Name: בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: למדו שיטה פשוטה ויעילה לבידוד פיקוביליזומים שלמים מציאנובקטריה באמצעות סריקת צפיפות סוכרוז ואנליזת פלואורסצנציה. הפרוטוקול מאפשר חקירת מבנה ותפקוד של מרכיבי איסוף אור בביוכימיה וביולוגיה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לטכנולוגיה קומונס, המכללה למדעי החיים, אוניברסיטת טייוואן הלאומית על השימוש הנוח של ultracentrifuge. הזנים הציאנובקטריאליים Synechocystis sp. PCC 6803 ו Leptolyngbya sp. JSC-1 היה מחונן ד"ר צ'ו, סיו-אן באקדמיה סיניקה, טייוואן, וד"ר דונלד א בראיינט באוניברסיטת מדינת פנסילבניה, ארה"ב, בהתאמה. עבודה זו מומנה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה (טייוואן) (109-2636-B-002-013- ו-110-2628-B-002-065-) ומשרד החינוך (טייוואן) תוכנית המחקר הצעיר של יושן (109V1102 ו-110V1102).

Synechocystis sp. PCC 6803, זן עמיד לגלוקוז מודל, הושג מד"ר צ'ו, סיו-אן באקדמיה סיניקה, טייוואן. Leptolyngbya sp. JSC-1, חוט שאינו מודל, הושג מד"ר דונלד א בראיינט באוניברסיטת פנסילבניה סטייט, ארה"ב.
1. תרבית תאים וקציר
<ol><li>לחסן תאי Syn6803 או JSC-1 באמצעות לולאת חיסון מתכתית לתוך בקבוק חרוט 100 מ"ל המכיל 50 מ"ל של B-HEPES medium28. תרבית את התאים ב 30 °C תחת 50 μmol פוטונים m-2 s-1 (LED אור לבן) ב 1% (v /v) CO2 עם ערבוב מתמיד על ידי מערבל מגנטי (120 סל"ד) עד התרבות מגיעה לשלב צמיחה באמצע מעריכי (OD750 = 0.6-0.8). הערה: לקצור את תרבית התא כאשר הצפיפות האופטית של התרבות ב 750 ננומטר (OD750) מגיע 0.6-0.8 על ידי העברה בקבוקון חדש. צפיפות אופטית שימשה באופן שגרתי להערכת צפיפות תאים מיקרוביאלית בתרביות נוזליות29. אורכי הגל מ 720-750 ננומטר שימשו במחקרים שונים למדידת צמיחה ציאנובקטריאלית30,31,32. בפרוטוקול זה, OD750 משמש כי JSC-1 יכול לייצר פיגמנטים לספוג אור אדום רחוק7. לחלופין, ריכוז כלורופיל שימש גם כדי למדוד את הצמיחה של ציאנובקטריה33.</li>
	<li>העבר את תרבית התא (OD750 ~ 0.8) לבקבוק חרוט 1L ודלל אותו OD750 = 0.2 ב 500 מ"ל של מדיום B-HEPES. הגדל את התרבות עד לשלב הצמיחה המעריכי המאוחר (OD750 = 0.8-1.0) באותו מצב שהוזכר לעיל (שלב 1.1) ולאחר מכן לקצור את התרבות על ידי צנטריפוגה.</li>
	<li>צנטריפוגה התרבות ב 10,000 x g במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לחלוטין להשליך את supernatant. הערה: ניתן לאחסן את כדורי התאים בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) למשך עד 6 חודשים.</li>
</ol>2. תמוגת תאים
<ol><li>להשעות את כדורי התא ולשטוף פעמיים עם 0.75 M K-פוספט חוצץ, pH 7. הערה: כדי ליצור מאגר K-פוספט של 0.75 M ב- pH 7, הכן 1.5 M של K2HPO4 ו- 1.5 M של KH2PO4 בנפרד. יש לערבב 615 מ"ל של 1.5 מ"ל K2HPO4 ו-385 מ"ל של 1.5 מיליון KH2PO4 כדי לקבל חיץ K-פוספט ב-1.5 מ' K-פוספט ב-pH 7. כל שעליך לעשות הוא לדלל אותו עם אותה כמות של ddH2O כדי להפוך 0.75 M K-פוספט חוצץ ב pH 7.</li>
