מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים
March 1st, 2022
מתן אוראלי של dsRNA המיוצר על ידי חיידקים, שיטת אספקה להפרעות RNA (RNAi) המשמשת באופן שגרתי ב - Caenorhabditis elegans, יושם כאן בהצלחה על יתושים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת מחקרים חזקים בגנטיקה הפוכה ומחקרי וקטורים חוסמי העברה ללא שימוש בהזרקה.
הפרעת RNA היא אחד הכלים העיקריים המשמשים לגנטיקה הפוכה אצל יתושים ולידה דרך הפה מאפשרת לנו לגרום ולשמור על השתקת גנים אצל יתושים בוגרים ללא צורך בהזרקה זעירה. אספקה דרך הפה של RNA דו-גדילי ליתושים בוגרים היא שיטת הפרעת RNA זולה ורב-תכליתית המפחיתה באופן משמעותי את העבודה ואת הזמן והמאמץ לחקר תפקוד הגנים. שיטה זו יכולה לשמש לחקר לא רק גנים מטרה אחרים באנופלס גמביה, אלא גם באנופלסים אחרים בעלי עניין כגון אנופלס לבינאמוס.
כדי להתחיל, לגדל תרבית ממושבת חיידקים אחת של זן Escherichia coli HT115(DE3) המכילה את הרנ"א הדו-גדילי המבטא פלסמיד בחמישה מיליליטרים של ליברות המכילות אמפיצילין וטטרציקלין על שייקר פלטפורמה במשך 12 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד. לאחר 12 שעות, יש ליטול 0.5 מיליליטר מתרבית החיידקים שגדלה במהלך הלילה ולבצע דילול אחד ל-1000 במדיית טריפטון של 2X שמרים המכילה אמפיצילין וטטרציקלין. כדי לגרום לייצור RNA דו-גדילי, הוסיפו IPDG בריכוז הסופי של 40 מיקרומולר.
לאחר מכן הדגירו את התרבות במשך שעתיים בתנאי טלטול כפי שהוכח. בסוף הדגירה כאשר הצפיפות האופטית של התרבית מגיעה ל-0.4 ב-600 ננומטר, מזרים את תאי החיידקים על ידי צנטרפיקציה ב-4, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ואז שוטפים את התאים בנפח אחד של PBS. לאחר שסובבו את התאים פעם נוספת, החיזרו את התאים ב-PBS ודגרו בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
לאחר שהחום הורג את החיידקים, מכינים אליקוטים בנפח של 400 מיקרוליטר ומאחסנים אותם בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. ערבבו 400 אליקוטים של מיקרוליטר אחד של חיידקים מוכי הפשרה הורגים בחום המבטאים רנ"א דו-גדילי עם 1.6 מיליליטרים של תמיסת סוכר של 12% המכילה 0.2% מתילפרבן. משרים כדור צמר גפן קטן בתמיסה זו ומניחים אותו בתוך כלוב המכיל יתושים בני חמישה ימים ומבטיחים שהיתושים ניזונים מתמיסה זו.
החליפו את כדור הצמר גפן ספוג בתמיסת סוכר RNA דו-גדילית כל יומיים במשך שמונה ימים רצופים, והבטיחו שהכלוב נשמר בתנאים קבועים. כדי להרדים את היתושים בקור, מניחים את המיכל על הקרח עד שהיתושים מפסיקים לזוז, ואז מניחים את היתושים על משטח קר כדי לבודד את הנקבות לנתיחה. לאחר ריסוס היתושים באתנול, הניחו אותם על משטח זכוכית עם PBS.
עם זוג מלקחיים, מאבטחים את ראש היתוש ומושכים את בית החזה לאט מאוד ומאפשרים לבלוטות הרוק להשתחרר ל- PBS. לאחר שבלוטות הרוק מנותחות מ -10 יתושים, משכו את הבלוטות להפקת RNA. עם השלמת מיצוי הרנ"א, השעו את כדור הרנ"א ב-30 מיקרוליטרים של מים חופשיים מ-RNA.
מדוד את הספיגה וחשב את ריכוז הרנ"א כמתואר בכתב היד של הטקסט. באמצעות ערכת שעתוק הפוכה מסחרית, סינתזו cDNA ממיקרוגרם אחד של RNA. דיללו את ה-cDNA 10 פעמים והגדירו את תגובות ה-RTPCR בטריפליקטים לגנים של מטרה וניקיון בית בהתאם להמלצות היצרן.
