שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

בדיקת שטף מטבולי של תאים בזמן אמת מודדת את קצב צריכת החמצן ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית, המתאים לייצור אדנוזין טריפוספט מיטוכונדריאלי וגליקוליטי, באמצעות חיישני pH וחמצן. כתב היד מסביר שיטה להבנת מצב האנרגיה של אוסטאובלסטים ואפיון ופרשנות של המצב הביו-אנרגטי התאי.

שיטה זו שימושית בקביעת אנרגיות תאיות, כמו קצב ייצור ATP, וגם כדי לקבוע את ההעדפה התאית כלפי מטבוליט מסוים על בסיס זמן אמת. כדי להתחיל, להוסיף 200 microliters של קליברנט XF ולדגום את צלחת השירות לפחות שעה אחת לפני הבדיקה. הכן 80 מיליליטרים של מדיית בדיקת XF באמצעות תוספת XF DMEM.

הפשרת אוליגומיצין A, רוטנון ואנטימיצין A על קרח. פיפט את התרכובות למעלה ולמטה כדי לבודד אותן לפני השימוש. הוסיפו שלושה מיליליטרים של מדיום בדיקה מוכן לכל צינור, המסומנים A ו-B.הוסיפו 26.4 מיקרוליטרים של 2.5 מילימולר אוליגומיצין A לתוך צינור A ו-3.1 מיקרוליטרים של רוטנון 12.67 מילימולאר, 4.1 מיקרוליטרים של 9.4 אנטימיצין מילימולרי A, ו-30 כתם של הוק מיקרוליטר לתוך שפופרת B.טענו ריכוז של פי 10 של מעכבים אלה ביציאת ההזרקה המתאימה.

ולבסוף, 20 מיקרוליטרים של תרכובות אלה יועמסו לתוך התאים ב -200 מיקרוליטרים של מדיה בדיקה. הסר את המיקרו-פלטה של תרבית התאים מחממת 37 מעלות צלזיוס והתבונן בתאים שמתחת למיקרוסקופ. מוציאים את מדיום הבדיקה מאמבט המים.

שטפו בעדינות את התאים עם 200 מיקרוליטרים של מדיום בדיקה שחומם מראש פעמיים, והוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיית בדיקה לכל באר. בדקו את התאים שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נשארים דבוקים לבארות. יש לוודא שהתאים בבארות D5 ו-E8 נדבקים לחד-שכבתי עקבי ולא נשטפו במהלך שלב הכביסה.

תוכנת הדמיית תאים משתמשת בשתי בארות אלה להגדרת המיקוד האוטומטי והחשיפה האוטומטית. פתח את תוכנת שולחן העבודה במחשב שליד הציוד. בדוק את מצב החיבור בפינה השמאלית התחתונה של תוכנת הבקר.

עבור אל תבניות ובחר את תבנית בדיקת קצב ה- ATP של XF או את תבנית הבדיקה המתאימה. בחר הגדרות קבוצה בחלק העליון של המסך והגדר את הקבוצות. בחר את פריסת מפת הלוח והקצה את הבארות בהתאם לקבוצות שהוגדרו.

אמת את פרוטוקול המכשיר. ודא שהתרכובות שנוספו מפורטות כהלכה וכולל את פרטי הפרוייקט עבור הפניות עתידיות. לחץ על הפעל Assay.

פעולה זו תבקש את הבחירה של מיקום אחסון הקבצים של התוצאה. בחר את המיקום כדי לשמור את קובץ התוצאה. שמור את הקובץ עם תאריך הבדיקה ולחץ על התחל הפעלה.

הנח את מחסנית החיישן ואת לוחית השירות על המגש ולחץ על אני מוכן להתחיל את הכיול. פתח את תוכנת ההדמיה של התאים במחשב. ודא שהתמונה של המיקרו-פלטה מופעלת והיציאות מחוברות למחשב.

בדוק את שורת המצב בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי לוודא שהטמפרטורה מוגדרת ל- 37 מעלות צלזיוס ושמצב החיבור צריך להיות מודגש בירוק כמוכן. סרוק את ברקוד הצלחת כדי להתחיל בתהליך ההדמיה. ספק שם ללוחית התא ולחץ על שמור.

תמונות ברייטפילד ופלורסנט יישמרו כאן. לחץ על בצע סריקת Brightfield, ובמסך הבא, תפריט צלחת וסריקה הצג את האפשרויות להדמיה. לפני הבדיקה, בחר התחל סריקת ברייטפילד.