	<li>גלולה את התאים בצינורות צנטריפוגה 50 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. השלך את supernatant ו resuspened התאים עם 0.75 M K-פוספט חוצץ. למדוד את המשקל הרטוב של הכדור על ידי איזון אלקטרוני resuspend 1 גרם משקל רטוב של הכדור ב 5 מ"ל של המאגר. הערה: משקל רטוב של גלולה נמדד על ידי הפחתה במשקל של צינור צנטריפוגה ריק ממשקל צינור הצנטריפוגה המכיל את גלולה התא.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של השעיית תאים ו 0.4-0.6 גרם של חרוזי זכוכית 0.1 מ"מ (ראה טבלת חומרים) לתוך בקבוקון כובע בורג 2 מ"ל.</li>
	<li>לשבור את התאים עבור 30 s על ידי מקצף חרוזים (ראה טבלת חומרים). אפשר את הצינורות להתקרר באמבט מים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות ולחזור על מחזור שבירה 5 פעמים.</li>
	<li>לאחר תמוגה, צנטריפוגה הבקבוקונים ב 500 x g עבור 10 s בטמפרטורת החדר. לאסוף את supernatant עם פיפטה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. לשטוף את החרוזים עם 0.5 מ"ל של 0.75 M K-פוספט חוצץ פעם אחת, ולאחר מכן להעביר לאותו צינור צנטריפוגה.</li>
	<li>הוסף טריטון X-100 (2% w / v, ריכוז סופי) למתלה התא lysed ודגר על שייקר נדנדה (40 סל"ד) בטמפרטורת החדר עד הפתרון הופך הומוגני (~ 20 דקות).</li>
	<li>צנטריפוגה הצינורות ב 17,210 גרם במשך 20 דקות כדי להסיר את התאים שלמים ופסולת תאים גדולים. יש לאחסן את הסופר-נרטיב ללא שכבת המיצלה העליונה של טריטון בטמפרטורת החדר למשך עד שעה אחת. הערה: הסופר-נרטיב מכיל שתי שכבות מופרדות. שכבת הטריטון X ההידרופובית העליונה מכילה חלבונים מחייבי כלורופיל ופיקוביליוזומים בצורת מוט הידרופובי6. השכבה המימית התחתונה מכילה PBS מסיס במים.</li>
</ol>3. הכנת מאגרי שיפוע סוכרוז ובידוד PBS
<ol><li>הפוך ארבעה ריכוזים של סוכרוז (2.0 M, 1.0 M, 0.75 M ו 0.5 M) ב 0.75 M K-פוספט חוצץ ב pH 7. הערה: מומלץ להשתמש 1.5 M K-פוספט חוצץ ב pH 7 כדי להכין את שיפוע סוכרוז כי הוספת סוכרוז מדלל את הריכוז של מאגר K-פוספט. לאחר סוכרוז הוא מומס לחלוטין, להוסיף ddH2O כדי להתאים את הריכוז ל 0.75 M, pH 7.</li>
	<li>מניחים 2.8 מ"ל של 2.0 מ"ל של סוכרוז בתחתית צינור הצנטריפוגה של 40 מ"ל ושכבת-על עם שלוש שכבות של פתרונות סוכרוז (8 מ"ל של 1.0 מ"ל; 12 מ"ל של 0.75 מ"ל ו-11 מ"ל של 0.5 מ"ל עבור צינור צנטריפוגה של 40 מ"ל), ולבסוף PBS המכיל את השבר העל-טבעי (3.0 מ"ל) (איור 1A). הערה: בזהירות להוסיף את פתרון סוכרוז ולאפשר סוכרוז לרדת לאט מאוד בתוך הצינור. החזק את קצה פיפטה ממש מעל פני השטח של הפתרון בצינור בעת טעינת הפתרון. שכבות סוכרוז ניתן לראות כאשר הם שכבות לאט.</li>
	<li>צנטריפוגה שיפועים וכתוצאה מכך ב 125,800 x g עבור ~ 16h-20 שעות ב 25 °C.NOTE: ultracentrifuge (ראה טבלת חומרים) נדרש עבור שלב זה.</li>
	<li>עם אולטרה צנטריפוגה, לדחוס את PBS מחולק ו phycobiliproteins בין השכבות. להקות כחולות ב-Syn6803 (רצועות סגולות שהוצגו ב-JSC-1) נצפו בממשקים (איור 1D).</li>
	<li>לאט לאט לאסוף את השברים עם פיפטה מהחלק העליון של שיפועי סוכרוז. הסר את הסוכרזה על ידי ריכוז חוזר ונשנה (3,500 x גרם במשך 20 דקות) ודילול השברים עם חיץ K-פוספט 0.75 M K-פוספט ביחידות סינון צנטריפוגליות ממברנה (10 K משקל מולקולרי לחתוך, ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>4. מדידת פלואורסצנטיות PBS ב 77K
הערה: פלואורימטר המצויד במיכל חנקן נוזלי (ראה טבלת חומרים) משמש למדידת ספקטרום פלואורסצנטיות ב-77K.
