Name: לבודד רנא ספציפיים לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: למד לבודד רנ"א ספציפי לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים באמצעות דגם NuTRAP ושיטת GLP pull down. שיטה זו מאפשרת חקר ביטוי גנים בתאי EGFP בביולוגיה מולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי NIH R00HD082686. אנו מודים למלגת מחקר הקיץ של החברה האנדוקרינית ל- H.S.Z. אנו מודים גם לד"ר יואן קאנג על הרבייה והשמירה על מושבת העכברים.

כל הניסויים שבוצעו בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת אובורן.
הערה: הפרוטוקול הבא משתמש באשכים אחד (כ-100 מ"ג) ב-P28 מ-Gli1-CreERT2; עכברי NuTRAP (Mus musculus). ייתכן שיהיה צורך להתאים נפחים של ריאגנטים על סמך סוגי הדגימות ומספר הרקמות.
1. איסוף רקמות
<ol><li>להרדים את העכברים באמצעות תא CO2 , לחטא את משטח הבטן עם 70% אתנול.</li>
	<li>פתח את הבטן התחתונה עם מספריים ולהסיר את האשכים. השתמש בחנקן נוזלי (LN2) כדי להקפיא את האשכים באופן מיידי.</li>
	<li>יש לאחסן דגימות בשלב האדים של LN2 עד לשימוש.</li>
</ol>2. הכנת ריאגנטים וחרוזים
<ol><li>הכן את תמיסת מלאי ההומוגניזציה: הוסף 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40, ו 1 מ"ג / מ"ל הפרין. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש (עד חודש).</li>
	<li>הכן את מאגר העבודה של ההומוגניזציה מתמיסת המלאי (שלב 2.1) לפני השימוש: הוסף DTT (ריכוז סופי: 1 מ"מ), ציקלוהקסימיד (ריכוז סופי: 100 מיקרוגרם/מ"ל), ריבונוקלאז רקומביננטי (ריכוז סופי: 200 יחידות/מ"ל), וקוקטייל מעכבי פרוטאז (ריכוז סופי: 1x) לתמיסת מלאי ההומוגניזציה כדי להפוך את הכמות הנדרשת של מאגר העבודה של ההומוגניזציה. אחסנו את חיץ העבודה הטרי על הקרח עד לשימוש.</li>
	<li>הכינו את מאגרי המלח הנמוכים ואת מאגרי הכביסה עתירי המלח:<ol><li>להכנת תערובת חיץ עם מלח נמוך 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl ו-1% NP-40. יש להוסיף DTT (ריכוז סופי: 1 מ"מ) וציקלוהקסימיד (ריכוז סופי: 100 מיקרוגרם/מ"ל) לפני השימוש.</li>
		<li>להכנת תערובת חיץ עשירה במלח 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. יש להוסיף DTT (ריכוז סופי: 2 mM) וציקלוהקסימיד (ריכוז סופי: 100 מיקרוגרם/מ"ל) לפני השימוש.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו חרוזי חלבון G (טבלת חומרים):<ol><li>כל דגימה תצטרך 50 μL של חרוזי חלבון G. מניחים את כמות החרוזים הנדרשת בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ומפרידים את החרוזים מהתמיסה באמצעות מתלה מגנטי על ידי השארת הצינור על המדף למשך 30-60 שניות.</li>
		<li>הסר את הסופרנטנט על ידי פיפטציה. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של חיץ שטיפה קר כקרח דל מלח בכל פעם.</li>
	</ol></li>
</ol>3. תזה של רקמות והומוגניות
<ol><li>הוסף 2 מ"ל של חיץ עבודה הומוגניזציה קר כקרח (מוכן טרי משלב 2.2) לסט מטחנת רקמת זכוכית. הכנס במהירות את הדגימה הקפואה לתוך המטחנה והומוגני את הרקמה עם 30 משיכות על קרח באמצעות מזיק רופף.</li>
	<li>מעבירים את ההומוגנט לצינור בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 2 מ"ל. חסוך 100 μL לצינור 1.5 מ"ל כ"קלט ".</li>
	<li>דגירה של הסופר-נטנט בצינור 2 מ"ל עם הנוגדן נגד GFP (5 מיקרוגרם/מ"ל; 1:400) ב-4 מעלות צלזיוס על גבי סיבוב מקצה לקצה (24 סל"ד) למשך הלילה.</li>
</ol>4. מיצוי חיסוני
<ol><li>העבירו את תערובת ההומוגנט/נוגדנים לצינור חדש בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל המכיל את חרוזי החלבון G השטופים משלב 2.4. דגירה ב-4°C על סיבוב מקצה לקצה (24 סל"ד) למשך שעתיים.</li>
	<li>הפרידו את החרוזים המגנטיים מהסופר-נטנט באמצעות מתלה מגנטים. שמור את הסופרנטנט כ"שבר השלילי ". השבר השלילי מכיל (1) רנ"א בתאים שליליים ל-EGFP ו-(2) רנ"א בתאים חיוביים ל-EGFP שאינם קשורים לריבוזומים.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל של חיץ שטיפה עתיר מלח לחרוזים ומערבבים לזמן קצר את הצינור כדי לשטוף את החרוזים. הניחו את הצינור במדף מגנט.</li>
	<li>מוציאים את מאגר הכביסה. חזרו על שלב הכביסה פעמיים נוספות. החרוזים מכילים כעת את קומפלקס החרוזים-ריבוזום-RNA מתאים חיוביים ל-EGFP.</li>
</ol>5. מיצוי RNA
הערה: השלבים הבאים מותאמים מתוך ערכת בידוד RNA (טבלת חומרים). התייחסו לכל שבר (כלומר, קלט, חיובי ושלילי) כדגימה עצמאית ובודדו רנ"א באופן עצמאי.
<ol><li>דגירה של החרוזים משלב 4.4 עם 50 μL של מאגר מיצוי (מתוך ערכת בידוד ה-RNA) בתרמומיקסר (42 °C, 500 סל"ד) למשך 30 דקות כדי לשחרר רנ"א מחרוזים.</li>