הניחו את המיקרו-פלטה של תרבית התא ואת כיסוי הצלחת על מחזיק המגש והתיישרו היטב A1 עם הסימן A1. לחץ על סגור מגש. רכישת תמונה של ברייטפילד מופיעה במסך הבא עם מפת לוח.

לחץ על סרוק את כל הבארות וסרוק במשך 30 עד 35 דקות. עם השלמת הכיול, התוכנה מציגה את תיבת הדו-שיח Load Cell Plate. לאחר מכן, לחץ על פתח מגש כדי להחליף את מגש השירות במיקרו-פלטה של תרבית תאים.

שים לב שצלחת תרבית התאים נמצאת בתמונה של מיקרו-פלטה. לאחר הסריקה, הסר את המיקרו-פלטה של תרבית התא והנח אותה במנתח כדי לבצע את הבדיקה. לאחר מכן, לחץ על טען צלחת תא כדי ליזום את הבדיקה.

המתן עד לתחילת הבדיקה והצג את זמן הסיום המשוער. עם השלמת הבדיקה, התוכנה מציגה את מחסנית חיישן הפריקה ואת תיבת הדו-שיח של לוח התא. לחץ על פלטה והסר את המיקרו-פלטה של תרבית התאים מהמנתח.

הסר בזהירות את מחסנית החיישן והחלף את מכסה לוחית התא. מופיעה תיבת הדו-שיח 'בדיקה מלאה'. לאחר מכן, לחץ על הצג תוצאות כדי לפתוח את קובץ תוצאת הבדיקה או כדי לנרמל את הנתונים.

לאחר השלמת הבדיקה, סרוק את ברקוד הצלחת עם קורא הברקוד הידני. אם הצלחת כבר צולמה, היא לא תדרוש שם חדש. בחר פלואורסצנציה וספירת תאים.

הניחו את צלחת התא על מחזיק המגש ולחצו על 'סגור מגש'. בחלון רכישת התמונה, בחר סרוק את כל הבארות כדי להתחיל בהדמיה. סקור את התמונות הפלואורסצנטיות ואת ספירת התאים ביישום ההדמיה וההדמיה של התאים על ידי לחיצה אקראית על כמה מהבארות.

לאחר השלמת ההדמיה הפלואורסצנטית, ייצא את התמונות להפניות נוספות. לאחר השלמת ההדמיה וספירת התאים, פתח את קובץ התוצאות ולחץ על Normalize. לחץ על ייבוא ובחר הגש בקשה לתוכנת שולחן העבודה כדי לנרמל את הבדיקה באמצעות ספירת תאים באופן אוטומטי.

זריקת תערובת הלחץ של אוליגומיצין A ו-FCCP הגבירה את הפעילות הבסיסית של קבוצת הביקורת. גורמי הלחץ הראו רמת אנרגיה גבוהה משמעותית בקבוצת הבקרה והטיפול בקבוצה אחת. מצד שני, לטיפול השני הייתה פעילות בסיסית נמוכה יחסית, והתאים נעשו אירוביים יותר.

האיור מצביע על כך שגם תאי בקרה וגם תאי ניסוי משתמשים בגליקוליזה ובזרחון חמצוני מיטוכונדריאלי לייצור ATP. קבוצת הניסוי מציגה ירידה בייצור ATP באמצעות גליקוליזה ועלייה בנשימה המיטוכונדרית. שיעור הנשימה הבסיסי בקבוצת הטיפול נמוך יחסית לקבוצת הביקורת.

קצבי הנשימה וייצור ה-ATP בשתי הקבוצות יורדים, יחד עם דליפת הפרוטונים ואחריה זריקת אוליגומיצין A. שיעורי הנשימה של התאים עולים שוב לנשימה המקסימלית שלהם לאחר הזרקת FCCP. ההזרקה הסופית של רוטנון ואנטימיצין A מקטינה שוב את ה-OCR.

לאחר הזריקה השלישית, הנשימה המיטוכונדרית נסגרת על ידי שילוב של רוטנון ואנטימיצין A.בהשוואה לקבוצת הביקורת, הנשימה הבסיסית והמקסימלית של קבוצות הטיפול כמעט ואינה משתנה. האיור מראה שקבוצת הביקורת תלויה מאוד במסלול הגלוקוז, בעוד שחמצון גלוטמין היה יעיל בקבוצת הביקורת. מסלול חומצות השומן מראה כי הטיפול הגדיל את הקיבולת הכוללת של התאים.

הזמינות של יציאות הזרקה מרובות על צלחת החומצה מסייעת לנו לקבוע את ההשפעה של תרופות מרובות על אנרגיות תאיות בנקודת זמן אחת.