<ol><li>לדלל את מדגם PBS מרוכז עם 0.75 M K-פוספט חוצץ כדי להשיג לפחות 500 μL. הערה: הריכוזים של phycocyanin של דגימות היו ~ 4.2 מיקרוגרם mL-1 בהתבסס על הנוסחה: (OD615 0.474 x OD652)/5.34 [מ"ג / מ"ל]34.</li>
	<li>מוסיפים 500 μL של דגימת PBS לצינור זכוכית שקוף ולהקפיא את הצינור בחנקן נוזלי עד שהוא קפוא לחלוטין. העבירו את הצינור הקפוא למיכל דיואר שקוף (ראו טבלת חומרים) שמולא מראש בחנקן נוזלי. הערה: הקוטר הפנימי של צינור הזכוכית הוא 3 מ"מ בפרוטוקול זה. צינורות זכוכית דקים שימשו כדי למזער את הספיגה מחדש של פליטת אורך גל קצר במדגם.</li>
	<li>בחר את אורכי הגל עירור עבור phycoerythrin ו phycocyanin להיות 550 ננומטר ו 580 ננומטר, בהתאמה. הערה: פליטות פלואורסצנטיות נרשמו מ 560-800 ננומטר (עבור עירור 550 ננומטר) או 600-800 ננומטר (עבור עירור 580 ננומטר).</li>
</ol>5. ניתוח דף SDS של PBS
<ol><li>חוצץ להחליף את דגימות PBS מרוכז ב 0.75 M של K-פוספט עם 50 מ"מ של חיץ Tris (pH 8.0) ביחידות סינון צנטריפוגלי ממברנה (3K משקל מולקולרי לחתוך, ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>ערבבו 50 μL של פתרון PBS עם 10 μL של 6x SDS מאגר טעינה [300 mM Tris pH 6.8, 12% (w/v) נתרן דודציל סולפט, 0.06% (w/v) כחול ברומפנול, 50% (v/v) גליצרול, 6% (v/v) β-Mercaptoethanol] (ראה טבלת חומרים) בצינור microcentrifuge ודגרה ב 95 °C (95 °C ( 10 דקות בבלוק חום.</li>
	<li>להפריד את דגימות החלבון על ידי SDS-PAGE (8%-20% (w / v) ג'ל פוליאקרילאמיד) ולהמשיך עם אבץ וכתמי Coomassie. ההליך המפורט תואר בהפניה8.</li>
	<li>להכתמת אבץ, יש לדגור על הג'ל בתמיסת ZnSO4 בגודל 50 מ"מ למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את הג'ל במים מזוקקים ולדמיין פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי אבץ תחת הקרנת UV (312 ננומטר).</li>
	<li>עבור כתמים כחולים של Coomassie, דגירה על הג'ל במאגר הכתמים הכחול Coomassie [0.25% (w/v) של Coomassie R-250, 10% (v/v) של חומצה אצטית, 50% (v/v) של מתנול, ראה טבלת חומרים] למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו את הג'ל במים מזוקקים פעמיים כדי להסיר את מאגר הכתמים השיורי ודגרו את הג'ל עם חיץ destaining [10% (v/v) חומצה אצטית, 30% (v/v) מתנול] על שייקר נדנדה (40 סל"ד) בטמפרטורת החדר במהלך הלילה. דמיינו את הג'ל המוכתם במלואו באמצעות מצלמה דיגיטלית או סורק.</li>
</ol>

<ol><li>Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+cyanobacterial+phycobilisomes%3A+A+model%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model.</a> Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).</li>
<li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycobilisomes%3A+Structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phycobilisomes: Structure and dynamics.</a> Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).</li>
<li>Glazer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+harvesting+by+phycobilisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light harvesting by phycobilisomes.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycobilisomes+supply+excitations+to+both+photosystems+in+a+megacomplex+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria.</a> Science. 342 (6162), 1104(2013).</li>
<li>Bryant, D. A., Canniffe, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+nature+designs+light-harvesting+antenna+systems%3A+Design+principles+and+functional+realization+in+chlorophototrophic+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+B%3A+Atomic%2C+Molecular+and+Optical+Physics%22%5BJournal%5D)">How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001(2018).</li>
<li>Hirose, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+chromatic+acclimation+processes+regulating+phycoerythrocyanin+and+rod-shaped+phycobilisome+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria.</a> Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).</li>
<li>Gan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remodeling+of+a+cyanobacterial+photosynthetic+apparatus+in+far-red+light%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light.</a> Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).</li>
<li>Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-red+light+photoacclimation+%28FaRLiP%29+in+Synechococcus+sp.+PCC+7335.+II.+Characterization+of+phycobiliproteins+produced+during+acclimation+to+far-red+light%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light.</a> Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).</li>
