מידול אתר פעיל אנזים באמצעות תוכנה חופשית להדמיה מולקולרית
25 בדצמבר 2021
מיומנות מרכזית בדוגמנות ביומולקולרית היא הצגת וביאור אתרים פעילים בחלבונים. טכניקה זו מודגמת באמצעות ארבע תוכניות פופולריות בחינם להדמיה מקרומולקולרית: iCn3D, Jmol, PyMOL, ו UCSF כימרהX.
הדמיה של מקרומולקולים ביולוגיים היא מיומנות קריטית לסטודנטים ואנשי מקצוע במדעי הביולוגיה. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד לדגמן את האתר הפעיל של האנזים גלוקוקינאז באמצעות ארבע תוכניות זמינות באופן חופשי למידול מולקולרי. מדריך זה מדגיש מספר שלבים של הפרוטוקול עבור כל תוכנית, הכולל בחירת ליגנדים מאוגדים ושימוש בליגנדים להצגת חומצות אמינו ומולקולות מים בתוך חמישה אנגסטרומים.
המידע התומך של כתב יד זה מכיל וידאו ייעודי לכל תוכנית, המפרט את כל שלבי הפרוטוקול בהסבר נוסף. המבנה יהיה מודל PDBID. 3FGU מייצג את הקומפלקס הקטליטי של האנזים גלוקוקינאז.
האתר הפעיל של האנזים מאוגד לשניים מהמצעים שלו, בטא-די-גלוקוז, אשר נתן את המזהה BGC ויון מגנזיום, MG. בנוסף, אנלוגי מצע זה, חומצה זרחנית אמינו זרחן, אסתר אדנילט, ANP קשור לאתר הפעיל glucokinase. זה אנלוגי לא הידרוליזה של אדנוסין טריפוספט, ATP מונע את תגובת זרחן להתרחש, אשר לוכד את המתחם האתר הפעיל לפני קטליזה. הממשק של תוכנית מידול UCSF ChimeraX מכיל תפריטים נפתחים, סרגל כלים, מציג המבנה ופס פקודה.
נתחיל את הפרוטוקול בשלב 1.4, נבחר שאריות בתוך חמישה אנגסטרומים כדי להגדיר אתר פעיל. כדי לבחור את הליגנדים לחץ על הסט שליטה ולחץ על כל אטום או קשר בכל אחד משלושת הליגנדים. הקש על מקש החץ למעלה עד שכל שלושת הליגנדים מסומנים בזוהר ירוק.
הגדר את הבחירה לשימוש עתידי על-ידי לחיצה בתפריט הנפתח, בחר הגדר בורר, הקלד ליגנדים עבור שם הבחירה ולחץ על אישור. שוב, באמצעות תפריט בחירה, בחר אזור. החלף מצב זה לשאריות וודא שהממיר העליון מסומן.
לחץ על אישור. שים לב לחלקים של הקריקטורה בתוך חמישה אנגסטרומים של ליגנדים אלה מודגשים. כדי להציג את שרשראות הצד כמקלות ולהציג את האתר הפעיל מולקולות מים להשתמש בתפריט קשרים אטומים פעולות כדי להראות אותם.
או להפעיל אותם עם לחצנים אלה כאן. כדי לנקות את הבחירה, לחץ במקום כלשהו בשטח הריק. התוצאה הסופית של פרוטוקול זה צריכה להיות מודל עם האתר הפעיל של החלבון והליגנדים המוצגים כמקלות צבועים באופן מנוגד.
אינטראקציות כריכה קוטביות מרכזיות מוצגות עם קווים מנוקדים וחלק מהשאריות ליצירת אנשי קשר מסומנות בתווית. ממשק iCn3D מכיל תפריטים נפתחים, מציג המבנה ויומן פקודות. תצוגה זו מציגה את התפריטים המוקפצים של ערכות ורצף וביאורים, המופיעים כאשר המשתמש מבצע פקודות הדורשות אותם.
נתחיל את הפרוטוקול בשלב 2.4, נבחר שאריות בתוך חמישה אנגסטרומים כדי להגדיר אתר פעיל. כדי לבחור את הליגנדים, השתמש בתפריט הנפתח הנבחר ולחץ על בחר בתת-ממד, ודא שהשאריות נבדקות. לחיצה על כפתור alt במחשב או על לחצן האפשרויות ב-Mac, לחץ/י על הליגנד הראשון.
