Name: חקר ארגינין מתילום על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: חקור כימות מתילציה ארגינין בדגימות ביולוגיות מגוונות באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית. שיטה זו מאפשרת הערכת סיכון וסיווג חולים במחקר סרטן ומחלות נוספות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה על ידי מענקי קרן המדע האוסטרית (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (פרויקט דגל DYNIMO), מענקי הסוכנות האוסטרית לקידום המחקר (FFG) 864690 ו- 870454, המרכז לחקר מטבוליזם אינטגרטיבי גראץ; תוכנית התשתיות האוסטרית 2016/2017, ממשלת סטיריה (Zukunftsfonds) וקרן סטארט-אפ לכישרונות ברמה גבוהה של האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן (XRCZX2021020). אנו מודים למרכז למחקר רפואי על הגישה למתקני תרביות תאים. F.Z. הוכשר במסגרת תוכנית הדוקטורט רפואה מולקולרית, האוניברסיטה הרפואית של גראץ. Q.Z. הוכשר במסגרת תוכנית הדוקטורט מטבולית ומחלות לב וכלי דם, האוניברסיטה הרפואית של גראץ.

הידרוליזה של חלבון שמרים שימשה כדגימות לתוצאות המייצגות של עבודה זו. הפרוטוקול כולו מסוכם באיור 1.
1. הכנת חומרים וריאגנטים
<ol><li>מתנול/מים: הכינו תערובת של שני חלקים של 99% מתנול (MeOH) וחלק אחד של H 2 O, המסומן כ-MeOH/H 2 O. אחסנו MeOH טהור ו-MeOH/H2O בטמפרטורה של-20°C כדי למזער את אידוי האלכוהול ולהגביר את יציבות הדגימה.</li>
	<li>חומצה הידרוכלורית (HCl): לדלל 9 mol/L מ HCl מרוכז (12.0 mol / L או 37%) כמו גם 0.1 mol / L של HCl. התמיסה המרוכזת יותר (9 mol/L) משמשת להידרוליזה של חלבונים, ואילו התמיסה המרוכזת יותר (0.1mol/L) משמשת למיצוי בשלב מוצק. אזהרה: יש לעבוד בתוך מכסה האדים.</li>
	<li>הכינו תמיסה חלופית ל-SPE המכילה 10% תמיסת אמוניה רוויה (במלאי: 30% עם אמוניה), 50% מתנול ו-40% מים (v/v).</li>
	<li>מאגר NMR: להמיס 5.56 גרם של דיסודיום מימן פוספט (Na 2 HPO 4, 0.08 mol/L), 0.4 גרם של 3-(trimethylsilyl) חומצה פרופיונית-2,2,3,3-d4 מלח נתרן (TSP, 5 mmol / L), 0.04% (w/v) של נתרן אזיד (NaN3) ב 500 מ"ל של דו תחמוצת דאוטריום (D2O) ולהתאים ל- pH7.4 (באמצעות HCl או NaOH, בהתאמה) (ראה טבלת חומרים). בדוק את הטוהר של כל אצווה חיץ חדשה על ידי ספקטרוסקופיית NMR. הערה: כמות המזהמים (למשל, אתנול) צריכה להיות נמוכה ככל האפשר.</li>
	<li>מלא צינורות עיסה בחרוזי תחמוצת זירקוניום (צינורות 2 מ"ל וחרוזים 1.4 מ"מ מתאימים לרוב היישומים, אך קיימות גרסאות שונות) (ראה טבלת חומרים). מלאו בערך 10-20 חרוזים ביד או קנו צינורות ממולאים מראש, הזמינים גם כן.</li>
	<li>שמור פיפטות ואת הקצוות המתאימים מוכן בטווח של 10-1,000 μL. הערה: מים טהורים מאוד, המסומנים כ-H 2 O, המוגדרים על ידי התנגדות גבוהה של ≥18.2 MΩ·cm-1, שימשו לאורך כל העבודה. זה מתאים למים מזוקקים כפולים.</li>
</ol>2. איסוף ואחסון דוגמאות
<ol><li>יש להקפיא את הדגימות הנוזליות (סרום/פלזמה, תרבית תאים וכו') בחנקן נוזלי ולאחסן אותן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.</li>
	<li>הכינו את החומרים המוצקים כמפורט להלן.<ol><li>אספו את התאים מתרביות תאים (3-5 מיליון תאים) על ידי איסוף תאים דבקים, לאחר שטיפה במי מלח חוצצי פוספט קר, גירוד וצנטריפוגה, או צנטריפוגה ישירה של תאים שגדלו בתרחיף.</li>
		<li>הסר את supernatants התא (אשר עשוי להיאסף לניתוח נוסף, או על ידי מדידה ישירה רצופה, ראה שלב 6, או לאחר משקעים של חלבונים מסיסים, ראה שלב 3.1), ולאחר מכן הבזק להקפיא את הכדוריות עם חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 ° C. לעיבוד נוסף, ראה שלב 3.2.</li>
		<li>אחסן ואסוף את הרקמות בהתאם למטרת המחקר. עבור רקמות הומוגניות מאוד, כגון הכבד או השריר, לנתח כל חלק של זה. לדוגמה, במקרה של מוח עכבר, לקבוע מתילציה גלובלית ארגינין של המוח כולו או קטעי המוח. הערה: המשקל האידיאלי של רקמות להיות מעובד הוא 30-60 מ"ג. רצוי להקפיא ולכתוש את המוח כולו ולהשתמש באליציטוטים ממנו. לחלופין, ניתן להשתמש בחלקי מוח ספציפיים (למשל, חזיתית, המוח הקטן, אזורים עורפיים, או חצי כדור אחד, במשקל ~ 250 מ"ג).</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת מדגם ראשוני
הערה: בצע את העבודה על קרח, תוך שמירה על MeOH קר. הדגימות חייבות להישמר גם על קרח כדי למנוע פירוק חלבון.
