הדמיה קונפוקלית בתפוקה גבוהה של מטרימי ספייק SARS-CoV-2 מצומדים קוונטיים למעקב אחר כריכה ואנדוציטוזיס בתאי HEK293T
21 באפריל 2022
בפרוטוקול זה, נקודות קוונטיות המצומדות לספייק SARS-CoV-2 רקומביננטי מאפשרות בדיקות מבוססות תאים כדי לפקח על קשירת ספייק ל- hACE2 בקרום הפלזמה ואנדוציטוזיס לאחר מכן של החלבונים הכרוכים לתוך הציטופלסמה.
הקמנו טכנולוגיית פלטפורמה עבור SARS COVID 2 שיכולה להיות ישימה לווירוסים אחרים עם זיהוי תאים בתיווך ספייק וכניסה כצעד הראשון בזיהום ויראלי תאי. נקודות קוונטיות בהירות, יציבות, וניתן לתפקד על פני השטח שלהן עבור מגוון יישומים תאיים. בשיטה זו, אנו יכולים לדמיין ולמדוד הפנמה של ספייק לתאים.
כדי להכין 0.1%BSA. הוסף 130 מיקרוליטרים של 7.5%BSA ל-10 מיליליטר של מדיית הדמיה בתערובת. עבור דילול סדרתי של 6.1 עד 3 ומשולש להוסיף 14.26 מיקרוליטרים של QD ספייק ל 285.74 מיקרוליטרים של 0.1%BSA כדי להפוך את הריכוז הגבוה ביותר של 20 nanomole.
לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטרים של 20 nanomole או QD ספייק ל 200 microliters של 0.1% BSA כדי להפוך את האשליה השנייה של 6.67 ננומול QD ספייק. הסר את כל המדיה המבוזבזת מכל באר עם שאיפה רב ערוצית, שטוף פעם אחת עם פיפטה רב ערוצית עם 100 מיקרוליטרים של מדיית הדמיה לבאר, ואז שאף 100 מיקרוליטרים של מדיית ההדמיה. מוסיפים בחזרה 50 מיקרוליטרים של פתרון QD Spike לבאר ודגור על הצלחת במשך שלוש שעות בחממה לחה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
לבושים בציוד מגן, הכינו 4% PFA ו-0.1%PSA הדמיה בתוך ארון בטיחות ביולוגי סטרילי, שאפו 50 מיקרוליטרים של QD Spike מכל באר והוסיפו 100 מיקרוליטרים של 4%PFA לבאר עם פיפטה רב ערוצית אוטומטית כדי להימנע מייבוש הבארות. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם PBS, להכין את הצבע הגרעיני האדום העמוק על ידי דילול פתרון מלאי חמישה מילימטר באחד עד 1000 ב PBS, לשאוף PBS ולהוסיף בחזרה 50 מיקרוליטרים של צבע גרעיני מדולל לכל באר. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואז לשטוף שלוש פעמים עם PBS, לדחוף את הצלחת או לאטום אותה באמצעות אטם צלחת להדמיה מאוחר יותר.
יש לאחסן את הצלחת ב-4 מעלות צלזיוס. הפעל את התוכנה עבור פלטפורמת ההדמיה. לאחר הכניסה לפלטפורמת ההדמיה צור פרוטוקול רכישה חדש על ידי בחירת סוג צלחת כלוח הדמיה תחתון שקוף 96 קיר, מצב אופטי נבחר הלך מוקד והגדלה כמו 40 פעמים טבילה במים, בחר binning כאחד.
בחר את המצב עבור ניגודיות פנים דיגיטלית כגון ניגודיות גבוהה כדי לייצר גופי תא מוגדרים היטב. צלם תמונה כדי לאשר שכותרת זו מתאימה כפי שניתן לראות בחלון התמונה, בחר בערוץ C המתאים לשימוש עם קו התא ACE2-GFP כדי להציג באופן חזותי סחר ב- ACE2 בתוך התא. ליצירת ערוץ QD מותאם אישית, בחרו בתפריט הנפתח של המשולש ובחרו את העירור בטווח של 405 ננומטר בפליטה בטווח של 608 ננומטר, בחרו באר עם אות QD ציטופלסמי חזק כדי להגדיר את זמן החשיפה, עוצמת הלייזר ומיקום הגובה של Z.
בדוק אם גובה ברירת המחדל מפיק תמונה של התאים במישור המוקד הרצוי. מיקום Z יהיה נמוך יותר עבור puncta אנדוציקטוז מאשר מיקום Z עבור קרום הפלזמה. בחר זמן חשיפה, בדרך כלל בין 100 ל- 300 אלפיות השניה, המפיק תמונה בהירה עם רמות אפורות, הגדולה לפחות פי שלושה מאות הרקע.