לאחר מכן לחץ על בקרה ולחץ על שני ליגנים הנותרים כדי להוסיף אותם לבחירה. שמור את הבחירה באמצעות התפריט הנפתח, לחץ על בחר, שמור בחירה, הזן שם ולחץ על שמור. התפריט הנפתח Select sets יופיע כעת כאשר שלושת הליגנדים נבחרו.
עכשיו בחר את השאריות בתוך חמישה אנגסטרום של ליגנדים. השתמש בתפריט הנפתח בחר לפי מרחק. בתפריט המוקפץ שמופיע, שנה את חנית הפריט השניה ברדיוס לחמישה אנגסטרומים על-ידי הקלדה בבלוק, לחץ על תצוגה.
ולאחר מכן סגור את החלון על-ידי לחיצה על ה- X בפינה השמאלית העליונה. שמור את חמשת האתר הפעיל של אנגסטרום על-ידי לחיצה על התפריט הנפתח, בחר שמור בחירה והשתמש בלוח המקשים כדי להזין שם. לאחר מכן לחץ על שמור.
כעת צרו בחירה חדשה המשלבת בין שתי הקבוצות. ניתן לשלב אותם בתפריט המוקפץ 'ערכות בחירה'. במחשב, לחץ על שליטה בשתי ערכות או בפקודה Mac.
שוב, לחץ על התפריט הנפתח, בחר שמור בחירה והקלד שם חדש ולאחר מכן לחץ על שמור. כדי להציג אינטראקציות כגון קשרי מימן, השתמש בתפריט הניתוח ובחר אינטראקציות. אנחנו נהיה מעוניינים רק בקשרי מימן וגשרי מלח כאן.
אז נבטל את הסימון של שאר אלה. נבחר שלושה ליגנדים. ולסט השני, השאריות בתוך חמישה אנגסטרום.
לחץ על אינטראקציות תצוגה תלת-ממדיות וסגור את החלון. זה מראה חלק מהשאריות שמתקשרות אבל זה לא מראה את כל חמשת האתרים הפעילים של אנגסטרום. כדי להציג את זה ישתמש שוב בתפריט ערכות בחירה.
לחץ על חמישה אנגסטרום מלא ולאחר מכן בתפריט הנפתח, לחץ על סגנון שרשראות צד, מקלות. כדי להחיל צביעת CPK, לחץ על התפריט הנפתח צבע ולחץ על אטום. התוצאה הסופית של הפרוטוקול צריכה להיות מודל שנראה כך עם האתר הפעיל של החלבון והליגנד המוצגים כמקלות צבועים באופן מנוגד.
אינטראקציות איגוד חשובות מוצגות עם קווים מנוקדים וכל השאריות באחת הבחירות שנוצרו במהלך הפרוטוקול מסומנות בתווית. ממשק Jmol מכיל תפריטים נפתחים, סרגל כלים, מציג המבנה, תפריט מוקפץ וקונסול Jmol המכיל את שורת הפקודה. אנחנו מתחילים את פרוטוקול Jmol בשלב 3.4, בחירת שאריות בתוך חמישה אנגסטרום כדי להגדיר אתר פעיל.
קונסולת Jmol היא הדרך הטובה ביותר לבחור את השאריות בתוך חמישה אנגסטרום. הקלד פקודה זו כדי לבחור שאריות בתוך חמישה אנגסטרומים של שלושת הליבנדים. 193 אטומים נבחרים אך אלה אינם מייצגים את שאריות חומצת האמינו המלאה.
כדי לבחור אותם, השתמש בפקודה מוקלדת, בחר בתוך (קבוצה, נבחר) והקש Enter. שים לב שהילה נוספת של בחירה מופיעות. כדי להציג שאריות אלה כמקלות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להציג את התפריט המוקפץ, לרחף מעל סגנון, לתכנן ולאחר מכן לחץ על מקלות.
שימו לב שיש כאן עדיין כמה הילה ריקה. אלו מולקולות המים באתר הפעיל. כדי לבחור רק את מולקולות המים, אנו יכולים לבצע מחדש פקודה זו ולאחר מכן לשנות אותה.