<ol><li>עבור דגימות נוזליות, הוסף 400 μL של מתנול קר כקרח ל 200 μL של הדגימה. המשך לשלב 3.3. הערה: אם יש פחות מדגם זמין, התאם את אמצעי האחסון בהתאם; רגישות NMR היא בדרך כלל גבוהה מספיק עבור כמויות מדגם קטנות יותר, אבל צריך לבדוק בנפרד.</li>
	<li>במקרה של חומרים מוצקים, להכין מספיק צינורות 1.5 מ"ל עבור lysates (להשתמש צנטריפוגה לאחר הומוגניזציה).<ol><li>בזהירות, אך ביסודיות, להשהות מחדש את כדורי התא ב 600 μL של MeOH/H2O ולהעביר את כל השלב הנוזלי לתוך צינורות עיסה.</li>
		<li>הכניסו רקמות לתוך צינורות עיסה (ניתן לשקול אותן ישירות לתוך הצינורות) והוסיפו 600 μL של MeOH/H2O (עבור 30-60 מ"ג; התאימו אם המשקל שונה באופן משמעותי).</li>
		<li>הכניסו את הצינורות לתוך ההומוגנייזר של הרקמה (ראו טבלת חומרים) ובצעו הומוגניזציה פעם אחת למשך 20 שניות עם טלטול כבד (עבור כדורי תאים, רקמות רכות) או פעמיים במשך 20 שניות כל אחת (או יותר במידת הצורך) עם מרווח של 5 דקות בין לבין (עבור רקמות נוקשות).</li>
		<li>לאחר הומוגניזציה, מיד לשים דגימות על הקרח שוב ולהעביר את כל lysates לתוך צינורות חדשים 1.5 מ"ל.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לאחסן דגימות למשך 30 דקות לפחות (עד מספר ימים) בטמפרטורה של -20°C לפני עיבוד נוסף.</li>
	<li>צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 30 דקות ב-4°C. בינתיים, הכינו מספיק צינורות של 1.5 מ"ל כדי לאסוף את הסופרנאטנטים. הערה: סופרנאטנט זה (המסומן "(1)" באיור 1) עשוי להיזרק לפח, לעבור ליופיליזציה ולעבד ישירות עבור NMR (שלב 6) או לנתח אותו בדרך אחרת.</li>
	<li>בפרוטוקול זה, משקע MeOH (= גלולה המתקבלת לאחר שלב 3.1 או 3.2.2, בהתאמה) משמש לניתוח נוסף המכיל, בין היתר, רכיבים כגון חומצות גרעין ושומנים, חלבונים מתילציה ארגינין. המשך עם הידרוליזה חלבון או לאחסן את הכדוריות ב -20 ° C במשך כמה ימים.</li>
</ol>4. הידרוליזה של חלבון
<ol><li>הוסף 500 μL של 9mol/L של HCl לכל דגימה. לאחר מכן, חתכו את הכובעים של כל צינור עם מספריים והכניסו אותם לצינורות תרבית הזכוכית (איור 2A). בזהירות, אך בחוזקה, סגרו את הכובעים האדומים (ובכך בדקו את האיטום). הערה: לפני השימוש, יש לבדוק תמיד כל איטום (רדיד PTFE אפור בתוך מכסי הברגים האדומים) להידוק נכון ולנקות אותם באופן קבוע במים.</li>
	<li>בסיום, הניחו את הצינורות בתוך מלאה חלקית בחול (להעברת חום טובה יותר) ובצעו הידרוליזה במשך כ-16 שעות בטמפרטורה של 110°C בתא ייבוש.</li>
	<li>לאחר הידרוליזה, לקרר את הדגימות (~ 1 שעות).</li>
	<li>לאחר מכן, lyophilize לילה באמצעות צנטריפוגה עם ואקום גבוה (מתחת 100 Pa).</li>
	<li>להמיס את הכדוריות - אם יבש לחלוטין (אם לא, להמשיך lyophilization) - ב 1 מ"ל של 0.1 mol / L HCl ולהוסיף 50 μL של כלורופורם (CHCl3) לכל צינור; ממיסים היטב את הגלולה עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, ובכך מערבבים את הנוזלים, ולאחר מכן מעבירים את הנפח המלא לצינור חדש. אזהרה: יש לעבוד תמיד עם כמויות קטנות כדי למזער אידוי נרחב</li>
	<li>לאחר מכן, צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>אספו בזהירות את השלב העליון של הנוזל הדו-פאזי שמכיל את החלק המסיס במים (איור 2B, החלק עם הצפיפות הנמוכה יותר) עם פיפטה ומלאו אותו בצינורות חדשים. השתמשו בשפופרות של 1.5 מ"ל עבור SPE ידני (סעיף 5.2) או בבקבוקוני זכוכית עבור SPE רובוטי (סעיף 5.3 ואיור 2D). הימנעו מזליגה עלCHCl 3 ותכולתו (איור 2C).</li>
</ol>5. מיצוי בשלב מוצק (SPE)
<ol><li>לפני השימוש הראשון, נקה את מחסניות SPE פעמיים עם 1 מ"ל של הפתרון החלופי (שלב 1.3) ואחריו צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (ממוקם לתוך צינורות 15 מ"ל). הם יכולים לשמש 10-20 פעמים כל אחד.</li>
	<li>SPE ידני<ol><li>התנה מראש את המחסניות (ראה טבלת חומרים) בכל ריצה עם 1 מ"ל מתנול טהור ו- 2 x 1 מ"ל PBS, בכל פעם ולאחר מכן צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (מונח לתוך צינורות 15 מ"ל).</li>
		<li>לאחר מכן, טען את הדגימות (משלב 4.7) על מחסניות SPE וצנטריפוץ אותם ב 600 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לאחר מכן, יש למרוח מחזור כביסה כמפורט להלן.<ol><li>הוסף שלוש פעמים 1 מ"ל של H2O (כל אחד ואחריו צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר).</li>
