Name: פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: למד פרוטוקול חסכוני לבידוד וגידול תאים דנדריטיים ממח העצם של עכברים באמצעות GM-CSF/IL-4. השיטה מייצרת תאים בטוהר גבוה לחקר חסינות נגד גידולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של טיאנג'ין (20JCQNJC00550), פרויקט המדע והטכנולוגיה של טיינג'ין לבריאות (TJWJ20202021QN033 ו- TJWJ202021QN034).

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג.
1. בידוד מח העצם והכנת תאי BM
<ol><li>להקריב עכברי C57BL/6 (18-22 גרם, בני 6-8 שבועות) באמצעות חנק CO2 . תקן את העכבר בשולחן הניתוחים של העכבר. יש לחטא את המשטחים ב-70% אתנול.</li>
	<li>חתכו את עור הרגל כדי לחשוף את השרירים ואת עורק הירך. מהדקים וקורעים את עורק הירך באמצעות שני מלקחיים, ואז מושכים את הקצה הפרוקסימלי לכיוון הבטן. הערה: אין לחתוך את עורק הירך ישירות. אחרת, זה יגרום לדימום מוגזם ויזהם את שדה הראייה.</li>
	<li>חותכים את כל השרירים סביב עצם הירך.</li>
	<li>מתחו באיטיות את הגפיים התחתונות של העכבר כלפי חוץ עד שנשמע קול נקע מפרק הירך וצניחת ראש הירך נראית לעין.</li>
	<li>להפריד את הגפיים התחתונות מהגוף באמצעות מספריים לאורך החלק הפנימי של ראש הירך.</li>
	<li>חתכו את הרגליים האחוריות מקצה מפרק הברך כדי להשיג עצם ירך חופשית ושלמה.</li>
	<li>הסר את השרירים המחוברים לעצם הירך באמצעות גזה. הערה: אין לקרוע את השרירים ישירות. עצם הירך של העכברים עדינה, יש לשמור על שלמותה.</li>
	<li>לטבול את עצם הירך ב 75% אלכוהול במשך 2-5 דקות.</li>
</ol>2. תרבות האינדוקציה של BMDC
<ol><li>שטפו את שאריות האלכוהול עם PBS. השתמש במלקחיים המוסטטיים כדי להדק את החלק האמצעי והתחתון של עצם הירך ובסט אחר כדי להדק את הקצה התחתון של עצם הירך. המלקחיים ההמוסטטיים מוחלים לרוחב על עצם הירך, ועצם הירך מופרדת מהקו האפיפיזיאלי. הערה: הקו האפיפיזיאלי אינו נראה בקלות עד שעצם הירך נשברת. שלב זה והשלבים הבאים מבוצעים כולם בסביבה סטרילית.</li>
	<li>השתמש במזרק 1 מ"ל (מחט: 0.6 מ"מ x 25 מ"מ) כדי לחדור את חלל מח העצם משבירת הקו האפיפיזי ולסובב את המחט כדי לחדור לראש הירך ודרך חלל מח העצם. דופקים ושוטפים את חלל מח העצם באמצעות 1 מ"ל מהמדיום השלם המכיל GM-CSF/IL-4 עד שהעצם הופכת לבנה. הערה: מדיום תרבית שלם: 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 55 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng/mL GM-CSF ו-10 ng/mL IL-4.</li>
	<li>יש לבצע החייאה של כל התאים ב-24 מ"ל של מדיום תרבית שלם (כ-5 x 105 תאים/מ"ל). לאחר הערבוב, כל המדיום נזרע על צלחת של 6 בארות עם 4 מ"ל / באר, ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 במשך יומיים. הערה: אין צורך לזוז אריתרוציטים.</li>
	<li>החלף את כל המדיום לאחר יומיים במדיום המכיל GM-CSF/IL-47. ביום הרביעי, השישי והשמיני, החליפו מחצית מהמדיום במדיום השלם המכיל 10 ננוגרם/מ"ל GM-CSF/IL-4. הערה: בשלב זה, תאים מרחפים כגון אריתרוציטים ולימפוציטים מוסרים.</li>
	<li>צלם תמונות מדי יום כדי לתעד את צמיחת התאים. החל מהיום השישי, קצצו באר אחת של תאים ביום כדי לספור את מספר התא ולזהות CD11c, CD80 ו-MHC II בביטוי 6,7.</li>
</ol>3. זיהוי ציטומטרי זרימה של הביטוי של CD11c, CD80 ו- MHC II
<ol><li>לאחר שטיפת ה-DCs עם PBS, בצעו החייאה של 1 x 106 תאים ב-100 μL של מאגר FACS, הוסיפו 0.5 מיקרוגרם של נוגדן CD16/32 נגד עכברים, ודגרו במשך 10 דקות על קרח כדי לחסום אתרי אנטיגן לא ספציפיים.</li>
	<li>הוסף 1 מיקרוגרם של Percp/cy5.5-CD11c, 0.5 מיקרוגרם של PE-CD80 ו-0.04 מיקרוגרם של נוגדני APC-MHC II, ודגירה על קרח למשך 30 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 3 דקות ב 4 ° C, להסיר את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde, לתקן במשך 30 דקות ב 4 ° C, ולהשאה מחדש ב 300 μL של חיץ FACS.</li>