הגבר את ה- CDNA עם תנאי PCR סטנדרטיים בזמן אמת. כדי להעריך את היכולת להאכיל בדם, הניחו קבוצות של 15 נקבות יתושים שטופלו במטרה ובדקו רנ"א דו-גדילי בכלובים קטנים והרעיבו אותם במשך ארבע שעות. ספקו דם זול מדפיבריל ליתושים באמצעות אמבט מים במחזור שנקבע ל-37 מעלות צלזיוס, מאכילי יתושי זכוכית וממברנת מילוי פרי.
שימו לב, ספרו ותיעדו את מספר ניסיונות הבדיקה להשיג בהצלחה ארוחת דם מחמש הנקבות הראשונות כדי להסתבך באופן מלא בכל קבוצה. לאחר בידוד רקמות טריות ו- PBS הוכיח בעבר, תקן אותו באצטון קר כקרח למשך 90 שניות. לאחר מכן לשטוף את הרקמה מספר פעמים ב- PBS ולדגום עם נוגדנים ראשוניים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם אנטי סרום מדולל ב- PBS.
בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמה מספר פעמים עם PBS. מוסיפים נוגדנים משניים פלואורסצנטיים המדוללים ב-PBS, ודוגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. מוסיפים כל כתם נגדי 30 דקות לפני תום הדגירה של שעתיים.
לאחר שעתיים, לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם PBS, ולאחר מכן להרכיב את הרקמות ב 100% גליצרול על מגלשת מיקרוסקופ סטנדרטית עם כיסוי בעובי 1 מילימטר אחד להחליק ולאחסן ב 20 מעלות צלזיוס עד ההדמיה. נתוני ביטוי המיקרו-אריי הראו שהביטוי של כל הגנים שנבחרו בבלוטות הרוק הבוגרות ורמות ה-AAPP והמרווה היו גבוהות במיוחד. הרנ"א הדו-גדילי הפחית למעשה את שפע תעתיקי ראש המזלג בבלוטת הרוק.
היתושים שניזונו מיתושים בעלי רנ"א דו-גדילי עם ראש המזלג הציגו פי חמישה יותר ניסיונות האכלה מאשר קבוצת הביקורת או FEG דו-תאי מין דו-גדילי RNA שניזונו מיתושים כדי להיות מלאים בדם. רמות המרווה והכתמת ה-CrebA הופחתו במידה ניכרת בכל אונות בלוטת הרוק בעקבות הפרעה ל-RNA של ראש המזלג בהשוואה להפרעות RNA לבקרת נמלים. כאשר בוחנים חלבונים רבים המרכיבים את הרוק, רמות ה-AAPP הופחתו בכל שלוש אונות בלוטת הרוק בעקבות הפרעה ל-RNA ראש מזלג בהשוואה לטיפול בהפרעות RNA מבוקרות.
מצד שני, לא נצפו שינויים ברמות המוצין. נתונים אלה מצביעים על כך שראש המזלג תורם באופן שונה לביטוי של גנים שונים של חלבוני רוק. פלואורסצנציה מופחתת של Rab11 נצפתה באונות צידיות דיסטליות בעקבות טיפול בהפרעה ל-RNA של ראש מזלג, אולם גם אות Rab11 מוגבר באונות הצידיות המדיאליות והפרוקסימליות התרחש.
לא נצפה הבדל ניכר באות האדום של הנילוס לאחר הפרעת RNA של ראש המזלג בהשוואה לטיפול בהפרעות RNA בקרה. תגובת מכונת מזכירה כלשהי באופן מורכב השונה בין אונות בלוטת הרוק. טכניקה זו יכולה לאפשר לחוקרים להשתיק גנים שעבורם ניתן להפחית את הביטוי על ידי זריקה אחת של RNA דו-גדילי ולחקור אספקה דרך הפה של RNA דו-גדילי כדי להשתמש ב-RNAi כשיטת בקרה וקטורית פוטנציאלית.