			<li>יש להוסיף חמש פעמים 1 מ"ל של 0.1 mol/L HCl (כל אחד מהם ולאחר מכן צנטריפוגה למשך דקה אחת ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר).</li>
			<li>הוסף פעמיים 1 מ"ל של MeOH (כל אחד ואחריו צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר).</li>
		</ol></li>
		<li>לאחר מכן, לפלוט ארגינין ונגזרותיו עם 3 x 1 מ"ל של פתרון חלופי (ואחריו צנטריפוגה 1 דקות ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר) לתוך צינור יחיד 15 מ"ל. הערה: הפתרון החלופי משמש כמקל עבור ארגינין ונגזרות ומשמש גם לניקוי המחסניות (כל החומרים נשטפים לפני ההדחה או בערך החומציות הבסיסי של התמיסה החלופית). עם זאת, כדי למנוע זיהום לאורך זמן, השימוש החוזר צריך להיות מוגבל (ראה שלב 5.1).</li>
	</ol></li>
	<li>SPE רובוטי הערה: כאן, רובוט פיפטינג (החלק העיקרי המורכב ממחט צנרת, תחנת שטיפה למחט, אספקת מגיב ומיקומים עבור דגימות ואלואטים, ראה טבלת חומרים) מסופק עם מחזיק מחסנית עבור עמודות SPE. עבור מכשירים אחרים, הקפד להיות מצויד באופן מלא עם כל הדברים המפורטים.<ol><li>מלאו את הסופרנאטנט (משלב 4.7) ישירות לתוך בקבוקוני זכוכית עם איטום PTFE (איור 2D), הכינו מספיק ריאגנטים (100 מ"ל מכל אחד, כלומר תמיסת החלפה, 99% של MeOH, PBS, H 2 O ו-0.1 של mol/L HCl), צינורות של 5 מ"ל עבור אלוציה ותמיסת שטיפה עבור המחט של הרובוט (בדרך כלל H2O).</li>
		<li>השתמש ביישום או שיטה בתוכנה של הרובוט בהתבסס בדיוק על השלבים המתוארים עבור SPE ידני (שלב 5.2). הערה: הפרטים עשויים להשתנות מאוד בין ספקי מכשירים, לכן עיין במדריך התוכנה של הרובוט המתאים לתכנות. רובוט פיפטינג עובד בדרך כלל על ידי הפעלת לחץ אוויר על המחסניות במקום צנטריפוגה, וזה ההבדל העיקרי. אם הפרוטוקול מבוסס ומופעל בפעם הראשונה, כלול פקדים (לדוגמה, L-ארגינין בריכוז ידוע) כדי לאמת זרימת עבודה מיטבית.</li>
	</ol></li>
</ol>6. הכנה סופית לתמ"א
<ol><li>דגימות Lyophilize לילה כדי יובש מוחלט להיפטר אמוניה H2O.</li>
	<li>ממיסים כל דגימה ב-500 מיקרוליטר של מאגר NMR (שלב 1.4) ומעבירים לצינורות NMR. חשוב לציין, הנפח חייב להיות זהה בכל הצינורות, והדגימות חייבות להיות הומוגניות (ללא שאריות ושומנים, הנוטים להצטבר). הערה: הפרטים של ספקטרוסקופיית NMR חורגים מעבר לסקירת שיטה זו ומתוארים בפירוט רב יותר במקום אחר27. כאן, רק הדרישות העיקריות ואת השלבים מוסברים. כימות הארגינין והמטבוליטים שלו מבוצעים על ספקטרומטר NMR של 600 מגה-הרץ (ראה טבלת חומרים). באופן עקרוני, ניתן להשתמש בכל עוצמות שדה אחרות של ספקטרומטר NMR/NMR, בתנאי שניתן לזהות את אותות ה-NMR של ארגינין וארגינינים שעבר מתילציה ברגישות מספקת וללא חפיפת אותות. ניתן להשתמש בכל ראש בדיקה עם שיפועים של ציר z המסוגל להקליט ספקטרום H אחד, בתנאי שרצפי הפולסים מוגדרים בהתאם.</li>
	<li>הקלט ספקטרום 1D באמצעות רצף פולסים CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d, 512 סריקות, גודל fid 73728, רוחב ספקטרלי של 11904.76 הרץ ב- NMR של 600 MHz, עיכוב מיחזור 4 שניות) עם דיכוי אות מים באמצעות רוויה.</li>
	<li>בניסויים אלה, הסירו את הצימודים הסקלריים של 1H על ידי ניתוק וירטואלי, ובכך הפחיתו את חפיפת האותות. הקלט נוסף עבור שאלות ספציפיות ו / או דגימות מורכבות או מטריצות, למשל, 1 H-13 C-heteronuclearSingle Quantum Coherence (HSQC) ספקטרום27. הערה: עבור מטריצות מורכבות יותר שבהן אותות1H NMR של ארגינינים מתילציה יכולים להיות חופפים חלקית עם אותות1 H NMR של מטבוליטים אחרים (למשל, ליזין ), 1H הומו-גרעיני J-resolved spectra (JRES)35 נדרשים.</li>
	<li>בצע כימות מוחלט על ידי שילוב עוצמות השיא בהתאמה של תקנים של ריכוז ידוע, למשל, 100 μmol / arginine. הערה: באופן שגרתי, ADMA, SDMA ו-MMA (ראה טבלת חומרים) מדווחים כיחס ביחס לארגינין. יש לכך יתרון משמעותי שאין צורך לבצע נורמליזציה נפרדת (למשל, מספר תאים, מסת רקמות, ריכוזי חלבונים). במקרה כזה, ארגינין משמש כסטנדרט פנימי, ודי בכימות יחסי כדי לקבל מידע רלוונטי מבחינה ביולוגית.</li>
	<li>לצורך התמיינות של SDMA ו-MMA, ליופיליזציה של הדגימות שוב כדי להיפטר מ-D2O (אם הן הושעו מחדש במאגר NMR בעבר), אשר מוחלף בדימתיל סולפוקסיד (d6-DMSO), המאפשר רזולוציה של תהודה מתיל27. לכן, לשאוף את הדגימות מן צינורות NMR עם פיפטות פסטר, lyophilize, ולהמיס אותם ב 500 μL של d6-DMSO.</li>
</ol>

