בידוד של תאי שריר חלק אבי העורקים העיקריים הספציפיים למטופל ומדידות כיווץ חצי-קוונטיטיביות בזמן אמת במבחנה

שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את התכווצות התאים של מספר תאי מטופלים בו זמנית. זה מאפשר לנו לחקור מחלות מהר יותר וביעילות רבה יותר. טכניקה זו מאפשרת לנו לכמת את התכווצות התא בזמן אמת.

תוך שעה אנו יכולים לקבל את ערכי ההתכווצות של עשרות תאים. הדגמנו לראשונה שהתכווצות תאי השריר פוחתת בקבוצת חולים עם מפרצת באבי העורקים. זה יכול להיות סמן ביולוגי חדש או יעד חדש לטיפול רפואי.

התחילו בעיקור שני זוגות מלקחיים כירורגיים ואיזמל על ידי טבילתם ב-70% אתנול ולאחר מכן ניגובם יבש. לאחר מכן פיפטה שני מיליליטרים של מדיום SMC בצלחת פטרי שבה תבוצע כריתת הרקמה. הבא pipette 2.5 מיליליטרים של SMC בינוני לתוך שני צלוחיות T-25.

סובבו את הצלוחיות כך שהנפח הקטן של המדיום יכסה את כל פני השטח. לבחון חזותית את הביופסיה, ולזהות את שלוש שכבות אבי העורקים על ידי נוכחות של פלאקים טרשת עורקים בצד האינטימה ורקמת חיבור דקה בצד ההרפתקני כדי להבחין בין השכבות. כדי לבודד SMCs מהתקשורת, הסר את שתי השכבות האחרות על ידי הצבת הרקמה עם רובד האינטימה בצד הראשון למעלה, ולאחר מכן הסר את הפלאק המוצק על ידי משיכתו מהרקמה עם מלקחיים תוך דחיפת הרקמה כלפי מטה עם זוג המלקחיים השני עד שהשכבה המדיאלית האחידה הוורודה נראית לעין.

עכשיו להפוך את הרקמה ולחזור על אותו הליך על ידי משיכת השכבה הרפתקנית, הקפדה להסיר את כל החלקים הנראים לעין בכמה ניסיונות הדרושים ככל שיידרש כמו שכבה זו לא תתנתק מהתקשורת בקלות. לאחר בידוד שכבת המדיה, חותכים את הרקמה לקוביות על ידי לחיצה על המדיה כלפי מטה עם מלקחיים וחותכים את הרקמה בכיוון אחד באמצעות האזמל תוך ביצוע חתכים חד כיווניים נקיים כדי למזער את הנזק. מקם 10 עד 20 של חתיכות רקמה אלה ברבעון העליון של T-25 flak באמצעות מלקחיים.

לאחר עיקור שני זוגות מלקחיים כירורגיים ואזמל כפי שתואר קודם לכן, פיפטה שני מיליליטרים של מדיום פיברובלסט בצלחת פטרי שבה תבוצע כריתת הרקמה. לאחר מכן פיפטה 2.5 מיליליטרים של מדיום פיברובלסט לשני צלוחיות T-25 ומסובבת את הצלוחיות כך שהנפח הקטן של המדיום מכסה את כל פני השטח. בדקו חזותית את הביופסיה לזיהוי האפידרמיס עם משטח עור מוכר, לפעמים עם שיער גלוי, ואז חפשו שומן תת עורי צהוב ורזה בצד הנגדי.

השכבה בין האפידרמיס לשומן התת עורי היא הדרמיס, המקור לפיברובלסטים בני קיימא. כדי לבודד פיברובלסטים מהדרמיס, הסר את שתי השכבות האחרות על ידי הצבת הרקמה בצד הדרמיס כדי להפוך את כל שלוש השכבות לגלויות לעין. לאחר מכן החזיקו את הרקמה עם מלקחיים וחתכו את כל האפידרמיס בקו אחד נקי מבלי לפגוע ברקמה.