	<li>מפרידים את החרוזים בעזרת מתלה מגנטים, מעבירים את הסופר-נאטנט המכיל את קומפלקס החרוזים-ריבוזום-רנ"א לצינור של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינור ב 3000 x גרם במשך 2 דקות, ולאחר מכן פיפטה את supernatant לצינור חדש 1.5 מ"ל. צינור זה מכיל את "החלק החיובי" של שלב TRAP. הערה: עבור הקלט והשברים השליליים, חלץ RNA מ- 25 μL של דגימות באמצעות 1 מ"ל של מאגר מיצוי. דגירה בתרמומיקסר (42°C, 500 סל"ד) למשך 30 דקות.</li>
	<li>תנאי מראש את עמודת טיהור ה-RNA: פיפטה 250 μL של חיץ התניה על עמודת הטיהור. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). צנטריפוגה של העמודה ב 16,000 x גרם במשך דקה אחת.</li>
	<li>פיפט שווה נפח של 70% EtOH לתוך supernatant משלב 5.3 (סביב 50 μL של 70% EtOH עבור השבר החיובי ו 1 מ"ל של 70% EtOH עבור הקלט ואת השברים השליליים). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.</li>
	<li>צמחו את התערובת לתוך העמודה משלב 5.4.</li>
	<li>צנטריפוגה העמודה ב 100 x g במשך 2 דקות כדי לאפשר RNA קשירה לממברנה בעמודה, ולאחר מכן להמשיך צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 30 שניות מיד. בטל את הזרימה. הערה: עבור הקלט והשברים השליליים, הוסף 250 μL של התערובת לעמודה בכל פעם. חזור על שלבים 5.6 ו- 5.7 עד לשימוש בכל התערובות.</li>
	<li>פיפטה 100 μL של Wash Buffer 1 (W1) לתוך העמודה וצנטריפוגה ב 8,000 x גרם למשך דקה אחת. בטל את הזרימה.</li>
	<li>Pipette 75 μL של תמיסת DNase מתערבבים ישירות לתוך קרום עמודת הטיהור. דגירה ב- RT במשך 15 דקות.</li>
	<li>פיפטה 40 μL של W1 לתוך העמודה וצנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 30 שניות. בטל את הזרימה.</li>
	<li>פיפטה 100 μL של Wash Buffer 2 (W2) לתוך העמודה וצנטריפוגה ב 8,000 x גרם למשך דקה אחת. בטל את הזרימה.</li>
	<li>פיפטה 100 μL של W2 לתוך העמוד וצנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 2 דקות. בטל את הזרימה. סובבו מחדש את אותו עמוד בגודל 16,000 x g למשך דקה אחת כדי להסיר את כל עקבות חיץ הכביסה לפני שלב ההדחה.</li>
	<li>העבר את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>פיפטה 12 μL של מים ללא RNase ישירות על הממברנה של עמוד הטיהור. קצה הפיפט לא צריך לגעת בממברנה. דגירה ב-RT למשך דקה אחת וצנטריפוגה ב-1000 x גרם למשך דקה אחת. לאחר מכן המשיכו את הצנטריפוגה ב-16,000 x g למשך דקה אחת כדי לחדד את הרנ"א.</li>
</ol>6. ריכוז ואיכות RNA
<ol><li>השתמש בביואנליזה כדי להעריך את האיכות והכמות של ה-RNA10 המופק.</li>
</ol>7. אחסון וניתוח נוסף
<ol><li>אחסן את הרנ"א בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (עד שנה אחת) עד לניתוח נוסף (למשל, מיקרו-מערך, PCR כמותי (qPCR), ו-RNA-seq וכו'). הערה: לפרטים על ניתוח qPCR, כולל סינתזת cDNA, עיין ב- Lyu et al.11. פריימרים עבור qPCR מפורטים בטבלת החומרים.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li>
<li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li>
<li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAP-rc%2C+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).</li>
<li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28trap%29+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919(2020).</li>
<li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624(2019).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog%3A+functions+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li>
<li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+number+%28RIN%29-standardization+of+RNA+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies%22%5BJournal%5D)">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).</li>
<li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li>
<li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li>
<li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li>
<li>Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+adult+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li>
<li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase%3A+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li>
<li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li>
<li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481(2009).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+single-cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108(2018).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693(2020).</li>
<li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li>
<li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