	<li>בצע ציטומטריית זרימה.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-loaded+monocyte+administration+induces+potent+therapeutic+antitumor+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).</li>
<li>Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+loading+of+CTL+epitopes+onto+MHC+class+I+complexes+on+dendritic+cell+surface+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo.</a> Biomaterials. 182, 92-103 (2018).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Jiang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+liposome+as+a+dendritic+cell-targeted+mucosal+vaccine+for+inducing+protective+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity.</a> Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+immunotherapies+to+improve+anticancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 566401(2020).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Son, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bulk-culture+method+for+generating+mature+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells.</a> Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+protein+vaccine+based+on+Ag85B+and+STEAP1+induces+a+protective+immune+response+against+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer.</a> Vaccines. 9 (7), 786(2021).</li>
<li>Olweus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+ontogeny%3A+A+human+dendritic+cell+lineage+of+myeloid+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+lymphoid+versus+myeloid+dendritic+cell+lineages+revisited%3A+both+CD8alpha%28-%29+and+CD8alpha%28%2B%29+dendritic+cells+are+generated+from+CD4%28low%29+lymphoid-committed+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors.</a> Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+evolutionary+conservation+of+dendritic+cell+subset+identity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 260(2015).</li>
<li>Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%3A+in+vitro+differentiation+using+low+doses+of+recombinant+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).</li>
<li>Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+immunization+by+in+vivo+transfection+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells.</a> Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).</li>
<li>Brunner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-prandial+administration+of+the+insulin+analogue+insulin+aspart+in+patients+with+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus.</a> Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).</li>
<li>Koido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+antitumor+immunity+by+vaccination+of+dendritic+cells+transfected+with+MUC1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA.</a> Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).</li>
<li>Jonasson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+of+the+porcine+proximal+femoral+epiphyseal+plate%3A+The+effect+of+different+loading+directions+and+the+role+of+the+perichondrial+fibrocartilaginous+complex+and+epiphyseal+tubercle+-+An+experimental+biomechanical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4(2014).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Hinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+dendritic+cells+generated+from+nonfractionated+bulk+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures+induce+growth+of+cytotoxic+T+cells+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).</li>
</ol>