לחץ בתוך המסוף ולאחר מכן השתמש במקשי החצים למעלה כדי למצוא פקודה זו ולחץ על Enter כדי לבצע אותה מחדש. כדי להציג את מולקולות המים כאטומים, אנחנו רוצים להסיר את הבחירה של ליגנד ואת החלבון. נקליד שתי פקודות כדי לעשות את זה.
הליבגנים שלנו נחשבים לקבוצות הטרוסקסואליות, אבל מים נחשבים גם לאחד. אז בתוך הפקודה הזאת, אנחנו צריכים להגדיר שאנחנו לא מסירים את המים. לחץ על הזן ועכשיו רק מולקולות המים נבחרות.
לחץ על תפריט התצוגה הנפתחת, רחף מעל אטום ולחץ על 20% מרדיוס ואן דר ואלס. יון המגנזיום הירוק עדיין מוצג כמקלות. בדרך כלל יונים מוצגים כספירות.
לחץ במסוף Jmol ולאחר מכן הקלד בחר MG ולאחר מכן מילוי שטח 50%הליגנדים בתוך שרשראות נצבעים באופן זהה. כדי להבדיל ביניהם, כדאי לצבוע מחדש את הליגנדים. בקונסולה, אני אבצע פקודה מרובת שורות, שהעתקתי-הדבקה מגיליון לרמות שאני מרחיב על בסרטון המשלים Jmol.
התוצאה של פרוטוקול זה צריכה להיות מודל שנראה כך עם האתר הפעיל של החלבון המוצג כמקלות. והליגנדים הראו לנו מקלות בערכת צבעים רכה יותר. קווים צהובים מציינים את אינטראקציות האיגוד ושאריות בודדות מסומנים כרצונם.
ממשק PyMOL מכיל תפריטים נפתחים, מציג המבנה, לוח האובייקטים שמות ותפריט פקדי העכבר. שורת הפקודה הראשית מסומנת גם באיור זה. אנחנו מתחילים את הפרוטוקול הראשוני בשלב 4.4, בחירת שאריות בתוך חמישה אנגסטרומים כדי להגדיר אתר פעיל.
כדי לבחור את הליגנדים לחץ על כל אחד מהם. בחירה חדשה מוקפצת, שניתן לשנות את שמה על-ידי לחיצה על לחצן A. באמצעות המקלדת, מחק את האותיות sele והקלד ליגנים במקומם.
הקש Enter. אנחנו יכולים להשתמש בבחירה זו כדי להגדיר את האזור סביבו. התחל על-ידי לחיצה על לחצן A ובחר את פריט התפריט הכפול.
בבחירה חדשה זו, sel01, לחץ על A ובחר את שינוי שם פריט התפריט. באמצעות לוח המקשים, מחק את האותיות הקיימות והקלד פעיל. זה עדיין בחירת שלושת הליבנדים שלנו כך שנצטרך לשנות אותו שוב, באמצעות לחצן פעולות A.
לחץ על הלחצן, בחר שנה והרחב את הבחירה בחמישה אנגסטרום. עכשיו תפסנו את הליגנדים ואת השאריות בתוך חמישה אנגסטרום. לחצן S על ה- S מייצג את ההצגה.
לחץ על זה כדי להציג את החלבון בדרכים שונות. נראה את שוש זה כמקלות. לחץ בשטח הריק כדי לנקות את הבחירה.
זה כבש את חומצות האמינו בתוך חמישה אנגסטרום אבל לא את המים. אנחנו יכולים שוב, לשכפל את הבחירה ועכשיו לשנות אותו כדי לבחור רק את המים. בלחצן הפעולות A, שכפל.
בחירה 2 מופיעה. בואו לשנות את זה למים פעילים. הפעם נשתמש בלחצן A כדי לשנות, מסביב כדי לבחור את האטומים סביב הבחירה שלנו.
אטומים בתוך ארבעה אנגסטרום. זה בחר את המים אבל גם כמה אטומים של שרשראות הצד. כדי לשנות זאת עוד יותר, השתמש בלחצן A כדי לשנות ולהגביל לממס.
עכשיו אנחנו יכולים לראות רק את מולקולות המים מוארות. שוב בלחצן A, אנו יכולים להחיל קביעה מוגדרת מראש. בחר קביעה מוגדרת מראש, כדור ומקל ועכשיו מולקולות המים מוצגות כדורים.