<ol><li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation%2C+functions+and+clinical+relevance+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).</li>
<li>Bachand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases%3A+from+unicellular+eukaryotes+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans.</a> Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).</li>
<li>Wang, Y. C., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+conserved+protein+arginine+methyltransferases+in+non-mammalian+animal+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems.</a> FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).</li>
<li>Ahmad, A., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+PRMTs+broaden+the+scope+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).</li>
<li>Fisk, J. C., Read, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in parasitic protozoa.</a> Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).</li>
<li>Hofweber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Separation+of+FUS+Is+Suppressed+by+Its+Nuclear+Import+Receptor+and+Arginine+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation.</a> Cell. 173 (3), 706-719 (2018).</li>
<li>Chong, P. A., Vernon, R. M., Forman-Kay, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGG%2FRG+Motif+Regions+in+RNA+Binding+and+Phase+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RGG/RG Motif Regions in RNA Binding and Phase Separation.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (23), 4650-4665 (2018).</li>
<li>Nott, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transition+of+a+disordered+nuage+protein+generates+environmentally+responsive+membraneless+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles.</a> Molecular Cell. 57 (5), 936-947 (2015).</li>
<li>Fong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+RNA+splicing+catalysis+through+inhibition+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of RNA splicing catalysis through inhibition of protein arginine methylation.</a> Cancer Cell. 36 (2), 194-209 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li>
<li>Wang, S. M., Dowhan, D. H., Muscat, G. E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+arginine+methylation+in+breast+cancer%3A+emerging+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic arginine methylation in breast cancer: emerging therapeutic strategies.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 62 (3), 223-237 (2019).</li>
<li>Gulla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferase+5+has+prognostic+relevance+and+is+a+druggable+target+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferase 5 has prognostic relevance and is a druggable target in multiple myeloma.</a> Leukemia. 32 (4), 996-1002 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Tang, W. H., Cho, L., Brennan, D. M., Hazen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomic+evaluation+of+arginine+methylation+and+cardiovascular+risks%3A+potential+mechanisms+beyond+nitric+oxide+synthase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomic evaluation of arginine methylation and cardiovascular risks: potential mechanisms beyond nitric oxide synthase inhibition.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (9), 1383-1391 (2009).</li>
<li>Friesen, W. J., Massenet, S., Paushkin, S., Wyce, A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN%2C+the+product+of+the+spinal+muscular+atrophy+gene%2C+binds+preferentially+to+dimethylarginine-containing+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets.</a> Molecular Cell. 7 (5), 1111-1117 (2001).</li>
<li>Lee, J. H., Park, G. H., Lee, Y. K., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+arginine+methylation+of+organ+proteins+during+the+development+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Changes in the arginine methylation of organ proteins during the development of diabetes mellitus.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 94 (1), 111-118 (2011).</li>
<li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+methylarginine+metabolism+in+the+cardiovascular+system+identifies+the+lung+as+a+major+source+of+ADMA%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of methylarginine metabolism in the cardiovascular system identifies the lung as a major source of ADMA.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 292 (1), 18-24 (2007).</li>
<li>Zakrzewicz, D., Eickelberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+arginine+methylation+to+ADMA%3A+a+novel+mechanism+with+therapeutic+potential+in+chronic+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">From arginine methylation to ADMA: a novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases.</a> BMC Pulmonary Medicine. 9, 5(2009).</li>
<li>Fulton, M. D., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+axis+of+protein+arginine+methylation+and+asymmetric+dimethylarginine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The biological axis of protein arginine methylation and asymmetric dimethylarginine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), (2019).</li>
<li>Aliferis, K. A., Chrysayi-Tokousbalides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+pesticide+research+and+development%3A+review+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives.</a> Metabolomics. 7 (1), 35-53 (2011).</li>
<li>Chiang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT5+Is+a+Critical+Regulator+of+Breast+Cancer+Stem+Cell+Function+via+Histone+Methylation+and+FOXP1+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression.</a> Cell Reports. 21 (12), 3498-3513 (2017).</li>
<li>Blanc, R. S., Vogel, G., Chen, T., Crist, C., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT7+preserves+satellite+cell+regenerative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PRMT7 preserves satellite cell regenerative capacity.</a> Cell Reports. 14 (6), 1528-1539 (2016).</li>
<li>Lim, Y., Lee, E., Lee, J., Oh, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+asymmetric+arginine+methylation+during+replicative+and+H2O2-induced+premature+senescence+in+WI-38+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of asymmetric arginine methylation during replicative and H2O2-induced premature senescence in WI-38 human diploid fibroblasts.</a> Journal of Biochemistry. 144 (4), 523-529 (2008).</li>
<li>Bhatter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+augments+Sbp1+function+in+translation+repression+and+decapping%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation augments Sbp1 function in translation repression and decapping.</a> FEBS Journal. 286 (23), 4693-4708 (2019).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Molecular Endocrinology. 23 (4), 425-433 (2009).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein arginine methylation.</a> Cell Reports Methods. 1 (2), (2021).</li>
<li>Zinellu, A., Sotgia, S., Scanu, B., Deiana, L., Carru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-incorporated+methylated+arginine+reference+values+in+healthy+subjects+whole+blood+and+evaluation+of+factors+affecting+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-incorporated methylated arginine reference values in healthy subjects whole blood and evaluation of factors affecting protein methylation.</a> Clinical Biochemistry. 41 (14-15), 1218-1223 (2008).</li>
<li>Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J. F., Lahm, H. W., Fountoulakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+hydrolysis+method+on+the+determination+of+the+amino+acid+composition+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins.</a> Journal of Chromatography A. 795 (2), 263-275 (1998).</li>
<li>Davids, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+asymmetric+and+symmetric+dimethylarginine%2C+L-monomethylarginine%2C+L-arginine%2C+and+L-homoarginine+in+biological+samples+using+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of asymmetric and symmetric dimethylarginine, L-monomethylarginine, L-arginine, and L-homoarginine in biological samples using stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 900, 38-47 (2012).</li>
<li>Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+metabolomics+as+emerging+tool+to+study+autophagy+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation.</a> Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).</li>
<li>Vignoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+metabolomics+by+1D+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-throughput metabolomics by 1D NMR.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (4), 968-994 (2019).</li>
<li>Carr, H. Y., Purcell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diffusion+on+free+precession+in+nuclear+magnetic+resonance+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments.</a> Physical Review. 94 (3), 630-638 (1954).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+times%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times.</a> Review of Scientific Instruments. 29 (8), 688-691 (1958).</li>
<li>Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+1H+n.m.r.+spectroscopy+for+studies+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 78 (1), 99-105 (1977).</li>
<li>Stryeck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+concentrations+of+Citrate%2C+Tyrosine%2C+2-+and+3-+Hydroxybutyrate+are+associated+with+increased+3-month+mortality+in+acute+heart+failure+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6743(2019).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+landscape+of+metabolic+dysregulation+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific landscape of metabolic dysregulation during ageing.</a> Biomolecules. 11 (2), (2021).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+human+hepatocellular+tumors+undergo+a+global+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming.</a> Cancers. 13 (8), (2021).</li>
<li>Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation%3A+Cellular+functions+and+methods+of+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).</li>
<li>Habisch, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroectodermally+converted+human+mesenchymal+stromal+cells+provide+cytoprotective+effects+on+neural+stem+cells+and+inhibit+their+glial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation.</a> Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).</li>
<li>Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+ultrasensitive+luminescence+assay+for+protein+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).</li>
<li>Hevel, J. M., Price, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+direct+measurement+of+methyltransferase+activity+in+about+30min%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min.</a> Methods. 175, 3-9 (2020).</li>
<li>Altincekic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+detection+of+arginine+methylation+in+highly+repetitive+protein+motifs+of+low+sequence+complexity+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).</li>
<li>Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FUS+about+arginine+methylation+in+ALS+and+FTLD%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD.</a> The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