סקירה
מחקר זה מדגים שיטה חדשה למסירת RNA בעל שרשרת כפולה (dsRNA) דרך הפה ליתושים בוגרים, המאפשרת התערבות RNA (RNAi) ללא זריקות. גישה זו מאפשרת גנטיקה הפוכה ומחקרים על וקטורים ביעילות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- ביולוגיה של וקטורים
רקע
- התערבות RNA היא כלי קריטי להשתקה של גנים ביתושים.
- שיטות מסורתיות לרוב דורשות מיקרו-זריקות, שהן עתירות עבודה.
- מסירת RNA בעל שרשרת כפולה דרך הפה מציגה אלטרנטיבה חסכונית.
- שיטה זו ניתנת ליישום על מיני Anopheles שונים.
מטרת המחקר
- לבסס מערכת מסירה דרך הפה אמינה עבור RNA בעל שרשרת כפולה ביתושים בוגרים.
- להעריך את האפקטיביות של השיטה להשתקה של גנים.
- לחקור את ההשפעה של השתקת גנים על התנהגות האכילה של היתושים.
שיטות ששימשו
- תרבית של Escherichia coli המבטאת RNA בעל שרשרת כפולה.
- הכנת RNA בעל שרשרת כפולה ומסירתו באמצעות תמיסת סוכר.
- ניתוח בלוטות הרוק לצורך מיצוי RNA וניתוח.
- PCR בזמן אמת להערכת שינויים בביטוי הגנים.
תוצאות עיקריות
- הושגה השתקה מוצלחת של גנים ביתושים בוגרים.
- ניסיונות האכילה גדלו משמעותית ביתושים שטופלו ב-dsRNA של fork head.
- רמות הביטוי של חלבוני רוק ספציפיים השתנו לאחר הטיפול.
- תגובות שונות נצפו באונה הבלוטתית של הרוק לאחר RNAi.
מסקנות
- שיטת המסירה דרך הפה יעילה להתערבות RNA ביתושים.
- טכניקה זו מפשטת את המחקר על תפקוד הגנים בביולוגיה של וקטורים.
- מחקר נוסף יכול להרחיב את יישומה למיני יתושים אחרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Oral RNAi administration in adult Anopheles gambiae enables scalable, non-invasive gene silencing for vector biology and reverse genetics. This approach reduces operational complexity and supports high-throughput target validation in insect models relevant to vector-borne disease research. The method enhances predictive confidence in gene function studies, facilitating risk-adjusted decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of gene function in adult mosquito models.
- Supports biological de-risking by clarifying gene roles in vector physiology.
- Facilitates functional target validation for vector control strategies.
- Improves predictive confidence for downstream genetic interventions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated mosquito systems for compound or genetic screening workflows.
- Standardizes gene knockdown protocols for reproducibility across studies.
- Generates quantitative outputs via qRT-PCR and immunofluorescence readouts.
- Enables scalable, low-cost screening of gene targets in vector species.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene silencing outputs with disease-relevant vector biology endpoints.
- Supports continuity from genetic discovery to preclinical vector control validation.
- Provides mechanistic de-risking for candidate gene targets in translational pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This oral RNAi method integrates into the early discovery-to-lead identification continuum for vector biology and gene function studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in adult mosquito models.
- Screening: Delivers reproducible gene knockdown and quantitative phenotypic outputs for assay development.
- Analytics: Provides qRT-PCR and immunofluorescence data to compare gene expression and protein levels.
- Translational Research: Connects gene function insights to vector control strategies when supported by phenotypic outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform for gene silencing across multiple vector species and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardizes and simplifies gene silencing workflows for high-throughput applications.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency in vector biology research.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of gene targets for vector control and functional genomics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling and molecular biology techniques.
- Needs access to bacterial culture, qRT-PCR, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of dsRNA production and delivery protocols.
- Adaptation may be needed for different mosquito species or gene targets.
- Practical limitations include gene-specific knockdown efficiency and phenotypic variability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:45
Preparation of Heat-Killed Bacteria Expressing Double-Stranded RNA (dsRNA)
2:09
Feeding Mosquitoes with Heat-Killed Bacteria Expressing dsRNA
2:47
Assay Target Gene Expression Levels
3:59
Phenotypic Evaluation: Successful Blood-Feeding
4:35
Phenotypic Evaluation: Salivary Gland Morphology and Down-Regulation of Relevant Proteins
5:30
Results: The Effects of fkh Knockdown in Adult Anopheles gambiae Salivary Glands
7:17
Conclusion
