תסיסה מבוקרת אור לייצור כימיקלים וחלבון מיקרוביאליים
22 במרץ 2022
שליטה אופטוגנטית בחילוף החומרים המיקרוביאלי מציעה שליטה דינמית גמישה על תהליכי תסיסה. הפרוטוקול כאן מראה כיצד להגדיר תסיסה מווסתת אור כחול לייצור כימי וחלבון בקנה מידה נפחי שונה.
אופטוגנטיקה שימשה להשגת טיטרים גבוהים יותר של מספר כימיקלים וחלבונים בהשוואה ממריצים טיפוסיים. באמצעות פרוטוקול זה, אחרים יכולים לשפר את התהליכים שלהם באמצעות שליטה מבוססת אור. בקרת אופטוגנטיקה אינה פולשנית, מכווננת מאוד והפכה.
תכונות אלה מאפשרות אופטימיזציה יעילה של תהליכים מיקרוביאליים ואפילו פותחות הזדמנויות ייחודיות, כמו תסיסה תלת-פאזית ושליטה רב-כרומטית. עבור כל חומר כימי חדש, תנאי האור האופטימליים יהיו שונים. אז אם ייצור נמוך הוא ציין באמצעות הפרמטרים בפרוטוקול זה, תנאי אור שונים צריך להיבדק.
התחל על ידי קבלת זן cerevisiae Saccharomyces עם HIS3 אוקסיטרופיה, סמן הדרוש עבור Plasmids OptoINVRT. אם אתם מבקשים לשלוט בגן שמקורו בסכרומיצ'ס סרביסיה, ודאו שהעותק האנדוגני של הגן נמחק לפני שתמשיך. כדי להתחיל בבניית המתח, ליניארי את הפלסמיד המכיל את מעגל OptoINVRT7, כגון EZL439.
אם משתמשים ב- EZL439, המכיל את הרכיבים כדי להדחיק את מקדם PIGA אחד באור ולהפעיל אותו בחושך, ליניארי באתר ההגבלה Pme1. באמצעות שיטות טרנספורמציה סטנדרטיות של ליתיום אצטט, שלבו את הפלסמיד בזן עזר HIS3. לאחר השינוי, צנטריפוגה התאים ב 150 G של לדקה אחת.
בעדינות לשפץ את התאים ב 200 microliters של מדיום SC-HIS טרי. צלחת את כל נפח התא על צלחת אגר SC-HIS ודגור ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים עד שלושה ימים עד מושבות מופיעות. הכן תאים מוסמכים באמצעות פרוטוקולי טרנספורמציה סטנדרטיים של ליתיום אצטט.
שנה את התאים עם הפלסמיד המכיל את הגנים שברצונך לשלוט בהם באופן אופטוגנטי במורד הזרם של מקדמי PIGA1M או PIGA1S. לאחר הטרנספורמציה, צנטריפוגה של התרבות ב 150 G של במשך דקה אחת בעדינות resuspened גלולה התא ב 200 מיקרוליטרים של מדיום נשירה SC טרי. צלחת את כל נפח התא על צלחת אגר פפטון דקסטרוז תמצית שמרים, אם משתלב באתרי דלתא או צלחת נשירה SC אם להפוך עם plasmid המכיל סמן בחירה.
לדגור על התאים ב 30 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות תחת אור כחול מתמיד כדי לשמור על הגן נשלט אופטוגנטית מודחק. השתמש בכל מקור אור של אורך הגל של 465 ננומטר ומקם לוח LED כ 40 ס"מ מעל הלוח, כך עוצמת האור היא כ 80 עד 110 מיקרומולה למ"ר לשנייה. מדוד את העוצמה באמצעות מד קוונטי.