בחלק הבא, המוקד העיקרי הוא על השיטה עצמה; ההשלכות הביולוגיות של מתילציה של ארגינין מתוארות בחלק המבוא.
ראשית, רקמות בעלות נוקשות שונה עשויות להזדקק להתאמה של ליזה דגימה: תאים מתרבית תאים (כולל חיידקים, שמרים וכו') ורקמות כמו מוח, כבד צעיר, שריר חלק וכו', יכולים להיות הומוגניים במהירות. עבור רקמות בעלות קשיחות גבוהה (כולל כבד של נבדקים קשישים, עורקים, עצמות וכו '), ההומוגניזציה צריכה להיעשות פעמיים (ראה שלב 3.2.3). עם זאת, אין להמשיך בתהליך זה לעתים קרובות יותר, גם אם נותרו כמה שרידים בלתי מסיס...

במהלך שני העשורים האחרונים, מתילציה של שאריות ארגינין הוכרה כשינוי חיוני לאחר תרגום של חלבונים. זה משפיע על תהליכים ביולוגיים בסיסיים כמו ויסות של שעתוק, העברת אותות, ועודרבים 1. החלבונים העיקריים המעורבים בוויסות מתילציה של ארגינין הם חלבון ארגינין מתילטרנספראזות (PRMTs)2. הנגזרות העיקריות של ארגינין הן ω-(N G,N G)-דימתילארגינין אסימטרי (ADMA), ω-(N G,N'G)-דימתילארגינין סימטרי (SDMA), ו-ω-N G-מונומתילארגינין (MMA)2.
PRMTs משתמשים ב-S-אדנוזיל-l-מתיונין כדי להעביר קבוצות מתיל לקבוצת גואנידינו הטרמינלית (עם שתי קבוצות אמינו שוות ערך) של ארגינין הקשור לחלבון1. ניתן להבחין בין שני אנזימים עיקריים: אנזימים מסוג I ואנזימים מסוג II מזרזים את שלב המתילציה הראשון ליצירת MMA (ובכך מאבד את הסימטריה שלו). לאחר שלב זה, אנזימים מסוג I (לדוגמה, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) משתמשים ב-MMA כמצע ליצירת ADMA, בעוד שאנזימים מסוג II (בעיקר PRMT5 ו-PRMT9) מייצרים SDMA. PRMT1 היה החלבון הראשון ארגינין מתילטרנספראז שבודד מתאי יונקים3. עם זאת, PRMTs נשמרו אבולוציונית4 בבעלי חיים אחרים כמו בעלי חוליות שאינם יונקים, אקורדטים חסרי חוליות, אכינודרמים, פרוקי רגליים ונמטודות cnidarians5, צמחים6, ופרוטוזואה, כולל פטריות כמו שמרים7. במקרים רבים, נוקאאוט של אחד מ-PRMTs מוביל לאובדן כדאיות, וחושף את התפקיד החיוני של מיני ארגינין שעבר מתילציה המעורבים בתהליכים תאיים בסיסיים כמו שעתוק, תרגום, העברת אותות, אפופטוזיס והפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (כלומר היווצרות אברונים חסרי קרום, למשל נוקלאולי), הכוללים באופן קבוע תחומים עשירים בארגינין 8,9,10 . בתורו, זה משפיע על הפיזיולוגיה ומצבי מחלה, כולל סרטן 11,12,13, מיאלומה נפוצה14, מחלות לב וכלי דם 15, פתוגנזה ויראלית, ניוון שרירים בעמוד השדרה 16, סוכרת 17, והזדקנות1. רמות ADMA מוגברות בזרם הדם, למשל שמקורן בריאה18 עקב פירוק חלבונים, נחשבות קשורות לתפקוד לקוי של האנדותל, מחלת ריאות כרונית19 ותסמונות אחרות של מחלות לב וכלי דם20. ביטוי יתר של PRMTs נמצא כמאיץ גידולים וקשור לפרוגנוזה גרועה21,22. חוץ מזה, אבלציה של PRMT6 ו- PRMT7 מפעילה פנוטיפ הזדקנות תאי23. ירידה משמעותית ב-ADMA וב-PRMT1 נמצאה במהלך ההזדקנות של פיברובלסטיםWI-38 24.
האתגר הוא להבין כיצד מתילציה פועלת בתהליכים פיזיולוגיים (פתו) היא זיהוי וכימות מתילציה של ארגינין חלבון. רוב הגישות הנוכחיות משתמשות בנוגדנים כדי לזהות ארגינינים מתילטים. עם זאת, נוגדנים אלה הם עדיין ספציפיים להקשר ועלולים להיכשל בזיהוי מוטיבים שונים של חלבונים מתילציה ארגינין25,26. בפרוטוקול המתואר, ניתן לכמת את כל נגזרות הארגינין שהוזכרו לעיל באופן מהימן על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כלומר לבד, בשילוב, או, כמו ברוב המקרים, בתוך מטריצות ביולוגיות מורכבות כמו תאים אאוקריוטים (למשל, משמרים, עכבר או ממקור אנושי) ורקמות27, כמו גם בסרום28. עבור חלבונים ומטריצות מורכבות אלה, הידרוליזה של חלבון29 היא תנאי מוקדם ליצירת חומצות אמינו חופשיות (מותאמות), כגון ארגינין, MMA, SDMA ו- ADMA. מיצוי שלב מוצק (SPE)30 מאפשר העשרת תרכובות העניין. לבסוף, ספקטרוסקופיית H-NMR 1מאפשרת זיהוי מקביל של ארגינין וכל נגזרות המתיל העיקריות של ארגינין. ספקטרוסקופיית NMR מגיעה עם היתרון שהיא באמת כמותית, ניתנת לשחזור ברמה גבוהה, וטכניקה חזקה31,32. את מדידות התמ"א הסופיות ניתן לבצע לאחר מכן לאחר איסוף והכנת דגימות רבות. לבסוף, פרוטוקול זה מתמקד בעיקר בהכנת דגימות מכיוון שזה אינו דורש ספקטרומטר NMR משלו. זה יכול להתבצע ברוב המעבדות הביוכימיות. עם זאת, כמה רמזים על אילו מדידות ספקטרוסקופיה NMR צריך להיעשות מובאים בעבודה זו.

