ניתוח ספטיוטמפורלי דו-ממדי אוטומטי של בדיקות FRET ניידות בעלות מולקולה אחת
23 בנובמבר 2021
מאמר זה מציג שיטה לניתוח spatiotemporal של נייד, מולקולה אחת Förster העברת אנרגיה תהודה (smFRET) מבוסס בדיקות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. ערכת הכלים החדשה שפותחה מאפשרת לקבוע עקבות זמן smFRET של בדיקות נעות, כולל היעילות הנכונה של FRET ואת העמדות המולקולריות, כפונקציות של זמן.
ניסויי FRET בעלי מולקולה אחת באמצעות גשושיות הקשורות לפני השטח בוצעו כמעט אך ורק על מולקולות משותקות בעבר. עם זאת, ביומולקולות רבות מפוזרות וניתן לנתח אותן בשיטה שלנו. שילוב של FRET מולקולה אחת עם מעקב מאפשר לנתח לא רק עקבות זמן חוסר FRET של בדיקות נעות, אלא גם לחקור היבטים מרחביים כגון התנהגות מפוזרת.
השיטה שלנו תואמת למגוון בדיקות שונות המבוססות על FRET. לדוגמה, הוא יכול לספק תובנות לגבי כוחות מולקולריים, דינמיקה קונפורמציה וקינטיקה מחייבת בניסויים בתאים חיים. ניסויי FRET באיכות גבוהה של מולקולה אחת ידועים לשמצה כקשים לביצוע.
לכימות אמין, חשוב להקליט נתונים ביחס אות לרעש טוב ומסלולי מולקולה אחת באורך מספיק. כדי להתחיל במדידה מדגמית, רגש את פלואורופורים התורם והמקבל לזמן תאורה מתאים תוך הפעלת המצלמה והמתן עד לקריאת המצלמה. חזור על עירור של התורם ומקבל פלואורופורים לחילופין.
בחר את מספר החזרות להיות גדול מספיק כדי להבטיח צילום של לפחות פלואורופור אחד לכל בדיקה בתוך שדה הראייה המאפשר ניתוח צילום צעדים כדי להפלות אותות מולקולה אחת מצרגטים. ציין את רצף התאורה כדי לאפשר את בחירת מסגרות עירור התורם והמקבל וכן מסגרות לפילוח תמונות מתוך רצפי תמונות מוקלטים. בו-זמנית, נתח את ערכות הנתונים שנרשמו באמצעות אותן הגדרות תאורה.
לשם כך, הקצה מזהה ותבנית התואמים לשמות הקבצים המתאימים של רצף התמונות לכל ערכת נתונים. בנוסף, הגדר ערכות נתונים ספציפיות למטרות מיוחדות כגון הקלטות של סמנים fiducial לרישום תמונה, פרופילי תאורת עירור לתיקון שדה שטוח, ודוגמאות אופציונליות לתורם בלבד ומקבל בלבד כדי לקבוע גורמי תיקון. לאחר מכן, בחר ערוצי פליטה ותמונות גולמיות אם שני הערוצים מוקלטים באמצעות מצלמה אחת.
לשם כך, השתמש בווידג'ט הגרפי המתאים כדי לבחור אזורים מתאימים לפליטת תורמים ומקבלים, ולאחר מכן הפוך סמנים פימודיים לשפות אחרות בשני ערוצי הפליטה ולבצע רישום תמונה. השתמש בממשק המשתמש שסופק כדי למצוא את הפרמטרים המתאימים עבור אלגוריתם הלוקליזציה עבור ערוצי פליטת התורם והמקבל. לאחר מכן, הגדר פרמטרים של לוקליזציה של מולקולה אחת עבור בדיקות FRET בעת עירור התורם בסכום התמונות המתקבלות מפליטות תורמים ומקבלים, ולאחר מכן הגדר פרמטרים של לוקליזציה לבדיקות בעת עירור מקבל בערוץ פליטת המקבלים.
לוקליזציה של בדיקות ה- FRET על עירור תורמים ומקבלים באופן עצמאי בכל המסגרות. התוצאות ממוזגות לטבלה אחת המכילה את מספר המסגרת המקורי, קואורדינטות דו-ממדיות ומזהה המפנה לקובץ תמונת המקור. כדי לעקוב ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות, בחר באפשרויות המתאימות עבור אלגוריתם Trackpy כדי לקשר לוקליזציה של בדיקות FRET למסלולים.