אם משתלבים באתרי דלתא, לשכפל את הצלחת על לוחות פפטון דקסטרוז תמצית שמרים המכילים מגוון של ריכוזי Zeocin בין 400 מיקרוגרם למיליליטר ו 1, 200 מיקרוגרם למיליליטר כדי לבחור עבור מגוון רחב של מספרי עותק שילוב. דגירה על לוחות העתק ב 30 מעלות צלזיוס תחת אור כחול קבוע או פועם במשך יומיים עד שלושה ימים עד המושבות מופיעות. כדי לבצע את ההקרנה הראשונית, בחר שמונה מושבות מכל צלחת ולהשתמש בהם כדי לחסן מיליליטר אחד של SC-HIS מדיום בתוספת 2% גלוקוז בארות בודדות של צלחת 24 היטב.
לגדל את התאים בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס רועד ב 200 סיבובים לדקה תחת תאורת אור כחול מתמדת. למחרת, לדלל כל תרבות במדיום SC-HIS טרי עם 2% גלוקוז כדי להשיג את ערכי הצפיפות האופטית הנעים בין 0.01 ל 0.3 ב 600 ננומטר ולגדל את התרביות במצב רועד 200 סיבובים לדקה תחת אור קבוע או פועם ב 30 מעלות צלזיוס עד הצפיפות האופטית מגיעה בין שתיים לתשע. לאחר מכן, לעטוף את הצלחות עם רדיד אלומיניום, לכבות את הלוחות האור, ולדגור את הצלחות בחושך במשך ארבע שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם 200 סיבובים לדקה.
צנטריפוגה תרביות בצלחת 24 היטב ב 234 G של במשך חמש דקות ו resuspend תאים במיליליטר אחד של מדיום נשירה מלאה סינטטי טרי עם 2% גלוקוז. לאטום את הצלחות כדי למנוע אידוי של המוצר הרצוי באמצעות סרט איטום מיקרופלסטי סטרילי. תסיסה את הלוחות האטומים בחושך במשך 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס רועד ב 200 סיבובים לדקה.
כדי לקצור את התסיסות, צנטריפוגות הלוחות במשך חמש דקות ב 234 G של ולהעביר 800 microliters של supernatant לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. בהתאם כימי של עניין, לנתח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, ספקטרומטר מסה כרומטוגרפיה גז, או שיטה אנליטית אחרת באמצעות טכניקת הכנת מדגם המתאים ביותר עבור המכשיר המשמש. בחר שמונה מושבות מכל צלחת ולהשתמש בהם כדי לחסן מיליליטר אחד של SC-HIS מדיום עם 2% גלוקוז בארות בודדות של צלחת 24 היטב.
לגדל את התאים בן לילה בחושך ב 30 מעלות צלזיוס עם 200 סיבובים לדקה רועד. למחרת בבוקר, לדלל כל תרבות במדיום SC-HIS טרי עם 2% גלוקוז עד 0.1 צפיפות אופטית. לעטוף את הלוחות בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור ולהגדיל את התרבות בחושך ב 30 מעלות צלזיוס עם 200 סיבובים לדקה רועדים עד שהם מגיעים לצפיפות אופטית של שלוש.
לאחר מכן, לדגור על הצלחות תחת אור פועם במשך 12 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם 200 סיבובים לדקה רועד. צנטריפוגות התרביות ב 234 G של במשך חמש דקות ו resuspend במדיום SC-HIS טרי עם 2% גלוקוז. לאטום את הצלחות כדי למנוע אידוי של המוצר הרצוי באמצעות סרט איטום מיקרופלסטי סטרילי.
תסיסה את הלוחות האטומים באור במשך 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס רועד ב 200 סיבובים לדקה. לאחר ביצוע תסיסה אופטוגנטית, הייצור הכימי נבדק במגוון של צפיפות תאים בזמן אינדוקציה עם שני מעגלים. מעגל OptoINVRT7 הדגים טיטרים גבוהים של חומצה לקטית ואיזובוטנול עם צפיפות תאים אופטימלית של ערך אינדוקציה של 7.0 ו 8.75 בהשוואה למעגלים OptoINVRT1 ו -2.
תסיסה באמצעות מעגלי OptoAMP נחקרו בשלושה שלבים שהוגדרו על ידי מחזורי חובת אור שונים. ייצור חומצה לקטית יכול להיות ממוטב באמצעות שלב צמיחה פעמו ושלבי אינדוקציה וייצור מוארים במלואם. ייצור Isobutanol היה אופטימיזציה באמצעות שלב צמיחה פעמו, שלב אינדוקציה מואר במלואו, ושלב הייצור פעמו.