ב 20 ננומול רמות האפור צריך להיות כ 6, 000 יחידות אטומיות עם 200 אלפיות השנייה זמן חשיפה ו 80% כוח לייזר. בדוק את רמות האפור על ידי לחיצה ימנית על התמונה המיוצרת עם תכונת התמונה בכל ערוץ ובחירת עוצמת המופע, ולאחר מכן לחץ שמאלה על האובייקט של עניין או רקע כדי להציג את רמת האפור עבור פיקסל זה, להתאים את כוח הלייזר כדי לכוונן את עוצמת האובייקטים של עניין. שמור את פרוטוקול הרכישה, לעבור כדי להפעיל ניסוי ולהזין את שם הלוחית, להפעיל את הניסוי.
טרנסלוקציה של QDs ו- ACE2 הומחשה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וקו תא מבטא ACE2-GFP. פילוח תמונה וניתוח שלאחר מכן בוצע כדי לחלץ פרמטרים רלוונטיים כגון ספירת ספוט. ראשית, גרעינים היו מקוטעים מערוץ הסמן הגרעיני כדי ליצור אוכלוסיית החזר על ההשקעה.
לאחר מכן, אזור החזר השקעה המתאר את התא עם פילוח באמצעות ערוץ ACE2-GFP. לבסוף, כתמי ספייק QD 608 היו מפולחים מאזור החזר על ההשקעה בתא, אותות QD ו- ACE2 מופנמים הראו לוקליזציה משותפת חזקה. ניסוי תגובת ריכוז עם שישה ריכוזים שונים של QD ספייק בוצע בתאי HEK 293T.
קביעת ריכוזים אופטיים של QD, QDS יכול לשמש נמוך כמו 2.22 nanomole, עם זאת, מומלץ להשתמש בריכוזים של 10 nanomole ומעלה כדי להבטיח תגובה חזקה. במהלך ההטיה לצבירה של חלבון QD עלולה להתרחש. אגרגטים נצפו בתמיסת QD כמשקעים מגושמים בהירים ותאי HEK 293T, QDs דוגר עם נוגדנים מנוטרלים החל מ 30 מיקרוגרם למיקרוליטר לפני תוספת לתאים, נוגדנים אלה חסמו הפנמה מחייבת וגרמו לירידה בספירת הספוט בהשוואה לתאים שטופלו ב- QD בלבד.
מאמר זה יכול לשמש גם להקרנה בתפוקה גבוהה, הערכת עופרת של נטרול נוגדנים כדי לזהות אנטי-ויראליים של משחק מילים לכניסה ויראלית בלוק ולהיות מותאם ללמוד גרסאות חדשות המתעוררות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכנולוגיית פלטפורמה המשתמשת בנקודות קוונטומית (quantum dots) המשורשרות לחלבוני ד Spike של SARS-CoV-2, כדי להדמות ולמדוד את קישור חלבוני ה-spike לקולטן hACE2 על קרומי תאים, וכן את האנדוציטוזה העוקבת של חלבונים אלה אל תוך הציטופלזמה. שיטה זו מספקת תובנות לגבי השלבים הראשוניים של זיהום ויראלי תאי ומציעה ישימות רחבה לנגיפים אחרים בעלי חדירה המתווכת על ידי חלבוני spike.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה מולקולרית
- פתוגנזה נגיפית
רקע
- SARS-CoV-2 מקייים אינטראקציה עם hACE2 לצורך כניסה לתא, שלב קריטי בזיהום נגיפי.
- נקודות קוונטיות (Quantum dots) מספקות אמצעי יציב ואפקטיבי למעקב אחר תהליכים ביולוגיים.
- הבנת ההפנמה (internalization) של חלבון ה-spike עשויה לקדם פיתוח של תרופות אנטי-ויראליות.
שיטות שהושתמשו בהן
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להדמיית תהליכים תאיים.
- תאי HEK 293T כמודל ביולוגי לניסויים.
- ניסויי תגובת ריכוז לאופטימיזציה של השימוש בנקודות קוונטיות.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של הפנמה של ה-spike וקו-לוקליזציה עם ACE2.
- קביעת ריכוזי נקודות קוונטום אופטימליים לקבלת תוצאות מהימנות.
- יכולת מוכחת להעריך את השפעתם של נוגדי סימום (neutralizing antibodies) על כניסת הנגיף.
מסקנות
- המחקר מספק מתודולוגיה חדשנית למעקב אחר מנגנוני כניסה נגיפית.
- גישה זו עשויה להוביל להתקדמויות בסריקות אנטי-ויראליות ובפיתוח טיפוליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה בסביבה של תפוקה גבוהה (high-throughput) של קישור חלבוני הספייק (spike protein) של נגיפים ואנדוציטוזה, ובכך היא תומכת בתיקוף יעדים אנטי-ויראליים בשלבים מוקדמים. על ידי כימות אינטראקציות רצפטור-ליגנד ותהליכי תעתוק (trafficking) בהקשר תאי רלוונטי פיזיולוגית, היא מספקת הפחתת סיכונים (de-risking) מכנית עבור מעכבי כניסה. הפלטפורמה תומכת בסריקה ניתנת להרחבה של נוגדנים מנטרלים ותרכובות מובילות נגד SARS-CoV-2 ונגיפים אחרים המתווכים על ידי חלבון הספייק.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תצפית ישירה על קישור חלבון ה-spike ל-hACE2 וההפנמה שבאה בעקבותיו, ובכך מתקף את מנגנון הכניסה של הווירוס כמטרה טיפולית.