<table><tbody><tr><td>15 מ"ל צינורות</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimethylsilyl) חומצה פרופיונית-2,2,3,3-d4 מלח נתרן (TSP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1448</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינורות, תמיסת אמוניה תחתונה עגולה</td><td>Greiner Bio One</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אמוניה 32%</td> <td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר תמ"ג Bruker 600 מגה-הרץ, מצויד בראש בדיקה TXI</td><td>Bruker</td><td>- </td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה, בקירור, למשל 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform &ge; 99% לשנה</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr>נוזל העברת חום<td>Cryocool</td><td>Thermo Scientific</td><td>SCC1</td><td>עבור מערכת SpeedVac</td></tr><tr><td>תחמוצת דאוטריום (D2O)</td> <td>מעבדות איזוטופ קיימברידג'</td><td>DLM-10-PK</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד-d6 (d6-DMSO)</td><td>מעבדות איזוטופ קיימברידג'</td><td>DLM-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>קלסר</td><td>תא ייבוש</td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית דוראן, 13 x 100 מ"מ, GL 14, 9 מ"ל</td><td>VWR International</td><td>212-0375</td><td></td></tr><tr><td>משאבת שמן ואקום עמוק אדוארדס RV5</td><td>Thermo Scientific</td><td>16234611</td><td>חלק ממערכת SpeedVac</td></tr><tr><td>צינורות Eppendorf 1.5 מ"ל</td><td>גריינר ביו וואן</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>רובוט פיפטינג גילסון GX-241 Aspec</td><td>Gilson Inc.</td><td></td><td></td>26150008</tr><tr><td>L-ארגינין</td><td>AppliChem</td><td>A3675</td><td></td></tr><tr><td>מתנול &ge; 99%</td> <td>Roth</td><td>8388.4</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q מים aparatus</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 1 סמ"ק/30 מ"ג, 1 מ"ל מחסניות</td><td>מים</td><td>186000252</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Lonza</td><td></td> <td>LONBE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 רקמות הומוגנייזר</td><td>ברטין מכשירים</td><td>P000669-PR240-A https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/</td><td></td></tr> <tr><td>צינורות Precellys (צינורות עיסת)</td><td>VWR International</td><td>432-0351</td><td></td></tr><tr><td>Precellyse 1.4 מ"מ חרוזי תחמוצת זירקוניום</td><td>VWR International</td><td>432-0356</td><td></td></tr><tr><td>Reacti-Therm/ReactiVap מודולי חימום, ערבוב ואידוי</td><td>תרמו Scientific</td><td>TS-18820</td><td>רוטור https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820</td></tr><tr><td>לצינורות 1.5 מ"ל, FA-45-30-11</td><td>Eppendorf</td><td>5427753001</td><td></td></tr><tr><td>Savant מלכודת קירור בקירור</td><td>Thermo Scientific</td><td>15996161</td><td>חלק ממערכת SpeedVac</td></tr><tr><td>רכז ואקום Savant SpeedVac SPD210</td><td>Thermo Scientific</td><td>15906181</td><td>חלק ממערכת SpeedVac; מצויד עם רוטור לצינורות 1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>מכסי בורג לבקבוקוני זכוכית עם איטום PTFE, DN9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>CT11B3011</td><td></td></tr><tr><td>Seasand</td><td>Roth</td><td>8441.3</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית עם חוט קצר 1.5 מ"ל, ND9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>VT1100309</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד (NaN3)</td> <td>Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>VWR</td><td>BDH7363-4</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>80731-078</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 4.0 (תוכנה)</td><td>Bruker-https://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&-NG-דימתילארגינין אסימטרי (ADMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-208093</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-monomethylarginine (MMA)</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-200739A</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-NG'-דימתילארגינין סימטרי (SDMA)</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-202235A</td><td></td></tr></tbody></table>

חקר ארגינין מתילום על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

ארגינין הקשור לחלבון עובר מתילציה בדרך כלל בחלבונים רבים ומווסת את תפקודם על ידי שינוי התכונות הפיזיקוכימיות, האינטראקציה שלהם עם מולקולות אחרות, כולל חלבונים אחרים או חומצות גרעין. עבודה זו מציגה פרוטוקול קל ליישום לכימות ארגינין ונגזרותיו, כולל דימתילארגינין אסימטרי וסימטרי (ADMA ו-SDMA, בהתאמה) ומונומתיל ארגינין (MMA). לאחר בידוד חלבונים מנוזלי גוף ביולוגיים, רקמות או ליזטים של תאים, מתוארת שיטה פשוטה להומוגניזציה, משקעים של חלבונים והידרוליזה של חלבונים. מאחר שההידרוליזות מכילות רכיבים רבים אחרים, כגון חומצות אמינו אחרות, שומנים וחומצות גרעין, שלב טיהור באמצעות מיצוי בשלב מוצק (SPE) הוא חיוני. SPE יכול להתבצע באופן ידני באמצעות צנטריפוגות או רובוט pipetting. הרגישות ל-ADMA בפרוטוקול הנוכחי היא כ-100nmol/L. הגבול העליון של גילוי ארגינין הוא 3 mmol / L עקב רוויה SPE. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה, המשתרעת מהכנת דגימות ביולוגיות לזיהוי מבוסס NMR, ומספקת רמזים ומלכודות יקרי ערך לעבודה מוצלחת בעת לימוד מתילום ארגינין.