לאחר מכן, באמצעות הפונקציונליות של תוכנת הניתוח, עבד נתוני תמונה עזר מרצף תמונות. חלץ תמונות נוספות שנרשמו כדי להקל על פילוח המסומן על-ידי S ברצף העירור. לבסוף, קבעו את פרופילי אורות עירור התורם והמקבלים ברחבי שדה הראייה מתמונות שנרשמו במדגם בעל תווית צפופה.
עבור שלבי הסינון הראשוניים, מחק אותות עם פונקציות של התפשטות נקודות חופפות מכיוון שקשה לקבוע את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהם באופן אמין. במקרה של תאורה לאהומוגנית, קבל רק אותות הממוקמים באזורים מוארים היטב בתוך שדה הראייה כדי להבטיח יחס אות לרעש טוב. אם אתה לומד FRET תוך גולגולתי, הגבל את הניתוח למסלולים הקיימים מתחילת רצף התמונות.
לאחר מכן, בצע את תיקון השדה השטוח, המשתמש בפרופילי מקור אור עירור שהושגו קודם לכן כדי להפוך את וריאציות עוצמת הפלואורסצנטיות התלויות במיקום הנגרמות על ידי תאורה לא הומוגנית, ולאחר מכן לחשב את יעילות FRET לכאורה ואת stoichiometry לכאורה. כדי לבצע ניתוח צעדי של הלבנת פוטוקלור להפלות בין בדיקות מולקולריות בודדות לבין אגרגטים, מצא פרמטרים מתאימים לאלגוריתם זיהוי נקודת השינוי על עירור התורם והמקבל באופן עצמאי. לאחר מכן בצע את אלגוריתם זיהוי נקודת השינוי.
כדי להסיר רצועה המציגה אופן פעולה רב-משמעי של הלבנת פוטו,הגדר סף עוצמה שמתחתיו פלואורופור נחשב מולבן, ולאחר מכן בחר אחת מהאפשרויות הבאות. אפשרות ראשונה שבה הפלואורופור מקבל מלבין בצעד אחד בעוד התורם אינו מראה הלבנה חלקית. אפשרות שנייה שבה התורם מלבין בצעד אחד בזמן שאין הלבנת קבלה חלקית.
אפשרות שלישית שבה כל הפלואורופור מלבין בצעד אחד בעוד השני אינו אקונומיקה חלקית. ואפשרות 4 שבה פלואורופורים של תורמים ומקבלים מראים צילום חד-שלבי או בלי הלבנת תמונות כלל. לאחר מכן חשב את גורמי התיקון עבור דליפת פליטת תורמים לערוץ המקובל, עירור קבל ישיר, יעילות זיהוי ויעילות עירור.
לאחר מכן, השתמש בגורמי התיקון כדי לחשב את יעילות FRET מיעילות לכאורה וסטואיכיומטריה מסטויצ'ומטריה לכאורה. לסינון נוסף, בחר רק נקודות נתונים מלפני אירוע ההלבנה הראשון בכל מסלול. בנוסף, כדי להגביל את הניתוח לבדיקות מולקולה אחת, לקבל רק מסלולים עם לפחות 75% של נקודות נתונים בתוך גבולות stoichiometry המתאימים.
לאחר מכן בצעו פילוח תמונות באמצעות שיטות סף כלליות או אדפטיביות בתמונות העזר המתאימות כדי להגביל את הניתוח לאזורים נפרדים בתוך שדה הראייה. צור יעילות לעומת התוויות סטויצ'ומטריה כדי לוודא שאותות של סטויצ'ומטריה שגויה זוהו והוסרו כראוי. לאחר מכן התווה היסטוגרמה של יעילות FRET כדי לספק סקירה מבוססת היטב של הפצות יעילות FRET ולקבץ את ההיסטוגרמות להשוואה נוחה של תוצאות מניסויים שונים.
תוך ניצול ספריות פייתון מדעיות, ניתן להעריך עוד יותר את הנתונים בתוך המחברת, ולבצע, למשל, ניתוח דיפוזיה. הדמיה ומעקב אחר אירוע FRET של מולקולה אחת מוצגים כאן. אירועי FRET מסוננים מיוצגים על-ידי יעילות לעומת התוויות סטויצ'ומטריה בהיסטוגרמת יעילות FRET.