בעוד הביוסינתזה naringenin היה אופטימלי בצורה הטובה ביותר באמצעות צמיחה פועמת אינדוקציה מוארת במלואה ושלב ייצור כהה. מערכת OptoLAC שימשה E.Coli כדי לייצר FDER גורם שעתוק ב titers כי הם דומים או גבוהים יותר מאלה שהושגו באמצעות אינדוקציה כימית עם IPDG. מעגלי OptoLAC הוחלו כדי לייצר mevalonate והייצור חורג titers מושגת באמצעות אינדוקציה IPDG.
ייצור Mevalonate ברמת הביו-ריאקטור מדגים את המדרגיות והטונה של ויסות אופטוגנטי לייצור כימי וחלבון בחיידקים מעבר לרמות המיקרו-פלטה. חשוב לוודא שעוצמת האור נמצאת בטווח הנכון לצעדים המוארים ושזיהום האור נמנע לצעדים הדורשים חושך. טכניקה זו סללה את הדרך להשגת שיא titers של isobutanol בשמרים, אוכלוסיות קונסורציום ייצוב עם אור, ואפילו לשלוט שטף מטבולי באמצעות אברונים מבוקרי אור סינתטי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
בקרה אופטוגנטית של מטבוליזם מיקרוביאלי מאפשרת ויסות דינמי של תהליכי תסיסה, ובכך משפרת את הייצור של כימיקלים וחלבונים. פרוטוקול זה מדגים את הקמתן של תסיסות המנוהלות באמצעות אור כחול בסדרי גודל נפחיים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מטבוליזם מיקרוביאלי
- אופטוגנטיקה
- תהליכי תסיסה
רקע
- אופטוגנטיקה מאפשרת שליטה לא פולשנית בתהליכים מיקרוביאליים.
- בקרה מבוססת אור היא ניתנת לכיוונון רב ולהפיכה.
- גישה זו יכולה למטב באופן משמעותי תהליכי תסיסה.
- הזדמנויות ייחודיות נוצרות, כגון תסיסות תלת-מופעיים.
מטרת המחקר
- להגביר את ייצור כימיקלים וחלבונים באמצעות שיטות אופטוגנטיות.
- לספק פרוטוקול לתסיסות המווסתות על ידי אור כחול.
- לבחון את ההשפעות של תנאי תאורה משתנים על תוצאות הייצור.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקמה של מערכות תסבך מווסתות באור כחול.
- בדיקת תנאי תאורה שונים להפקה אופטימלית.
- שימוש בכלים אופטוגנטיים לבקרה מיקרוביאלית.
- הערכה של תהליכי תסבך בקנה מידה משתנה.
תוצאות עיקריות
- השגת ריכוזים גבוהים יותר של כימיקלים וחלבונים באמצעות בקרה אופטוגנטית.
- הדגמת גמישות באופטימיזציה של תהליך התסבך.
- הדגשת חשיבותן של תנאי התאורה ליעילות הייצור.
- הצגת הפוטנציאל לבקרה רב-כרומטית בתהליך התסבך.
מסקנות
- בקרה אופטוגנטית היא שיטה מבטיחה עבור תסיסה מיקרוביאלית.
- חקירה נוספת של תנאי התאורה עשויה לשפר את התפוקה.
- פרוטוקול זה פותח נתיבים חדשים למחקר בתהליכים מיקרוביאליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בקרת אופטוגנטיקה מאפשרת הפרדה דינמית בין שלבי הצמיחה של המיקרואורגניזם לבין שלבי הייצור, ובכך היא פותרת צוואר בקבוק מרכזי בביו-ייצור מבוסס תסיסה. באמצעות שימוש באור כמעורר לא פולשני, גישה זו משפרת את בקרת התהליך, מפחיתה את העומס המטבולי ומגבירה את הריכוזים של כימיקלים וחלבונים המיועדים. היא תומכת במאמצי הנדסת זנים על ידי מתן אפשרות לבקרה זמנית מדויקת של ביטוי מסלולים מטבוליים, דבר שהוא קריטי לאופטימיזציה של התפוקה בתהליכי תסיסה תעשייתיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מעגלים גנטיים ומסלולים מטבוליים באמצעות בקרה הפיכה ותלוית אור על ביטוי גנים.