התוצאה הסופית של הפרוטוקול היא מודל שנראה כך עם האתר הפעיל בליגנדים המוצגים כמקלות צבועים באופן מנוגד. קווי מקף צהובים מציגים אינטראקציות איגוד קוטביות ושאריות בודדות מסומנות באמצעות הבחירות שנוצרו בחלונית האובייקט שמות. שגיאות בביצוע הפרוטוקול עלולות להוביל לתוצאות תת-אופטימליות.
לדוגמה, החלבון כולו מוצג כמקלות. כדי לפתור בעיות, המשתמש יצטרך תחילה להסתיר את ייצוג המקל עבור המבנה כולו. ולאחר מכן הצג מחדש את ייצוג המקל עבור האובייקט הנקרא פעיל בלבד באמצעות לחצן S.
כאן המודלים שנוצרו באמצעות כל תוכנית מוצגים זה לצד זה. למרות שיש הבדלים בתצוגה של האנזים, אותן תכונות מרכזיות ואינטראקציות ניתן לראות בכל אחד מארבעת הדגמים. משתמש המעוניין לשלוט באחת התוכניות המכילות שורת פקודה מעוניין ללמוד להחיל ולשנות פקודות מוקלדות.
כפי שרמזתי בפרוטוקול Jmol, כלי שימושי הוא גיליון לרמות פקודה. קובץ טקסט רגיל המכיל קודים הנמצאים בשימוש תכוף להפניה. כדי להפוך למשתמש מתקדם, כדאי להבין אילו חלקים של הפרוטוקול ניתן להתאים ולשנות.
עם תרגול פרוטוקולים אלה ניתן להחיל מודל כל אתר פעיל אנזים של עניין.
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את המיומנות של מידול ביו-מולקולרי באמצעות ויזואליזציה של האתר הפעיל של האנזים גלוקוקינז (glucokinase) באמצעות ארבע תוכנות חינמיות: iCn3D, Jmol, PyMOL ו-UCSF ChimeraX. המדריך מספק הוראות שלב-אחר-שלב למידול ואנוטציה של האתר הפעיל עם ליגנדים קשורים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מידול ביו-מולקולרי
- ויזואליזציה של חלבונים
- ניתוח אתר פעיל של אנזים
רקע
- הבנת מבני חלבונים היא קריטית במדעי הביולוגיה.
- אתרים פעילים חיוניים לתפקוד האנזים ולאינטראקציה עם סובסטראטים.
- כלים תוכנתיים שונים זמינים להדמיה של מקרו-מולקולות.
- מחקר זה מתמקד ב-glucokinase, אנזים המעורב במטבוליזם של גלוקוז.
מטרת המחקר
- להדריך חוקרים כיצד למדל אתרי פעילות של אנזימים באופן יעיל.
- להשוות בין כלי ויזואליזציה מולקולרית שונים.
- לספק מדריך מקיף לבחירה ולהצגה של ליגנדים ושיירי חומצה גרעינית/חלבון.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש ב-iCn3D, Jmol, PyMOL ו-UCSF ChimeraX לצורך מידול.
- פרוטוקול שלב-אחר-שלב לבחירת שאריות בטווח של חמישה אנגסטרם מליגנדים.
- ויזואליזציה של חומצות אמינו ומולקולות מים בסמיכות לליגנדים.
- הערה (Annotation) של אינטראקציות מרכזיות ומאפיינים מבניים.
תוצאות עיקריות
- מידול מוצלח של האתר הפעיל של גלוקוקינאז עם ליגנדים קשורים.
- ויזואליזציה ברורה של האינטראקציות בין האנזים לסובסטראטים.
- הדגמה של היכולות של כל כלי תוכנה.
- יצירת סרטון הדרכה מפורט עבור כל תוכנית.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות בעלות ערך בנוגע לטכניקות של מידול ביו-מולקולרי.
- הוא מדגיש את חשיבותם של כלי תוכנה בביולוגיה מבנית.