יתר על כן, ניתן לחקור פרמטרי ניידות על-ידי התוויית נתיב מסלול בודד בעלילת XY או עלילת תזוזה מרובעת ממוצעת. הפלט של הפלטפורמה שלנו מאפשר לנו לזהות עוד יותר מעברים בעקבות זמן היעילות של FRET של בדיקות ניידות. לדוגמה, כדי להעריך שינויים קונפורמציה של ביומולקולות.
באמצעות חיישן כוח מבוסס FRET, פלטפורמת הניתוח אפשרה לנו לכמת אירועי כוח של מולקולה אחת בתוך הסינפסה החיסונית במהלך איתות תאי T מוקדם.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לניתוח מרחבי-זמני של גששים ניידים המבוססים על העברת אנרגיה בתהודה של פרסטר במולקולה בודדת (smFRET) באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשדה רחב. השיטה מאפשרת קביעת עקבות זמן של smFRET עבור גששים נעים, כולל יעילות FRET ומיקומים מולקולריים כפונקציות של זמן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- ניסויי FRET של מולקולה בודדת התמקדו בדרך כלל במולקולות מקובעות.
- ביומולקולות רבות הן ניידות וניתן לנתח אותן באמצעות שיטה חדשה זו.
- השילוב של FRET של מולקולה בודדת יחד עם מעקב מאפשר את חקר התנהגות הדיפוזיה.
- שיטה זו תואמת ג probes שונים המבוססים על FRET.
מטרת המחקר
- לניתוח עקומות זמן של ליקוי ב-FRET עבור גששים נעים.
- לחקירת היבטים מרחביים-זמניים של דינמיקה מולקולרית.
- לספק תובנות לגבי כוחות מולקולריים, דינמיקה קונפורמציונלית וקינטיקת קישור בניסויי תאים חיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- עירור של פלואורופורים תורמים ומקבלים תוך הפעלת המצלמה.
- הקלטת נתונים תוך התמקדות ביחס אות-רעש ובאורך המסלול.
- רישום תמונות ומיקום של גששי FRET בכל הפריימים.
- ניתוח של עוצמת הפלואורסנציה ויישום מקדמי תיקון לחישובים מדויקים של יעילות FRET.
תוצאות עיקריות
- מעקב ומדידה מוצלחים של גששי FRET של מולקולה בודדת ניידות.
- קביעת יעילות ה-FRET והסטוכיומטריה מתוך הנתונים שהוקלטו.
- זיהוי והסרה של אותות סטוכיומטריה שגויים.
- תובנות לגבי אינטראקציות מולקולריות ודינמיקה באמצעות ניתוח מרחבי-זמני.
מסקנות
- השיטה משפרת את היכולת לנתח ביו-מולקולות ניידות באמצעות smFRET.
- היא מספקת מסגרת חסונה לחקר דינמיקה מולקולרית בתאים חיים.
- ערכת התוכנה שפותחה היא ורסטילית וניתנת ליישום עבור גששי FRET שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ניתוח מרחבי-זמני של גששי smFRET ניידים במולקולה בודדת, ובכך נותנת מענה למגבלה מרכזית ב-smFRET המסורתי הנשען על מולקולות מקובעות. על ידי לכידה הן של יעילות ה-FRET והן של הניידות המולקולרית בממברנות פלזמה או בשכבות ליפידים נתמכות, השיטה מספקת תובנות מכניסטיות לגבי דינמיקה ביומולקולרית הרלוונטית לתיקוף מטרות וזיהוי מובילים. חבילת התוכנה האוטומטית ובקוד פתוח תומכת ביצירת נתונים הניתנים לשחזור לצורך אפיון ביופיזיקלי המשכי ופיתוח בדיקות בקווי תהליך של גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מתאם בין דינמיקה קונפורמציונית לתוצאות פונקציונליות במערכות ביו-מולקולריות ניידות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות תצפית ישירה על שינויים קונפורמציוניים המושרים על ידי ליגנדים בסביבות ממברנה דומות למצב טבעי.
- ערך חיזוי: מגביר את הביטחון במנגנון המטרה על ידי הבחנה בין קישור ספציפי לאינטראקציות לא ספציפיות באמצעות מסלולי FRET מרחביים-זמניים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצרת נתוני יעילות FRET וסטוכיומטריה כמותיים המתאימים לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של ספריות תרכובות מול מטרות ניידות.