כל הכותבים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים ושאין להם מה לחשוף.

לבני אדם ולעכברים יש תת-קבוצות DC שונות, כולל DCs קלאסיים (cDCs, כולל cDC1s ו-cDC2s), DCs (pDCs) פלזמציטואידים (pDCs) ו-DCs שמקורם במונוציטים (MoDCs) 9,10,11. מקובל לחשוב ש-cDC1s מווסתים תגובות לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T (CTL) לפתוגנים תוך-תאיים ולסרטן, ו-cDC2s מווסתים את התגובה החיסונית לפתוגנים חוץ-תאיים, טפילים ואלרגנים12. ניתן לייצר מספר משמעותי של DCs במבחנה מתאי אב BM בעכברים בנוכחות GM-...

תאים דנדריטיים (DCs) הם התאים החזקים ביותר המציגים אנטיגן (APCs) להפעלת תאי T נאיביים ולגרימת תגובות ספציפיות של לימפוציטים ציטוטוקסיים T (CTL) נגד מחלות זיהומיות, מחלות אלרגיה ותאי גידול 1,2,3. DCs הם החוליה העיקרית בין חסינות מולדת לחסינות מסתגלת וממלאים תפקיד חיוני בהגנה החיסונית ובשמירה על סבילות חיסונית. ב-40 השנים האחרונות, חוקרים רבים ביקשו להגדיר את תת-הקבוצות של DCs ואת תפקידיהן בדלקת ובחסינות. על פי מחקרים אלה, DCs מתפתחים לאורך השושלות המיאלואידיות והלימפואידיות מתאי מח העצם. חיסוני הגידולים זכו לאבני דרך משמעותיות בשנים האחרונות ויש להם עתיד מבטיח. מבחינה מכנית, חיסונים נגד גידולים מווסתים את התגובה החיסונית ומונעים את צמיחת הגידול על ידי הפעלת לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T באמצעות אנטיגנים סרטניים. החיסון המבוסס על DCs ממלא תפקיד חשוב באימונותרפיה של הגידול וזוהה כאחד הטיפולים המבטיחים ביותר נגד גידולים 1,4. בנוסף, נעשה שימוש נרחב ב-DCs בבדיקות של תרופות חדשות ממוקדות מולקולרית ומעכבי מחסום חיסוני5.
חוקרים זקוקים בדחיפות למספר גבוה של DCs בעלי טוהר גבוה כדי להמשיך ולחקור את תפקידם של DCs. עם זאת, DCs הם נדירים ברקמות שונות ובדם, ומהווים רק 1% מתאי הדם בבני אדם ובבעלי חיים. תרבית במבחנה של תאים דנדריטיים של מח עצם (BMDC) היא שיטה חשובה להשגת כמויות גדולות של תאי DC. בינתיים, פרוטוקול לוץ להפקת DCs ממח עצם נמצא בשימוש נרחב על ידי חוקרים6. למרות שהפרוטוקול יעיל בהשגת תאי DC, הוא מורכב ויקר, וכולל תוספת של ריכוזים גבוהים של ציטוקינים ואת התזה של תאי הדם האדומים.
במחקר זה אנו מדווחים על שיטה לבידוד כמעט כל תאי מח העצם ממח העצם ממח העצם של העכבר (BM) ולגרימת התמיינות ל-BMDC לאחר 7-9 ימים של דגירה במבחנה, עם ריכוז נמוך יותר של GM-CSF ו-IL-4. הליך זה לוקח רק 10 דקות כדי לקצור כמעט את כל תאי מח העצם ולהשעות אותם במדיום שלם. בקצרה, אנו מספקים שיטת תרבות יעילה וחסכונית עבור BMDC במחקר זה.

<table><tbody><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>APC-MHC II</td><td>Biolegend</td><td>116417</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD80</td><td>Biolegend</td><td>104707</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>Percp/cy5.5-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117327</td><td></td></tr><tr><td>PRMI-1640</td><td></td> עכבר <td>תרמו</td> 11875093 <td></td></tr><tr><td>רקומביננטי GM-CSF</td><td>Solarbio</td><td>P00184</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי IL-4</td><td>Solarbio</td><td>P00196</td><td></td></tr><tr><td>TruStain Fc PLUS (נגד עכבר CD16/32) נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>156603</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

הביקוש לתאים דנדריטיים (DCs) עולה בהדרגה ככל שהמחקר האימונולוגי מתקדם. עם זאת, DCs הם נדירים בכל הרקמות. השיטה המסורתית לבידוד DCs כוללת בעיקר גרימת התמיינות מח עצם (BM) לתוך DCs על ידי הזרקת מינונים גדולים (>10 ננוגרם/מ"ל) של גורם מגרה מושבה גרנולוציטים-מקרופאגים/אינטרלוקין-4 (GM-CSF/IL-4), מה שהופך את ההליך למורכב ויקר. בפרוטוקול זה, באמצעות כל תאי ה-BM בתרבית במדיום GM-CSF/IL-4 של 10 ng/mL, לאחר חילופי חצי-תרבית של 3-4, נקטפו עד 2.7 x 107 תאי CD11c+ (DCs) לכל עכבר (שני עצם הירך) בטוהר של 80%-95%. לאחר 10 ימים בתרבית, הביטוי של CD11c, CD80 ו- MHC II גדל, בעוד שמספר התאים ירד. מספר התאים הגיע לשיאו לאחר 7 ימים של תרבית. יתר על כן, שיטה זו לקחה רק 10 דקות כדי לקצור את כל תאי מח העצם, ומספר גבוה של DCs הושגו לאחר שבוע אחד של תרבית.