- ערך תפעולי: משתמש בצמידים של נקודות קוונטיות (quantum dot conjugates) כגשים פלואוריסצנטיים יציבים למעקב אחר דינמיקת ה-spike עם יחס אות-רעש גבוה, מה שמפחית תוצאות שגויות שליליות בבדיקות קישור.
- ערך ניבוי: נתוני תגובה לריכוז (למשל, איתות יעיל בריכוז של ≥10 nanomole QD Spike) תומכים במידול מעורבות מטרה תלוי-מינון לצורך אופטימיזציה של תרופות מובילות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: סגמנטציה של גרעינים, תאים המבטאים ACE2-GFP ונקודות QD Spike מאפשרת ניתוח כמותי של מספר הנקודות לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של מעכבי קישור והפנמה.
- ערך תפעולי: הפרוטוקול כולל שלבי קיבוע, צביעת גרעינים והדמיה אוטומטיים התואמים לפורמט של פלטה עם 96 בארות, ובכך תומך בסטנדרטיזציה ובשחזור של הבדיקה.
- יכולת הרחבה: השימוש שהודגם בניסויי תגובה לריכוז עם שישה ריכוזים ודילוציות בשלישייה מעיד על מוכנות למסעות סריקה בתפוקה בינונית עד גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: קולוקליזציה של QD Spike שהפנימו עם ACE2-GFP מספקת קריאה מכניסטית להערכת נוגדנים נטרליים החוסמים כניסה ויראלית, ובכך תורמת ישירות להערכת מועמדים מובילים.
- המשכיות פרה-קלינית: היכולת לבחון יעילות של נוגדנים (למשל, 30 μg/μL של נוגדנים נטרליים המפחיתים את מספר הנקודות) תומכת בקבלת החלטות על קידום פיתוחים אנטי-ויראליים תוך התחשבות בסיכונים.
- סתגלנות: ניתן להחיל את הפלטפורמה על וריאנטים חדשים ועל וירוסים אחרים המתווכים על ידי חלבון ה-spike, מה שמעלה את התועלת ארוכת הטווח בתוכניות להערכות למגפות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה נשבצת ברצף גילוי התרופות האנטי-ויראליות, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי המולקולה המובילה ועד להערכה פרה-קלינית, ובכך היא מאפשרת הערכה איטרטיבית של תרכובות המכוונות לחלבון ה-spike.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על אינטראקציית spike-hACE2 ומסלולי אנדוציטוזה, תוך הבהרת מנגנון הפעולה של מעכבי כניסה.
- סינון (Screening): מייצר תוצרי דימות כמותיים (ספירת נקודות, קו-לוקליזציה) המאפשרים השוואה מהימנה של השפעות תרכובים על קישור והפנמה ויראלית.
- אנליטיקה: מחלץ מדדי ספירת נקודות ועוצמה מערוצים מסגמנטים, ומספק נתונים סטטיסטיים לצורך פרופיל תגובה למנה ועיכוב.
- מחקר תרגומי: מקשר נתוני קישור והפנמה לתוצאות פונקציונליות (למשל, הפחתה של כניסת spike בתיווך נוגדנים), ובכך תומך בהחלטות המשך (go/no-go).
- שימוש חוזר ארגוני: הפרוטוקול תוכנן לשימוש חוזר במגוון מטרות וקווי תאים, כאשר הצמידות של נקודות קוונטיות ניתנת להתאמה לליגנדים או רצפטורים אחרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ויזואליזציה ישירה של מנגנוני חדירה ויראלית, ובכך מפחית עמימות מנגנונית בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: יציבותם ובהירותם של נקודות קוונטום מאפשרים זיהוי עקבי של אותים לאורך מספר הרצות, מה שמשפר את השחזרות הבדיקה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר זיהוי מוקדם של מעכבי חדירה יעילים, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים עקב חוסר במעורבות המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מבוסס נתונים של מועמדים מובילים על בסיס עיכוב כמותי של הפנימה (internalization), ובכך משפר את יעילות ההון בתוכניות אנטי-ויראליות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, טיפול בנקודות קוונטיות (quantum dots) וניתוח סגמנטציה של תמונות.
- תלוי במערכות דימות פלואורסצנטי קונפוקאלי או בשדה רחב (wide-field) עם מסנני עירור/פליטה ניתנים להגדרה (לדוגמה, עירור ב-405 nm, פליטה ב-608 nm עבור QD608).
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים עבור דילול נוגדנים, זמני דגירה ושלבי שטיפה כדי לצמצם שונות בקריאות של ספירת הנקודות.
- יש להתחשב באגרגציה של נקודות קוונטיות במהלך הצמידה, דבר הדורש הבהרה של התמיסה (לדוגמה, צנטריפוגציה או סינון) לפני השימוש.
- התאמה למערכות שאינן HEK293T עשויה לדרוש אופטימיזציה של ביטוי ACE2 או סימון קולטן חלופי למחקרי קו-לוקליזציה (co-localization).