באופן שגרתי, תחזיות1 H 1D של ספקטרום NMR דו-ממדי J-resolved (JRES), כמעט מנותק, משמשות למשימות שיא וכימות במעבדה36 שלנו. איור 3 מראה ספקטרום JRES מייצג של הידרוליזה של חלבון שמרים מטוהרים באמצעות פרוטוקול SPE הנוכחי. אם כי בריכוזים שונים מאוד, ניתן להפריד ולכמת את שני החומרים במטריצה תאית. בהתבסס על מספר הפרוטונים של קבוצת המתיל הספציפית (-CH3) או מתילן (-CH2-) בשינוי הכימי המתאים, ספקטרוסקופיית H-NMR 1מאפשרת כימות מדויק. כפ...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ומדידה כמותית של ארגינין חופשי וקשור לחלבון ומתיל-ארגינינים על ידי ספקטרוסקופיית H-NMR 1.

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

פרוטוקול זה מאפשר לכמת רמות ודינמיקה של מתילציה של ארגינין. שינוי זה ממלא תפקידים רגולטוריים חשובים ויכול לשמש סמן ביולוגי למחלות. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מספקת זרימת עבודה פשוטה למספר כמעט בלתי מוגבל של מטריצות החל תאים, מדיה, לרקמות ונוזלים ביולוגיים.מתילציה של ארגינין מוגברת בסוגי סרטן רבים בבני אדם והמעכבים הראשונים של טרנספראזות שיטת ארגינין נבדקים בניסויים קליניים. שיטה זו יכולה לסייע בריבוד החולים ובהערכת הסיכונים. מי שידגים את ההליך יהיה הנסיורג האביש, טכנאי מחקר מהמעבדה שלי.עבור דגימות נוזליות, להוסיף 400 מיקרוליטר של מתנול קר כקרח ל 200 מיקרוליטר של הדגימה ולאחר מכן דגירה במשך 30 דקות במינוס 20 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה מדגם זה ב 10, 000 גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הזיזו את הסופרנאטנט ואספו את הגלולה בצינורות של 1.5 מיליליטר.עבור חומרים מוצקים, יש להוסיף 600 מיקרוליטר של 66% מתנול מים לצינורות עיסה המכילים 30 עד 60 מיליגרם של רקמה או כדורי תאים. הומוגניזציה של הרקמה הרכה פעם אחת למשך 20 שניות ושל הרקמה הנוקשה פעמיים למשך 20 שניות עם מרווח של חמש דקות ביניהם. מניחים מיד את הדגימה על קרח ומעבירים את כל הליזט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר, ואחריו דגירה.לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב 10, 000 G במשך 30 דקות. בארבע מעלות צלזיוס, בחר את הסופרנאטנט בצינורות של 1.5 מיליליטר והמשך עם הידרוליזה של חלבון באמצעות סופרנטנט זה. חותכים את המכסות של כל צינור.לאחר מכן להוסיף 500 מיקרוליטר של תשע חומצה הידרוכלורית מולרית לכל דגימה. לבסוף, הכניסו את הצינורות לצינורות זכוכית. סגרו אותם היטב עם מכסים, כדי להבטיח איטום מתאים, והניחו את הצינורות הללו בתוך זכוכית מלאה חלקית בחול.הידרוליזה של הדגימות במשך 16 שעות בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס בתא ייבוש. מצננים את הדגימות ומבצעים להן ליופיליזציה למשך הלילה באמצעות צנטריפוגת ואקום גבוהה. למחרת, ממיסים כדורים מיובשים לחלוטין במיליליטר אחד של 0.1 חומצה הידרוכלורית מולרית.הוסף 50 מיקרוליטר כלורופורם לכל צינור והמיס היטב את הגלולה באמצעות פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר. מעבירים את הנפח המלא לצינור חדש וצנטריפוגות את הדגימות למשך 10 דקות. בזהירות לאסוף את השלב העליון של נוזל biphasic בצינור חדש.השתמש בצינורות פלסטיק למיצוי ידני או צינורות זכוכית לחילוץ פאזה מוצקה רובוטית. לחילוץ ידני בפאזה מוצקה, התנה מראש את המחסניות בכל הפעלה ולאחר מכן צנטריפוגה בת דקה. לאחר מכן, טען את הדגימה על מחסניות SPE וצנטריפוגר אותם ב 600 G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.שטפו את המחסניות במיליליטר מים שלוש פעמים, כל שטיפה ואחריה צנטריפוגה למשך דקה. לאחר מכן לשטוף חמש פעמים עם מיליליטר אחד של 0.1 חומצה הידרוכלורית מולרית, ואחריו צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 800 גרם בטמפרטורת החדר. שטפו את המחסניות פעמיים עם מיליליטר אחד של מתנול ואחריו צנטריפוגה במשך דקה אחת.Elute arginine ונגזרותיו לתוך צינור 15 מיליליטר יחיד על ידי הוספת מיליליטר אחד של שלושה X פתרון חלופי צנטריפוגה פעמיים במשך דקה אחת. למיצוי פאזה מוצקה רובוטית, הניחו את הצינורות לאיסוף האלוטים ואת צינורות הזכוכית המכילים את השלב העליון של הנוזל הדו-פאזי למיקום המתאים של הרובוט. השתמש ביישום או בשיטה בתוכנה בהתבסס על השלבים המתוארים עבור SPE ידני.Lyophilize הדגימות לילה להתייבש לחלוטין כדי להיפטר אמוניה ומים. ממיסים כל דגימה ב-500 מיקרוליטר של מאגר NMR עד שהיא הופכת הומוגנית. לאחר מכן העבירו כמות שווה של דגימה הומוגנית לכל צינור NMR.ספקטרום J-RES של הידרוליזה של חלבון שמרים מטוהרים באמצעות פרוטוקול SPE מוצגים כאן. שינויים כימיים אופייניים שונים יכולים להבחין בין L-ארגינין ו-ADMA ב-3.25 ו-3.02 חלקים למיליון. ניתן להפריד ולכמת את שני החומרים במטריצה תאית.בהתבסס על מספר הפרוטונים של קבוצת המתיל או המתילן הספציפית בשינוי הכימי המתאים, ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית H אחת מאפשרת כימות מדויק. באמצעות גישה זו, ניתן להפריד ולכמת את השינויים הכימיים בתהודה מגנטית גרעינית H של SDMA ו-MMA על ידי שינויים כימיים אופייניים ב-2.76 חלקים למיליון SDMA ו-2.74 חלקים למיליון MMA. בעת ביצוע פרוטוקול זה, לאסוף בזהירות את השלב העליון של נוזל biphasic המכיל את החלק מסיס במים עם פיפטה ולהעביר אותו צינורות חדשים.השתמש בצינורות 1.5 מיליליטר עבור SPE ידני או זכוכית מחלקה עבור SPE רובוטי. יש להימנע מזליגה על הכלורופורם ותכולתו. האלואטים המכילים ארגינין ומיני הארגינין שעברו מתילציה מנותחים באמצעות ספקטרוסקופיית NMR.זה מניב כמויות מוחלטות של מינים אלה. הטכנולוגיה שלנו משמשת כיום בשפע של פרויקטים מחקריים בסיסיים שמטרתם לנתח את התפקיד הפתופיזיולוגי של מתילציה של ארגינין. יתר על כן, אנו מעריכים מתילציה של חלבון ארגינין כסמן ביולוגי מועמד במספר מחלות אנושיות.

