פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים
1 ביולי 2022
כאן אנו מציגים שיטה חסכונית ויעילה לבודד וליצור תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם בטוהר גבוה מעכברים לאחר 7 ימים של תרבית עם 10 ננוגרם/מ"ל GM-CSF/IL-4.
פרוטוקול חסכוני ויעיל של בידוד ויצירת תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכבר. נהלים המערבים נבדקים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה של בעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג.One.Introduction. עם העלייה במחקר חסינות הגידול, הביקוש לתאי DC עולה בהדרגה.
עם זאת, DCs הם נדירים בכל הרקמות. השיטה המסורתית של בעיקר גרימת ההבחנה של מח העצם לתוך DCs היא מסובכת ויקרה. שניים. בידוד מח העצם והכנת תאי BM אנו מקריבים עכברים ומתקבעים על שולחן הניתוחים של העכבר.
חתכו את עורם של השרירים החשופים השמאליים ואת עורק הירך. אין לחתוך את עורק הירך ישירות. אחרת, זה יגרום לדימום כבד ויזהם את שדה הראייה.
חותכים את כל השרירים סביב עצם הירך. למתוח לאט את הגפיים התחתונות של העכבר כלפי חוץ עד צניחת ראש הירך וניתן לראות אותו. להפריד את הגפיים התחתונות מהגוף.
חותכים את הרגל האחורית כדי להשיג עצם ירך חופשית ושלמה. הסר את השרירים באמצעות גזה. אין לקרוע את השרירים ישירות.
עצם הירך של העכברים שברירית. מניחים את עצם הירך ב-75% אלכוהול למשך שתיים עד חמש דקות. שלוש. תרבית הזרקה של BMDC לשטוף את שאריות האלכוהול עם PBS.
מהדקים את החלק האמצעי והתחתון של עצם הירך במלקחיים המוסטטיים, ומהדקים את הקצה התחתון של עצם הירך עם מלקחיים המוסטטיים נוספים. המלקחיים ההמוסטטיים מוחלים פשוטו כמשמעו על עצם הירך ועצם הירך נשברת מקו אפיפיזי. השתמש במזרק מ"ל אחד כדי לחדור את חלל מח העצם מקו האפיפיזיאלי.
השתמש בינוני שלם שני חלקים לשטוף את חלל מח העצם עד העצם הופך לבן. לאסוף נוזלי שטיפה. תוספת למדיום השלם המכיל GM CSF/IL-4 עד 24 מ"ל, וזרעים בצלחת של 6 בארות עם 4 מ"ל לבאר. ארבע.תוצאות.
לאחר יומיים, החלף את כל המדיום המכיל GM-CSF/IL-4. מחציתם החליפו את המדיום השלם המכיל GM-CSF/IL-4, ביום הרביעי והשישי והשמיני. מספר התאים הגיע לשיא ביום השביעי ואז ירד בהדרגה.
תאי DC יצרו מספר רב של סינפסות המציגות מורפולוגיה טיפוסית של תאי DC בוגרים. ניתוחי תת-מדד זרימה מראים כי היחס של CD11c הטיל מה 71% ביום השישי, יחס רחב עלה ל -96.1% ביום העשירי. הביטוי של CD11c, CD80 ו- MSC2, גדל בהדרגה עם הגדלת זמן הטיפוח. חמש.מסקנה.
בקיצור, יצרנו פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד ולייצור של תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם מעכברים, שלוקח לו רק 10 דקות להפריד בין תאי מח עצם. מספר גבוה של DCs בטוהר גבוה נקטף לאחר שישה עד שבעה ימים של תרבית עם 10ng לכל מ"ל, GM-CSF ו- IL-4.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה כלכלית ויעילה לבידוד ויצירה של תאים דנדריטיים בטוהר גבוה המופקים ממוח עצם של עכברים. הפרוטוקול כולל תרבית של 7 ימים עם GM-CSF/IL-4.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- תאים דנדריטיים (DCs) הם קריטיים למחקר על חסינות נגד גידולים.
- תאים דנדריטיים נדירים ברקמות, דבר ההופך את בידודם למאתגר.
- שיטות מסורתיות להבחנה של תאים דנדריטיים הן מורכבות ויקרות.
- מחקר זה נועד לפשט את התהליך של יצירת תאים דנדריטיים ממח עצם.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה חסכונית לבידוד תאי DC.
- שיפור היעילות של ייצור תאי DC ממוח עצם של עכבר.
- תמיכה במחקר בתחום החסינות נגד גידולים על ידי אספקת תאי DC בדרגת טוהר גבוהה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד מחית עצם מעכברים.
- תרבית של תאי מחית עצם עם GM-CSF/IL-4.