התועלת של ניתוח תעתיק רקמה שלמה יכולה להיות מעומעמת, במיוחד כאשר חוקרים רקמות הטרוגניות מורכבות. כיצד להשיג רנ"א ספציפי לסוג התא הופך לצורך דחוף לשחרר את טכניקת ה-RNA-seq רבת העוצמה. הבידוד של רנ"א ספציפיים לסוג התא מסתמך בדרך כלל על איסוף של סוג מסוים של תאים באמצעות מיקרומניפולציה, מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנט (FACS), או מיקרודיסקציה של לכידת לייזר (LCM)18. שיטות ומכשירים מודרניים אחרים לאיסוף תאים בודדים בתפוקה גבוהה פותחו גםהם 19. שיטות אלה משתמשות בדרך כלל בטכנ...

גישות בעלות תפוקה גבוהה, כולל ריצוף RNA (RNA-seq) ומיקרו-מערך, אפשרו לחקור פרופילי ביטוי גנים ברמה הגנומית כולה. עבור רקמות מורכבות כמו הלב, המוח והאשכים, הנתונים הספציפיים לסוג התא יספקו פרטים נוספים המשווים את השימוש ב-RNA מכל הרקמה 1,2,3. כדי להתגבר על ההשפעה של הטרוגניות תאית, שיטת טיהור זיקת הריבוזום המתורגמת (TRAP) פותחה מאז תחילת שנות ה-20104. TRAP מסוגל לבודד רנ"א הקשורים לריבוזום מסוגי תאים ספציפיים ללא דיסוציאציה של רקמות. שיטה זו שימשה לניתוח טרנסלטום (mRNA המגויס לריבוזום לתרגום) באורגניזמים שונים, כולל התמקדות באוכלוסייה נדירה ביותר של תאי שריר בעוברי Drosophila5, חקר תאי שורש שונים בצמח המודל Arabidopsis thaliana6, וביצוע ניתוח תעתיק של תאי אנדותל ביונקים7.
TRAP דורש שינוי גנטי כדי לתייג את הריבוזום של אורגניזם מודל. אוון רוזן ועמיתיו פיתחו לאחרונה מודל עכבר בשם תיוג גרעיני ותרגום של עכברטיהור זיקה ריבוזום (NuTRAP) 8, הזמין דרך מעבדת ג'קסון מאז 2017. על ידי חצייה עם קו עכבר Cre, חוקרים יכולים להשתמש במודל עכבר NuTRAP זה כדי לבודד רנ"א הקשורים לריבוזום וגרעיני תאים מתאים המבטאים Cre ללא מיון תאים. בתאים המבטאים Cre הנושאים גם את אלל NuTRAP, הריבוזום המתויג EGFP/L10a מאפשר בידוד של תרגום mRNA באמצעות מבחני משיכה של זיקה. באותו תא, הממברנה הגרעינית המתויגת כפפטיד זיהוי ביוטין ליגאז (BLRP), שגם היא חיובית ל-mCherry, מאפשרת בידוד גרעיני באמצעות טיהור מבוסס זיקה או פלואורסצנציה. אותו צוות מחקר גם יצר קו עכברים דומה שבו קרום הגרעין מסומן רק עם mCherry ללא ביוטין8. שני קווי עכבר מהונדסים גנטית אלה נותנים גישה לאפיין פרופילים אפיגנומיים ותעתיקיים זוגיים של סוגים ספציפיים של תאים בעלי עניין.
מסלול האיתות של הקיפוד (Hh) ממלא תפקיד קריטי בהתפתחות רקמות9. GLI1, בן למשפחת GLI, פועל כמפעיל תעתוק ומתווך את איתות ה-HH. תאי Gli1+ יכולים להימצא באיברים רבים המפרישים הורמונים, כולל בלוטת יותרת הכליה והאשכים. כדי לבודד דנ"א ו-RNA ספציפיים לסוג התא מתאי Gli1+ באמצעות מודל העכבר NuTRAP, עכברי Gli1-CreERT2 הוצלבו עם עכברי NuTRAP. עכברי Shh-CreERT2 נחצו גם הם כאשר עכברי NuTRAP נועדו לבודד תאים המבטאים קיפוד קולי (Shh). הפרוטוקול הבא מראה כיצד להשתמש ב- Gli1-CreERT2; עכברי NuTRAP לבידוד רנ"א הקשורים לריבוזום מתאי Gli1+ באשכים של עכברים בוגרים.

<table><tbody><tr><td>Actb</td><td>eurofins</td><td>qPCR פריימרים</td><td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (פריימר קדימה/הפוך)</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete מיני מעכב פרוטאז ללא EDTA קוקטייל</td><td>Millipore</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Millipore</td><td>239764-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Cyp11a1</td><td>eurofins</td><td>qPCR פריימרים</td><td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (פריימר קדימה/הפוך)</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DTT, Dithiothreitol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>מגנט DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פלקון 15 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>GFP נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>סט מטחנות זכוכית</td><td>DWK מדעי החיים</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>BEANTOWN CHEMICAL</td><td>139975-250MG</td><td></td></tr><<tr><td>em>Hsd3b</td><td>eurofins</td><td>qPCR פריימרים</td><td>GACAGGAGCAGGAGGGTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (פריימר קדימה/הפוך)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Biosciences</td><td>R005</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosciences</td><td>R004</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>02-707-354</td><td></td></tr><tr><td>עכבר Clariom S מערך מיקרו-מערכים</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td></td><td>שירות מיקרו-מערך</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Millipore</td><td>492018-50 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>אוליגו (dT)20</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure ערכת בידוד RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>חלבון G Dynabead</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>תאי גידול</td><td>מים ללא RNase</td><td>NUPW-0500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT מעכב ריבונוקלאז רקומביננטי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Sox9</td><td>eurofins</td><td>qPCR פריימרים</td><td>TGAAGAACGGACAAGCGGAGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (פריימר קדימה/הפוך</td></tr><tr><td>Superscript IV reverse transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Sycp3</td><td>eurofins</td><td>qPCR פריימרים</td><td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (פריימר קדימה/פריימר הפוך)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62848</td><td></td></tr></tbody></table>