התאים בגודל 1 x 10 7-1.7 x 107 הוצאו משני עצם הירך ונתלו מחדש ב-24 מ"ל של תווך לפני שנשתלו בצלחת של 6 בארות (איור 1A). לאחר יומיים, תאים שאינם דבקים הוסרו על ידי שינוי מוחלט של מדיום התרבית. לפני שינוי המדיום נצפו מספר משמעותי של תאים מרחפים (איור 1B). לאחר 3 ימים של תרבית, מושבות תאים קטנות החלו להיווצר. ביום השישי גדלו באופן משמעותי גודל המושבות ומספרן. ביום השביעי, מספר התאים הגיע לשיא (22 x 106-27 x 106) ואז ירד בה...

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית ויעילה לבודד וליצור תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם בטוהר גבוה מעכברים לאחר 7 ימים של תרבית עם 10 ננוגרם/מ"ל GM-CSF/IL-4.

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

פרוטוקול חסכוני ויעיל של בידוד ויצירת תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכבר. נהלים המערבים נבדקים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה של בעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג.One.Introduction. עם העלייה במחקר חסינות הגידול, הביקוש לתאי DC עולה בהדרגה.עם זאת, DCs הם נדירים בכל הרקמות. השיטה המסורתית של בעיקר גרימת ההבחנה של מח העצם לתוך DCs היא מסובכת ויקרה. שניים. בידוד מח העצם והכנת תאי BM אנו מקריבים עכברים ומתקבעים על שולחן הניתוחים של העכבר.חתכו את עורם של השרירים החשופים השמאליים ואת עורק הירך. אין לחתוך את עורק הירך ישירות. אחרת, זה יגרום לדימום כבד ויזהם את שדה הראייה.חותכים את כל השרירים סביב עצם הירך. למתוח לאט את הגפיים התחתונות של העכבר כלפי חוץ עד צניחת ראש הירך וניתן לראות אותו. להפריד את הגפיים התחתונות מהגוף.חותכים את הרגל האחורית כדי להשיג עצם ירך חופשית ושלמה. הסר את השרירים באמצעות גזה. אין לקרוע את השרירים ישירות.עצם הירך של העכברים שברירית. מניחים את עצם הירך ב-75% אלכוהול למשך שתיים עד חמש דקות. שלוש. תרבית הזרקה של BMDC לשטוף את שאריות האלכוהול עם PBS.מהדקים את החלק האמצעי והתחתון של עצם הירך במלקחיים המוסטטיים, ומהדקים את הקצה התחתון של עצם הירך עם מלקחיים המוסטטיים נוספים. המלקחיים ההמוסטטיים מוחלים פשוטו כמשמעו על עצם הירך ועצם הירך נשברת מקו אפיפיזי. השתמש במזרק מ"ל אחד כדי לחדור את חלל מח העצם מקו האפיפיזיאלי.השתמש בינוני שלם שני חלקים לשטוף את חלל מח העצם עד העצם הופך לבן. לאסוף נוזלי שטיפה. תוספת למדיום השלם המכיל GM CSF/IL-4 עד 24 מ"ל, וזרעים בצלחת של 6 בארות עם 4 מ"ל לבאר. ארבע.תוצאות.לאחר יומיים, החלף את כל המדיום המכיל GM-CSF/IL-4. מחציתם החליפו את המדיום השלם המכיל GM-CSF/IL-4, ביום הרביעי והשישי והשמיני. מספר התאים הגיע לשיא ביום השביעי ואז ירד בהדרגה.תאי DC יצרו מספר רב של סינפסות המציגות מורפולוגיה טיפוסית של תאי DC בוגרים. ניתוחי תת-מדד זרימה מראים כי היחס של CD11c הטיל מה 71% ביום השישי, יחס רחב עלה ל -96.1% ביום העשירי. הביטוי של CD11c, CD80 ו- MSC2, גדל בהדרגה עם הגדלת זמן הטיפוח. חמש.מסקנה.בקיצור, יצרנו פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד ולייצור של תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם מעכברים, שלוקח לו רק 10 דקות להפריד בין תאי מח עצם. מספר גבוה של DCs בטוהר גבוה נקטף לאחר שישה עד שבעה ימים של תרבית עם 10ng לכל מ"ל, GM-CSF ו- IL-4.