עכשיו להפוך את הרקמה ולחזור על אותו הליך על ידי חיתוך בתוך דרמיס במקביל לגבול עם השומן התת עורי. לאחר בידוד הדרמיס, חותכים את הרקמה לקוביות הלוחצות על הרקמה עם מלקחיים וחותכים את הרקמה בכיוון אחד באמצעות האזמל. לאחר מכן הניחו 10 עד 20 מחתיכות הרקמה הללו ברבעון העליון של בקבוקון T-25 באמצעות המלקחיים.

ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי וזרעו את ה-SMCs במשולש בצפיפות זריעה של 30, 000 תאים לבאר ב-200 מיקרוליטרים של מדיום SMC בצלחת ECIS המצופה בג'לטין. מניחים את הצלחת עם ה-SMCs לתוך מחזיק 96 הבארות של ECIS בחממת תרביות התאים. לחץ פעמיים על תוכנת ECIS Applied BioPhysics כדי לפתוח את התוכנית וללחוץ על כפתור ההתקנה.

בדוק אם לכל האלקטרודות יש קשר עם המחזיק בלוח התחתון השמאלי המסומן Well Configuration. אם האלקטרודות אינן מחוברות כראוי, התאם את הלוחית במחזיק לפני תחילת המדידה. כעת בחר את סוג הלוח באותה חלונית על-ידי לחיצה על סוג מערך.

לאחר מכן, הכינו שתי פיפטות בעלות נפח של שני מיקרוליטר ו-150 מיקרוליטר. לפני שתתחיל את הגירוי, לחץ על מארק בתוכנה והנח הערה. כדי לעורר את התאים, להסיר את המכסה ולהניח אותו על משטח סטרילי בתוך האינקובטור.

לאחר מכן לגרום להתכווצות SMC על ידי צנרת שני מיקרוליטרים של תמיסת העבודה של היונומיצין לכל באר במהירות האפשרית. לאחר שכל התאים היו מגורה, ערבבו את המדיום בבארות באמצעות הפיפטה השנייה. כדי לקבוע את יכולת השחזור של מדידה בין-ניסיונית, שתי מדידות בלתי תלויות של כל קווי תאי הבקרה והחולה הכלולים הותוו כמתווה של בלנד-אלטמן, והוכיחו כי שיטה זו לא הראתה שונות מחוץ לרווח בר-סמך, למעט קו תא חריג אחד.

שתי בארות שנזרעו באותו ניסוי ועוררו בו זמנית הראו כמעט את אותה עקומת תגובה חוזית. כדי לאמת אם התגובה המוצגת הייתה התכווצות ולא מתח אוסמוטי בגלל גירוי יונומיצין, המדיום הוחלף לאחר הגירוי וההתנהגות של התאים נרשמה, מה שהראה כי התאים המגורים החלו להתפשט שוב על האלקטרודה. התגובה החוזית ב-SMCs שמקורה באורטות בריאות ולא מורחבות הראתה תגובה חציונית של 61% לעומת התגובה החציונית של 52% ממטופלי מפרצת באבי העורקים הבטני.

תגובת ההתכווצות הממוצעת של קבוצת הביקורת שימשה לזיהוי ארבעה מטופלים בעלי ערכי התכווצות נמוכים יותר מהערכים הרגילים. ניתוח הכתמים המערבי והכימות שלאחר מכן אישרו כי התאים מבטאים סמני SMC. לקביעת יכולת ההתפשטות של ה- SMC, qPCR בוצע עבור Ki67.

ביטוי Ki67 היה ניתן לזיהוי בכל התאים, אך לא תאם את תפוקת ההתכווצות. כאשר מגרה את התאים להתכווצות, זכור לא לטפטף יותר מדי בארות בו זמנית וניסה לקטר מהר ככל האפשר. הליך זה עשוי להצריך תרגול מסוים.

באמצעות שיטה זו, חילקנו את המטופלים על סמך התכווצותם ועל סמך התכווצות תקינה נמוכה יותר, מה שאיפשר לנו לחקור את המטופלים הללו ואת הקשרים למאפיינים הקליניים שלהם כגון עישון.