<li>Ho, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remodeling+of+the+photosynthetic+apparatus+alters+energy+transfer+among+photosynthetic+complexes+when+cyanobacteria+acclimate+to+far-red+light%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064(2020).</li>
<li>Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+Acclimation+in+Cyanobacteria%3A+A+diverse+and+widespread+process+for+optimizing+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).</li>
<li>Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phycobilisome%2C+a+light-harvesting+complex+responsive+to+environmental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions.</a> Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).</li>
<li>Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+structural+properties+of+the+major+biliproteins+of+Anabaena+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp.</a> Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).</li>
<li>Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cyanobacterial+allophycocyanins+absorbing+far-red+light%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light.</a> Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).</li>
<li>Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+Gloeobacter+violaceus+and+its+phycobilisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes.</a> Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+phycobilisome+from+the+red+alga+Griffithsia+pacifica%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica.</a> Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+red-shifted+phycobilisomes+isolated+from+the+chlorophyll+f-containing+cyanobacterium+Halomicronema+hongdechloris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).</li>
<li>Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+chromatic+and+far-red+photoacclimations+in+Synechococcus+ATCC+29403+%28PCC+7335%29.+I%3A+The+phycobilisomes%2C+a+proteomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach.</a> Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).</li>
<li>Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+phycobilisomes.+Characterization+of+the+phycobilisomes+of+Synechococcus+sp.+6301%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).</li>
<li>Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycobilisomes+from+blue-green+and+red+algae%3A+Isolation+criteria+and+dissociation+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics.</a> Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).</li>
<li>Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+C-Phycocyanin+from+cyanobacterial+species+of+marine+and+freshwater+habitat%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat.</a> Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).</li>
<li>Zolla, L., Bianchetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatography+coupled+on-line+with+electrospray+ionization+mass+spectrometry+for+the+simultaneous+separation+and+identification+of+the+Synechocystis+PCC+6803+phycobilisome+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins.</a> Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).</li>
<li>Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+characterization+of+phycocyanin+from+Oscillatoria+quadripunctulata-Isolated+from+the+rocky+shores+of+Bet-Dwarka%2C+Gujarat%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India.</a> Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).</li>
<li>Williams, J. G. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+JGK+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. , Academic Press. 766-778 (1988).</li>
<li>Brown Igor, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphasic+characterization+of+a+thermotolerant+siderophilic+filamentous+cyanobacterium+that+produces+intracellular+iron+deposits%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+properties+of+an+R-phycocyanin+from+the+phycobilisomes+of+a+marine+red+macroalga+Polysiphonia+urceolata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata.</a> PLoS One. 9 (2), 87833(2014).</li>
<li>Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+bilin-linked+peptides+and+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).</li>