exploring-arginine-methylome-nuclear-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מתוארות שתי שיטות להקצאת אותות התהודה המגנטית הגרעינית של α ו-ε-dimethylamine של ליזין N-terminal 13C-methylated. שיטה אחת משתמשת בסלקטיביות הנגרמת על ידי pH של תגובת המתילציה הרדוקטיבית, והשנייה משתמשת באמינופפטידאז כדי להסיר באופן סלקטיבי את הליזין הטרמינלי N.

שיטות לזיהוי תהודת ה-NMR של 13C-dimethyl N-terminal אמין על חלבונים שעברו מתילציה רדוקטיבית

מתילציה ארגינין חלבון, מזורז על ידי כיתה של אנזימים דהינו., מתיל ארגינין חלבון transferases (PRMTs), הוא התהליך של בנוסף האנזימטית של קבוצה מתיל (ים) לarginines בתוך חלבונים. במבחנה assay מתילציה הוא הכלי האמין ביותר להערכת מצב מתילציה של מצעי PRMT ידועים או רומן.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

ניתן להשתמש במערכי פפטידים המסונתזים בשיטת SPOT כדי לנתח את ספציפיות הסובסטרט של חלבון ליזין מתילטרנספראזות (PKMTs) ולהגדיר את ספקטרום הסובסטרט של PKMTs כדי להבין את תפקידם הביולוגי. פרוטוקול זה מתאר כיצד לסנתז מערכי פפטידים, לבצע מתילציה שלהם עם PKMTs ולנתח את התוצאות.

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

DNA מתילציה מסוגלת לשמור על רמות יציבות של ביטוי גנים וכן לאפשר שינויים דינמיים בביטוי גנים בתגובה למגוון גירויים. אנו מפרטים טכניקות המאפשרות לחקור שינויים ספציפיים לגנים במתילציה של DNA ואת ההשפעה של שינויים אלה על ביטוי גנים.

התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

פרוטוקול זה מתאר את הכינון מחדש של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. במקביל, סימטרית שלאחר translationally נוקלאוזום שונה יכול להיווצר לאחר שימוש בעותק היסטון premodified. תכשירים אלה יכולים לשמש בקלות ללמוד מנגנוני crosstalk השינוי, בו זמנית משני ההיסטונים אחותו, באמצעות ספקטרוסקופיית NMR ברזולוציה גבוהה.

כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

פרוטוקולים אלה מספקים את המתודולוגיה המשמשת להערכת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMT) בתאים. הנחיות מפורטות על הערכת פעילות PRMT באמצעות סמנים ביולוגיים אנדוגני אקסוגני, מתיל ארגינין זיהוי נוגדנים, ותרכובות כלי מעכב מתוארים.

שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים

כאן אנו מציגים פרוטוקול המפרט רכישה, עיבוד וניתוח של סדרת ניסויי NMR שמטרתם לאפיין אינטראקציות חלבון-גליקן בתמיסה. מתוארות רוב המתודולוגיות הנפוצות המבוססות על ליגנדות וחלבונים, אשר ללא ספק תורמות לתחומי הגליקוביולוגיה המבנית ומחקרי הזיהוי המולקולרי.

התרת אינטראקציות גליקן-חלבון: תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להצלה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת רמות m⁶A גלובליות באופן חצי-כמותי באמצעות נקודת כתם נקודות. ה-RNA הכולל מופק, מנותק, מנוקד על ממברנת ניילון, נבדק בנוגדן אנטי-m⁶A, ומוצג באמצעות כימילומינסנציה. עוצמת האות, שנמדדה על ידי ניתוח גווני אפור של ImageJ, משקפת שפע מתילציה יחסי, ומספקת זרימת עבודה ניתנת לשחזור למחקר.

בדיקת נקודת כתם לזיהוי רמות שינוי RNA גלובליות של N 6-מתילאדנוזין

קיטוב גרעיני דינמי עם פירוק הדגימה שלאחר מכן איפשר מחקרים בזמן אמת של חילוף חומרים במערכות ביולוגיות. היפרפולריזציה [1-13C] פירובט שימשה לחקר פעילות לקטט דהידרוגנאז בקו תאי קרצינומה של הערמונית במבחנה.

Hyperpolarized 13 ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית מטבולית C והדמיה

חקור כימות מתילציה ארגינין בדגימות ביולוגיות מגוונות באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית. שיטה זו מאפשרת הערכת סיכון וסיווג חולים במחקר סרטן ומחלות נוספות.

חקר ארגינין מתילום על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית

גלה סרטונים נוספים