- הערכת טוהר התאים וחיוניותם.
- אישור מוועדה מוסדית לאתיקה בבעלי חיים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי DC גבוהי טוהר המו полу-גוזרים ממח עצם.
- הוכחת היעילות של הפרוטוקול החדש.
- פוטנציאל ליישום רחב יותר במחקרי חסינות גידולים.
- הפחתה בזמן ובעלות בהשוואה לשיטות מסורתיות.
מסקנות
- השיטה שפותחה מהווה חלופה ישימה להפקת DC.
- גישה זו עשויה להקל על מחקרים נוספים בתחום האימונולוגיה.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון יישומים בהקשרים טיפוליים מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
פרוטוקול זה נותן מענה למחסור באספקת תאי דנדריטיים למחקרי אימונולוגיה וחסינות גידולים, על ידי מתן שיטה כלכלית בעלת תפוקה גבוהה לבידוד תאים דנדריטיים ממקור של מחלקה גרמית מעכברים. הוא מאפשר ייצור בר-הרחבה של DC בעלי מאפיינים פנוטיפיים מאופיינים עם צריכה מופחתת של ריאגנטים וזמן עבודה מעשי, ובכך תומך בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים ובמחקרים מכניסטיים במסלולי פיתוח של אימונותרפיה. הגישה משפרת את מידת הביטחון החזויה במודלים פרה-קליניים על ידי אספקת מערכת הדירה ורלוונטית למחלה להערכת מודולציה חיסונית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקוד תאי דנדריטיים במסלולי הצגת אנטיגן והפעלת תאי T.
- ערך תפעולי: מפחית את העלות והמורכבות של ייצור תאים דנדריטיים באמצעות דיפרנציאציה סטנדרטית של GM-CSF/IL-4.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות אפיון פנוטיפי של ביטוי CD11c, CD80 ו-MHC II לאורך זמן.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר אוכלוסיות של תאי דנדריטיים בטוהר גבוה (80%-95% CD11c+) המתאימות לבדיקות חיסוניות סטנדרטיות.
- ערך תפעולי: מניב עד 2.7 x 107 תאים לעכבר, מה שמאפשר פורמטים של סריקה בהסבב גבוה.
- ערך מדעי: מספק מערכת ביולוגית עקבית להערכת השפעות של תרכובות על הבשלת תאים דנדריטיים ועל התפקוד החיסוני.
מחקר תרגומי וטרום-קלני
- ערך מדעי: מייצר מערכת רלוונטית למחלה לצורך מידול תגובות של תאי דנדריטיים בהקשרי חסינות גידולית.
- ערך תפעולי: תומך בהערכה פרה-קלינית של חומרים אימונו-מודולטוריים עם קלטים תאיים מוגדרים.
- ערך מדעי: מקל על הפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור הפנוטיפ של התא הדנדריטי לתוצאות תפקודיות במערכות של תרבית משותפת.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, ומספקת מקור מתחדש של תאים דנדריטיים עבור בדיקות הממוקדות במערכת החיסון.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על מסלולים חיסוניים התלויים בתאים דנדריטיים ובמעורבות של מטרה.
- סריקה: מספק תוצאות תאיות כמותיות הניתנות לשחזור להערכת פעילות של ויסות חיסוני.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה מבוססת ציטומטריית זרימה של CD11c, CD80 ו-MHC II כמדדי הבשלה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין יצירת תאים דנדריטיים in vitro למודלים פרה-קליניים של אקטיבציה וסבילות חיסונית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פרוטוקול סטנדרטי וניתן להרחבה להפקה של תאים דנדריטיים בפרויקטים של אימונולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה באמצעות קלטים של תאי דנדריטיים המוגדרים פנוטיפית.
- ערך תפעולי: מפחית זמן ועלויות באמצעות איסוף מחלק ה골שג ב-10 דקות ומינון נמוך של ציטוקינים (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי אספקת מודלים אמינים של תאים דנדריטיים לסריקת אימונותרפיה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות של מועמדים לאימונומודולציה מותאם סיכונים באמצעות תאי אפקטור חיסוניים סטנדרטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד מחולש עצם של עכברים ובטכניקות של תרבית תאים סטרילית.
- תלוי בגישה ללוחות 6 בארות, פינצטות המוליטיות וציטומטריית זרימה לאישוש פנוטיפי.
- מחייב סטנדרטיזציה של ריכוז הציטוקינים ולוח הזמנים להחלפת המדיום בין המשתמשים.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר לזני עכברים או לרקעים גנטיים אחרים.
- מוגבל לחלון תרבית של 7–10 ימים ולירידה הנלווית בחיוניות התאים לאחר שיא הפעילות.