לבודד רנ"א ספציפיים לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

הטרוגניות תאית מציבה אתגרים להבנת תפקודן של רקמות מורכבות ברמת שעתוק. שימוש ב-RNA ספציפי לסוג התא מונע מלכודות פוטנציאליות הנגרמות על ידי ההטרוגניות של רקמות ומשחרר את ניתוח השעתוק העוצמתי. הפרוטוקול המתואר כאן מדגים כיצד להשתמש בשיטת טיהור זיקת ריבוזום (TRAP) לבודד רנ"א הקשורים לריבוזום מכמות קטנה של תאים המבטאים EGFP ברקמה מורכבת ללא מיון תאים. פרוטוקול זה מתאים לבידוד רנ"א ספציפיים לסוג התא באמצעות מודל עכבר NuTRAP הזמין לאחרונה, וניתן להשתמש בו גם לבידוד רנ"א מכל תא המבטא EGFP.

עכבר Gli1-CreERT2 (מספר מלאי של מעבדת ג'קסון: 007913) נחצה לראשונה עם עכבר הכתב NuTRAP (מספר מלאי של מעבדת ג'קסון: 029899) כדי ליצור עכברים בעלי מוטציה כפולה. עכברים שנשאו את שני אללי הגנים המהונדסים גנטית (כלומר, Gli1-CreERT2 ו-NuTRAP) הוזרקו טמוקסיפן פעם ביום, אחת ליומיים, במשך שלוש זריקות. דגימות רקמה נאספוביום השביעי לאחר היוםהראשון של ההזרקה. ניתוח אימונופלואורסצנטי הראה שה-EGFP בא לידי ביטוי בתאים אינטרסטיציאליים באשכים (איו...

פרוטוקול זה נועד לבודד mRNA ריבוזומלי ספציפי לסוג התא באמצעות מודל העכבר NuTRAP.