- ערך תפעולי: מקל על סריקה מהירה של וריאנטים של פרומוטורים ועיצובי מעגלים ללא ארטיפקטים של משרה כימית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מערכת הפיכה וכופה (tunable) לבניית בדיקות ביטוי הניתנות להשראה בשמרים ובבקטריות.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של תנאי ההשראה במבחר של פלטות רב-בארות ובקני מידה של ביו-ריאקטור באמצעות פרמטרי אור מוגדרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים יכולת הרחבה (scalability) מרמת פלטה מיקרוסקופית לרמת ביו-ריאקטור, ובכך תומך בהעברה של מעגלים אופטוגנטיים לייצור חלבונים וכימיקלים.
- ערך תפעולי: מאפשר אסטרטגיות תסיסה רב-שלביות (למשל, צמיחה פולסית, השראה מאוירת) המשפרות את חוסנו של התהליך ואת עקביות המוצר.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי פיתוח זנים ואופטימיזציה של תהליכים, במיוחד כאשר משרה כימיים מטילים מגבלות על יכולת ההרחבה (scalability), העלות או הרעילות התאית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי תפקוד גנים ודינמיקה של מסלולים באמצעות בקרה מדויקת והפיכה של עיתוי הביטוי והמינון.
- סריקה: מאפשרת הערכה כמותית הניתנת לשחזור של ביצועי מעגלים תחת עצימויות אור ומספרי מחזורי עבודה מוגדרים.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים מדידים כגון titer, צפיפות אופטית והפרדת שלבי ייצור לצורך הערכה השוואית של זנים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין בקרה אופטוגנטית בקנה מידה מעבדתי לתסיסה תעשייתית באמצעות הוכחת יכולת התרחבות (scalability) במערכות שמרים וחיידקים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת טכנולוגיית פלטפורמה ישימה על פני מספר אורגניזמי מאחס ומחלקות מוצרים (למשל, חומצות אורגניות, אלכוהולות, isoprenoids).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית השפעות פליאוטרופיות של ביטוי קונסטיטוטיבי, ובכך משפר את רמת הוודאות החיזויית בקשרי גנוטיפ-פנוטיפ.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך באינדוקטורים כימיים יקרים או רעילים, ובכך מפשט את הרכב המצע ואת תהליכי העיבוד הבאים.
- ערך אסטרטגי: מגביר את הגמישות התהליכית ומפחית את הסיכון לכשל בייצור עקב דלדול של האינדוקטור או הטרוגניות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר בחירת זנים מותאמת סיכון על ידי קישור ביטוי מווסת-אור לתוצאות פריון מדידות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון מעגלים אופטוגנטיים והנדסת זנים, במיוחד לבחירת מקדמים (promoters) ואינטגרציה גנומית.
- תלוי בגישה למקורות אור נשלטים (למשל, פאנלים של LED) ומדדי קוונטם לכיול עוצמה וחזרתיות.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי חשיפה לאור בין צוותים כדי למנוע שונות בעיתוי ובמינון האינדוקציה.
- דורש תיקוף של חדירות האור וההומוגניות שלו בנפחי תרבית גדולים יותר כדי להבטיח תגובה אופטוגנטית אחידה.
- כולל אופטימיזציה של מחזורי אור/חושך וספי עוצמה, כיוון שהתנאים האופטימליים משתנים בהתאם למוצר המטרה ולזן המאחס.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Light-Controlled Chemical Production Using the Saccharomyces cerevisiae OptoINVRT7 Circuit
5:12
Three-Phase Fermentation Using the Saccharomyces cerevisiae OptoAMP System
6:26
Results: The Effects of Light-Regulated Fermentations for Chemical and Protein Production
8:01
Conclusion