- חוקרים יכולים להדמיות ולנתח ביעילות את האתרים הפעילים של אנזימים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה ביו-מולקולרית מאפשרת תיקוף של מטרות על ידי חשיפת הגורמים המבניים של קישור ליגנדים ותפקוד אנזימי. מידול של אתרים פעילים תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הבהרת הקשרים בין מבנה לתפקוד. מיומנות זו מגבירה את הביטחון החיזוי במערכי העבודה של זיהוי מובילים (lead identification) ופיתוח בדיקות (assay development).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של אינטראקציות קישור לליגנדים באתר הפעיל של הגלוקוקינאז (glucokinase).
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי זיהוי שאריות חומצות אמינו ומולקולות מים מרכזיות המעורבות בזיהוי הסובסטרט.
- ערך חיזוי: מסייע במיון תיק הפיתוח על ידי אספקת תובנות מבניות המנחות את הערכת הביטחון במטרה ואת מדדי היכולת להפוךה למטרה תרופתית (druggability).
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מודלים ביולוגיים שעברו תיקוף עבור סריקות המשך, באמצעות הגדרת שאריות באתר הפעיל בטווח של חמישה אנגסטרומים מהליגנדים הקשורים.
- ערך תפעולי: קידום סטנדרטיזציה והס reproducibility של הבדיקה באמצעות ויזואליזציה עקבית של אינטראקציות קשירה ב-iCn3D, Jmol, PyMOL ו-UCSF ChimeraX.
- יכולת הרחבה: מאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה עבור קמפיינים של סריקה, על ידי אספקת פרוטוקולים ניתנים להעברה למידול של כל אתר פעיל של אנזים רלוונטי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת תובנות מבניות משלב הגילוי לאישור פרה-קליני על ידי שמירה על עקביות במידול האתר הפעיל לאורך זרימות העבודה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מדגישה אינטראקציות קשירה פולריות וסימון שאריות כדי לתמוך בעיצוב מבוסס מבנה ובאופטימיזציה של מולקולות מובילות.
- רלוונטיות למחלה: ממדלת את ה-glucokinase האנושי, אנזים מרכזי במטבוליזם של גלוקוז, הרלוונטי לתוכניות יעד של סוכרת והפרעות מטבוליות.
שילוב בקו תהליך ובזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל (lead identification), על ידי אפשור ניתוח מבני של קומפלקסים של אנזים-ליגנד.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות ויזואליזציה של האופן שבו ליגנדים נקשרים לאתר הפעיל של הגלוקוקינאז.
- סריקה: מבטיחה מוכנות של הבדיקה באמצעות בחירה והצגה סטנדרטית של שאריות ומולקולות מים בסמיכות לליגנדים.
- אנליזה: מייצרת פלטי מבנה כמותיים, כגון ויזואליזציה של קשרי מימן וסימון שאריות, המסייעים בהשוואת אופני קישור של ליגנדים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני על ידי אספקת מסגרת הניתנת לשימוש חוזר למידול אתרים פעילים של אנזימים במערכות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת ניתנת להרחבה למידול של כל אתר פעיל של אנזים, ובכך מפחיתה הדרכות כפולות ומגבירה עקביות בין צוותים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה, הפחתת עמימות מכניסטית באינטראקציות בין אנזים לליגנד.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ועקביות רב-פלטפורמית בויזואליזציה ביו-מולקולרית.
- ערך אסטרטגי: שיפור קבלת החלטות לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go), יעילות הון בשלבי הגילוי המוקדמים והפחתת סיכון ביולוגי באופטימיזציה של מובילים (lead optimization).
- השפעה על הפורטפוליו: תיעוד ותיעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על ביטחון מבני ונגישות לאתר הקשירה.
שיקולי יישום
- דורש ידע בסיסי בביולוגיה מבנית ובאינטראקציות בין חלבון לליגנד.
- נדרשת גישה לתשתית חישובית המסוגלת להריץ את iCn3D, Jmol, PyMOL, או UCSF ChimeraX.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי ויזואליזציה כדי להבטיח פרשנות עקבית של מודלי האתר הפעיל.
- כולל שיקולי התאמה בעת החלת הפרוטוקול על מערכות אנזימים שונות או סוגי ליגנדים שונים.
- מוגבל על ידי מיומנות המשתמש בממשקי שורת פקודה ובכלי בחירה בארבע פלטפורמות התוכנה.