economical-efficient-protocol-for-isolating-culturing-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

וידאו זה מדגים את נוהל המבדילים תאים דנדריטים מיאלואידית ממח העצם העכבר. בידוד של השוקה העכבר הירך, ועיבוד של מח העצם הם הפגינו. תמונות הוכחת מורפולוגיה תא לפני ואחרי בידול, דמויות המתארות פנוטיפ התא IL-12 בייצור התבגרות הבאות באמצעות CPG מוצגים.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

סרטון זה מתאר פרוטוקול ליצירת תאים דנדריטיים - תאים מציגי אנטיגן מרכזיים המפעילים תאי T - ממח העצם של עכבר בוגר.

יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם: שיטה ליצירת תאים דנדריטיים ממח עצם עכבר

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד וטיהור של נויטרופילים ממח עצם בעכבר על ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות ותיוג באמצעות צבעי CellTracker נויטרופילים. זה מייצג שיטה פשוטה, מהירה, לשחזור וחסכוני להשגת מספר גדול של נויטרופילים למחקרים תפקודיים במורד הזרם או ניסויי העברה ומעקב מאמצים.

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

כאן אנו מציגים פרוטוקול המייצר כמויות גדולות של מונוציטים עכבריים ממח עצם הטרוגני ליישומים תרגומיים. בהשוואה לאחרות, שיטה חדשה זו מסייעת להפחית את מספר בעלי החיים המוקרבים ומורידה עלויות על ידי הימנעות משיטות יקרות כגון הפרדת תאים מגנטיים בשיפוע גבוה (MACS).

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

נגזר מונוציט DC (MoDC) יכול לחוש כמויות זעירות של מולקולות הקשורות סכנה, ולכן טענתי בקלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של MoDC של דם וגידולים שלהם הפעלה עם מכלולים חיסוניים תוך הדגשת מפתח הזהירות הנחשבות על-מנת למנוע הפעלה מוקדמת שלהם.

בידוד פרוטוקול של העכבר נגזר מונוציט תאים דנדריטים והפעלה שלהם עוקבות במבחנה עם מכלולים חיסוניים הגידול

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח, איפיון תאים דנדריטים tolerogenic (TolDCs), להעריך את השירות immunotherapeutic שלהם.

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים.

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

כאן, אנו מתארים תנאי תרבית חוץ גופית , בידוד וייצור מוגבר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Echinococcus granulosus. הרכבים החשמליים הקטנים התאפיינו בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הספיגה על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם והאפנון הפנוטיפי שלהם נחקרו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

אנו מציגים תפוקה גבוהה פרוטוקול אופטימיזציה שלנו nucleofection כדרך יעילה של transfecting העיקרי האדם מונוציטים הנגזרות תאים דנדריטים עם ה-DNA או פלסמיד siRNA או ללא גרימת התבגרות התא. בנוסף, אנו מספקים ראיות השתקת siRNA מוצלח של הגן ממוקד חבל, אני ב-mRNA והן רמות החלבון.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

למד פרוטוקול חסכוני לבידוד וגידול תאים דנדריטיים ממח העצם של עכברים באמצעות GM-CSF/IL-4. השיטה מייצרת תאים בטוהר גבוה לחקר חסינות נגד גידולים.

פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים

גלה סרטונים נוספים