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

פרוטוקול זה נועד להשיג רנ"א ספציפיים מסוגי תאים באיכות גבוהה ממספר קטן של תאים ברקמה מורכבת ללא מיון תאים. הוא משתמש במודל עכברים זמין לאחרונה המאפשר לחוקרים לבודד רנ"א הקשור לריבוזום באמצעות משיכת GLP כלפי מטה. השיטה מתאימה גם לבידוד רנ"א הקשור לריבוזום מכל תא EGFP המבטא.כדי להתחיל, הוסף שני מיליליטר של הומוגניזציה קרה כקרח חיץ עבודה לסט מטחנת רקמת זכוכית. הכנס במהירות את הדגימה הקפואה לתוך המטחנה והומוגני את הרקמה עם 30 משיכות על קרח באמצעות מזיק רופף. להעביר את homogenate לצינור תחתון עגול שני מיליליטר צנטריפוגה ב 12, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן העבירו את הסופרנאטנט לצינור חדש של שני מיליליטר מבלי להפריע לכדור, תוך שמירת 100 מיקרוליטרים כקלט. לדגום את הסופרנטנט עם הנוגדן נגד GFP בארבע מעלות צלזיוס על קצה מעל הקצה מסובב לילה. מעבירים את תערובת ההומוגנט והנוגדנים לצינור תחתון עגול חדש של שני מיליליטר המכיל חרוזי חלבון שטופים ודגירה של ארבע מעלות צלזיוס על סיבוב ב-24 סל"ד למשך שעתיים.הפרידו את החרוזים המגנטיים מהסופר-נטנט באמצעות מתלה מגנטי. שמור את הסופרנטנט כשבר השלילי המכיל את הרנ"א בתאים שליליים של EGFP ואת הרנ"א בתאים חיוביים של EGFP שאינם קשורים לריבוזומים. מוסיפים מיליליטר אחד של מלח גבוה לשטוף את החרוזים ומערבבים לזמן קצר את הצינור כדי לשטוף את החרוזים.לאחר מכן הניחו את הצינור במדף מגנטי. הסר את חיץ הכביסה וחזור על שלבי הכביסה פעמיים נוספות כדי לקבל את קומפלקס RNA ריבוזום חרוזים מתאים חיוביים EGFP. דגרו את החרוזים עם 50 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי מתוך ערכת בידוד הרנ"א ב-ThermoMixer למשך 30 דקות כדי לשחרר רנ"א מהחרוזים.מפרידים את החרוזים עם מתלה מגנטי ומעבירים את הסופרנטנט לצינור של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 3000 גרם במשך שתי דקות. לאחר מכן פיפטה את supernatant לצינור חדש 1.5 מיליליטר.כדי להתנות מראש את עמודת טיהור ה-RNA, פיפטה 250 מיקרוליטרים של חיץ התניה על עמודת הטיהור ודגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. ואז צנטריפוגה את הטור ב 16, 000 גרם במשך דקה אחת. מכניסים נפח שווה של 70% אתנול לתוך תמצית התא ומערבבים היטב על ידי פיפטה.פיפטה עד 200 מיקרוליטר של התערובת לתוך עמודת טיהור RNA מותנה מראש. כדי להפחית את אובדן הדגימות לא למלא את העמודה יותר מ 80% של קיבולת שלה. חזור על שלב זה מספר פעמים עד שכל הרנ"א נאספים באותה עמודה של כל שבר.צנטריפוגה של העמודה במשך שתי דקות כדי לקשור RNA לממברנה בעמודה. לאחר מכן המשך צנטריפוגה במשך 30 שניות. השליכו את הזרימה דרך פיפטה 100 מיקרוליטר של חיץ כביסה אחד לתוך העמודה.צנטריפוגה במשך דקה אחת, ולאחר מכן להשליך את הזרימה דרך. פיפטה 75 מיקרוליטר של תמיסת DNA מתערבבים ישירות לתוך קרום עמודת הטיהור. