליות. כאשר המפגש הנדרש מושג, תקן את התאים על ידי הסרת מדיית התרבית. לאחר שטיפה עם PBS פעם אחת, הוסיפו תמיסת פרפורמלדהיד של 4% למגלשה ודגמו את טמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני השטיפה שוב עם PBS שלוש פעמים.

כדי להשיג את התמונות, השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם פונקציונליות המצלמה וצלם כל טבעת בשקופית ברזולוציה גבוהה. לאפיון כיראליות, הורד את קבצי הקוד של MATLAB, הוסף את תיקיית הקוד ואת תיקיות המשנה לנתיב MATLAB ופתח את ROI_selection. קובץ m.

בשורה הרביעית, שנה את הספריה לתיקיית הנתונים הרצויה. שנה את גודל התמונה בשורה 14 כאשר שתי הדמויות הראשונות מייצגות את גודל העיגול הפנימי של הטבעת בעוד שהשתיים האחרות מייצגות את החיצוני. כדי לקבוע את אזור העניין או ההחזר על ההשקעה בתמונות ניגודיות הפאזה, הפעל את קוד MATLAB ROI_selection.

m על ידי לחיצה על לחצן הפעלה. גררו ידנית את ריבוע הבחירה כך שיתאים לטבעת, ולאחר מכן לחצו פעמיים על התמונה כדי לאשר את הבחירה. לאחר בחירת ROI מכל התמונות בתיקייה, ייווצר קובץ Mat כדי לאחסן את פרטי ההחזר על ההשקעה עבור כל תמונה.

לאחר מכן פתח את analysis_batch. m קובץ ושנה את ספריית התיקיה כפי שהודגם קודם לכן. לחץ על כפתור ההפעלה כדי לבצע את analysis_batch הקוד.

m כדי לקבוע את הכיראליות של תבניות טבעת תאיות מרובות. A datatoexcel. קובץ txt ייווצר המכיל נתונים סטטיסטיים מעגליים עבור כל טבעת, כמו גם את המספרים של טבעות לא כיראליות ואנטי כיוון השעון נגד כיוון השעון.

הממצאים הנוכחיים מדגימים את התועלת של בדיקת כיראליות תבנית הטבעת שפותחה באופן ניסיוני, כמו גם את הרגישות של מבחן זה לשינויים בשלד הציטוסקלטון. במחקר הנוכחי, נמצא כי על ידי שיבוש הפילמור של אקטין עם 50 טיפול latrunculin A ננומולרי, תאי המיובלסט C2C12 של העכבר הפגינו שינוי של הטיה כיראלית נגד כיוון השעון או CCW לתוספת של כיוון השעון או CW.In, תאי האנדותל של כלי הדם הטבוריים האנושיים או hUVECs שטופלו ב-12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate או TPA כדי להפעיל את החלבון קינאז C הציגו העברה תלוית מינון של כיראליות התא מ-CW ל-CCW. לאחר זריעת תאים לדפוסים, ניתן להשלים כימיקלים או תרופות למדיום כדי לחקור את התגובה, וניתן לשלב את מערכת transwell כדי לחקור תרבית משותפת של תאים.

בדיקה זו מספקת כלי יעיל לחקר כיראליות רב-תאית תחת מסגרות ניסוי שונות ומציעה תובנות חשובות לגבי תפקידה של כיראליות התא בתופעות ותהליכים ביולוגיים שונים.