- שחזוריות: מיקום, מעקב ויישום של פקטורי תיקון באופן אוטומטי מבטיחים איכות נתונים עקבית בין ניסויים ומשתמשים שונים.
- מדרגיות: תואם למיקרוסקופיית שדה רחב (widefield microscopy) ולכלים בקוד פתוח, מה שמאפשר פריסה במספר סביבות מעבדה ללא צורך במכשור קנייני.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: הוכח כי השימוש בשיטה יעיל לחקר הדינמיקה של הסינפסה האימונולוגית במהלך סיגנל תאי T מוקדם, ובכך מקשר בין מנגנונים מולקולריים לתפקוד תאי.
- המשכיות טרנסלציונלית: מקל על המעבר מאפיון ביומולקולרי in vitro להקשר של תאים חיים, ובכך תומך במידול חזוי של קישור בין תרופה למטרה.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מאפשר זיהוי של תוצרי ביניים חולפים ומעברים קונפורמציונליים שעשויים לספק מידע לתכנון מבוסס מבנה ולחיזוי מנגנוני עמידות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות, ובפרט עבור חלבונים הקשורים לממברנה וקומפלקסים דינמיים שבהם הניידות משקפת את התפקוד.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי קישור שינויי FRET שנצפו למצבים ביו-מולקולריים ספציפיים או לאינטראקציות בסביבות רלוונטיות פיזיולוגית.
- סריקה (Screening): מאפשרת פיתוח של בדיקות עבור מטרות הדורשות ניידות דמוית-טבעית, כגון GPCRs או קינזות טירוזין רצפטוריות, שבהן קיבוע עלול לשנות את התפקוד.
- אנליטיקה: מפיקה עקומות זמן של יעילות FRET, מקדמי דיפוזיה ותדרי מעברים המשמשים למודלים של קשר כמותי בין מבנה לפעילות (QSAR).
- מחקר תרגומי: מקשרת בין דינמיקה בקנה מידה מולקולרי לפנוטיפים תאיים, כפי שבא לידי ביטוי ביישומים של חיישני כוח ביצירת סינפסה חיסונית.
- שימוש חוזר ארגוני: אופי הקוד הפתוח והתכנון המודולרי מאפשרים התאמה בין פרויקטים המכוונים למערכות ביו-מולקולריות מגוונות ללא צורך בתיקוף מחדש של האלגוריתמים המרכזיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי פתרון ההטרוגניות באוכלוסיות ביו-מולקולריות באמצעות רזולוציה מרחבית-זמנית של מולקולה בודדת.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של ניתוח smFRET באמצעות תהליכים אוטומטיים, תוך מזעור השונות התלויה במשתמש באימות וכמות של העקבות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי אספקת תובנות כמותיות מוקדמות לגבי קינטיקת מעורבות המטרה וסלקטיביות קונפורמציונית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מובילים (leads) מותאם סיכון, בהתבסס על עקביות מכניסטית בין בדיקות ביוכימיות וביופיזיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת, מושגים של קורלציה של פלואורסצנציה וסביבות לניתוח נתונים מבוססות Python.
- נדרש מיקרוסקוף פלואורסצנציה בשדה רחב (widefield) עם יכולת עירור דו-צבעית, מצלמת EMCCD או sCMOS, והארה יציבה בלייזר עבור ALEX smFRET.
- נדרש סטנדרטיזציה של רצפי ההארה, קביעת מקדמי תיקון וקריטריונים לסינון מסלולים בקרב משתמשים ואתרים שונים.
- התאמה למודלים שונים של ממברנות (למשל, שכבות דו-שכבתיות נתמכות לעומת תאים חיים) עשויה לדרוש אופטימיזציה של צפיפות סימון הגששים ודיכוי רקע.
- מגבלות מעשיות כוללות אילוצי פוטו-בליצ'ינג (photobleaching) על אורך המסלול והצורך ביחס אות-רעש גבוה כדי להבחין במצבי FRET קצרי חיים.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:05
Measurement of Samples
1:38
Localization, Tracking, and Fluorescence Intensity Analysis of Single Molecules
4:03
Analysis and Filtering of Single-molecule Data
6:41
Plotting of Results and Further Analysis
7:17
Results: Spatiotemporal Analysis of Mobile, smFRET-based Probes Using Widefield Fluorescence Microscopy
7:45
Conclusion