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.לאחר מכן, פיפטה 40 מיקרוליטר של לשטוף חיץ אחד לתוך העמודה צנטריפוגה במשך 30 שניות נוספות. השלך את הזרימה דרך. פיפטה 100 מיקרוליטר של חיץ לשטוף שניים לתוך העמוד צנטריפוגה ב 8, 000 גרם במשך דקה אחת.השלך את הזרימה דרך. קנה PET 100 microliters של חיץ לשטוף שני לתוך העמודה צנטריפוגה ב 16, 000 גרם במשך שתי דקות. השלך את הזרימה דרך, וצנטריפוגה מחדש את אותו עמוד ב 16, 000 גרם למשך דקה אחת כדי להסיר את כל עקבות של חיץ לשטוף.העבר את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. פיפטה 12 מיקרוליטר של מים ללא RNase ישירות על הממברנה של עמודת הטיהור המבטיחה כי קצה הפיפטה אינו נוגע בממברנה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת וצנטריפוגה ב 1000 גרם במשך דקה אחת.ואז ב 16, 000 G במשך דקה אחת כדי לרומם את ה- RNA. השתמש בביואנליזה כדי להעריך את האיכות והכמות של הרנ"א המופק. אחסנו את הרנ"א במקפיא של 80 מעלות או שלחו לניתוח נוסף.עכברים הנושאים את שני אללי הגנים המהונדסים גנטית, Gli1-CreERT2 ו-NuTRAP מוזרק לנו טמוקסיפן פעם ביום, אחת ליומיים לשלוש זריקות. ניתוח אימונופלואורסצנטי של רקמות שנאספו מראה כי ה- EGFP התבטא בתאים אינטרסטיציאליים באשכים. EGFP נמצא גם בתאים קפסולריים של יותרת הכליה בעכברי Gli1-CreERT2, NuTRAP.ב- Sonic Hedgehog-CreERT2, עכברי NuTRAP אוכלוסיית התאים החיוביים של EGFP שוכנת בקליפת המוח החיצונית של בלוטת יותרת הכליה מתחת לקפסולה, המאשרת את הביטוי של תאי EGFP המבטאים מראש. לאחר מיצוי הרנ"א הספציפי לסוג התא, נשלח הרנ"א שחולץ לניתוח מיקרו-מערך. התוצאות הראו כי כ -3000 גנים היו מועשרים בחלק החיובי, לעומת גנים בחלק השלילי, ואילו כ -4, 000 גנים היו מועשרים בחלק השלילי.מבין הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי, הגנים הקשורים לתאי Leydig Hsd11b1 ו-Hsd3b6 הועשרו בחלק החיובי. בחלק השלילי הועשרו הגנים הקשורים לתאי סרטולי קיפוד המדבר ו-Gstm6. רק גנים מעטים שהתבטאו באופן דיפרנציאלי זוהו בהשוואת החלק השלילי עם הקלט.RT-PCR כמותי בזמן אמת שימש כדי לאשר את הביטוי של גנים מרכזיים בשברים חיוביים ושליליים. בדומה למה שנמצא בבדיקת המיקרו-אריי, הועשרו במקטע החיובי אנזימים סטרואידים 3-beta הידרוקסי דהידרוגנאז ואנזים ביקוע שרשרת הצד של הכולסטרול. בינתיים, סמן התא סרטולי SRY תיבת שעתוק פקטור תשע ואת סמן תא הנבט סינפטונמלי קומפלקס חלבון שלוש הועשרו בחלק השלילי.כאשר מנסים פרוטוקול זה, חשוב להכין חיץ עבודה של הומוגניזציה טרייה הוסף DTT, ציקלוהקסמיד ריבונוקלאז רקומביננטי, וקוקטייל מעכב פרוטאינאז לתמיסת מלאי ההומוגניזציה רק לפני השימוש. חשוב גם להכין מלח דל מלח טרי ואת מאגרי שטיפת המלח הגבוהים לפני השימוש.

isolate-cell-type-specific-rnas-from-snap-frozen-heterogeneous-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

כאן אנו מציגים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בסיוע לייזר של סוגי תאי צמחים ספציפיים לפרופיל שעתוק. בעוד שהפרוטוקול מתאים למינים וסוגי תאים שונים, ההתמקדות היא בתאים בלתי נגישים מאוד של קו הנבט הנקבי החשובים לרבייה מינית ואפומית בסוג המצליבים Boechera.

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד במהירות את הגרעינים באיכות גבוהה מן הרקמה טרי או קפוא עבור רצפי RNA בנפט מקבילים במורד הזרם. אנו כוללים רקמת חומרי ניקוי-מכניים, היפוטוניק-מכניים הפרעה ותא פירוק אפשרויות, אשר שניהם יכול לשמש עבור בידוד של גרעין האטום.

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

פרוטוקול זה מתאר את המדריך מיון ההליך כדי לבודד את הנוירונים fluorescently שכותרתו יחיד ואחריו במבחנה מבוסס-תמלול mRNA הגברה עבור רצפי RNA תא בודד גבוה-עומק.

רצפי RNA בתא יחיד של נוירונים Fluorescently שכותרתו העכבר באמצעות מיון ידני וכפול במבחנה תמלול עם ספירות מוחלטת רצף (DIVA-Seq)

פרוטוקול לכידת מיקרודיסקציה (LCM) לכידה פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים בתאים של כל רקמה קשה.

לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא

פרסום זה מתאר פרוטוקול לבידוד של גרעינים מאדיפוציטים בוגרים, טיהור על-ידי מיון המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית ורמת תא בודדת מופעלת.

בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד

בידוד גרעיני בודד מסתמך על חדירות הדיסוציאציה וחומרי הניקוי המבוססים על קרום התא, צעדים הזקוקים לאופטימיזציה ונוטים להציג חפצים טכניים. אנו מדגימים כביסה ופרוטוקול ללא אנזים לבידוד מהיר של גרעינים שלמים ישירות מרקמות שלמות, מניב גרעינים מתאים לגרעין בודד RNA-seq (snRNA-Seq) או ATAC-seq.

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים מרקמות כבד מוקפאות בהבזק, בארכיון עבור RNA-seq, ATAC-seq ומולטיומיקה של מפרקים (RNA-seq ו-ATAC-seq).

בידוד גרעינים מרקמת כבד קפואה עבור מולטיומיה חד-תאית

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

המחקר מתאר פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים איכותיים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף RNA של גרעינים בודדים במורד הזרם.

פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים בודדים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף גרעין יחיד

למד לבודד רנ"א ספציפי לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים באמצעות דגם NuTRAP ושיטת GLP pull down. שיטה זו מאפשרת חקר ביטוי גנים בתאי EGFP בביולוגיה מולקולרית.

לבודד רנ"א ספציפיים לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים

גלה סרטונים נוספים