<li>Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+phycobilisomes%3A+Selective+dissociation+monitored+by+fluorescence+and+circular+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).</li>
<li>Dubbs, J. M., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+transcriptional+analysis+of+the+cpeBA+operon+of+the+cyanobacterium+Pseudanabaena+species+PCC+7409%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409.</a> Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).</li>
<li>Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+calibration+of+microbial+growth+in+microplate+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">General calibration of microbial growth in microplate readers.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38828(2016).</li>
<li>Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+is+essential+for+the+biogenesis+of+Photosystem+I+but+not+thylakoid+membranes+in+Synechococcus+sp.+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+validation+of+the+glyoxylate+cycle+in+the+cyanobacterium+Chlorogloeopsis+fritschii+Strain+PCC+9212%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212.</a> Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).</li>
<li>Huang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+cytochrome+b559+and+Psbj+on+and+near+the+QC+site+in+photosystem+II+influence+the+regulation+of+short-term+light+response+and+photosynthetic+growth+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).</li>
<li>Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+effects+of+different+culture+conditions+on+growth+of+Halomicronema+hongdechloris+-+A+filamentous+cyanobacterium+containing+chlorophyll+f%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 67(2014).</li>
<li>Bennett, A., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+chromatic+adaptation+in+a+filamentous+blue-green+alga%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga.</a> Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).</li>
<li>Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+energy+transfer+from+phycocyanin+to+chlorophyll+in+an+apcA-defective+mutant+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).</li>
<li>Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organisation+of+phycobilisomes+from+Synechocystis+sp.+strain+PCC6803+and+their+interaction+with+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).</li>
<li>Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Membrane-associated+CpcG2-phycobilisome+in+Synechocystis%3A+A+new+photosystem+I+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna.</a> Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין עניין מתחרה.

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וסטנדרטית לבידוד PBS שלם בשני סוגים של ציאנובקטריה, דגם חד-תאי Syn6803, ו- JSC-1 שאינו דגם סיב. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הם הומוגניזציה של תאים ו ultracentrifugation על שיפוע צפיפות רציפה של סוכרוז. בדרך כלל, ההפרעה של תאים נימיים היא מסובכת יותר מאשר אלה חד תאיים. הגדלת כמות החומר ההתחלתי (המשקל הרטוב של גלולה התא) ואת החזרה של מכות חרוזים היו מועילים כדי להגדיל את התשואה של PBS מתאי ציאנובקטריאליים נימים. עבור ציאנובקטריום נימי, JSC-1, שלוש פעמים יותר תאים שימשו מאשר אחד חד תאי, Syn6803....

Phycobilisome (PBS) הוא קומפלקס ענק של חלבון פיגמנט מסיס במים המתחבר לצד הציטופלסמי של מערכות הפוטו-מערכות בממברנות התילקואידיות של ציאנובקטריה1. PBS מורכב בעיקר מפיקוביליפרוטאינים צבעוניים וחלבוני מקשר חסרי צבע1,2. את phycobiliproteins ניתן לחלק לארבע קבוצות עיקריות: phycoeryththrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin, ו allophycocyanin3. ארבע הקבוצות העיקריות סופגות אורכי גל שונים של אנרגיית אור בטווח של 490-650 ננומטר, אשר כלורופילים ספגו בצורה לא יעילה3. ה-PBS יכול לשמש כאנטנה לקצירת אור לאיסוף אנרגיית אור ולהעברתה ל-Photosystem II ו-I4.
המבנה וההרכב של PBS משתנים ממינים למינים. באופן קולקטיבי, שלוש צורות של phycobilisome (hemididial, בצורת צרור, בצורת מוט) זוהו במינים ציאנובקטריאליים שונים5. אפילו באותם מינים, הרכב ה-PBS משתנה בתגובה לסביבה, כגון איכות האור והדלדול התזונתי6,7,8,9,10,10,11. לכן, ההליך הניסיוני לבודד PBS מציאנובקטריה היה אינסטרומנטלי בחקר PBS12. במשך כמה עשורים, פרוטוקולים רבים ושונים בודדו את PBS וניתחו את המבנה, ההרכב והתפקוד שלו6,7,8,12,13,14,15,16,17. המגוון הרחב של שיטות לבידוד PBS אכן מספק גמישות בבידוד המתחם במינים שונים עם ריאגנטים ומכשירים שונים. עם זאת, זה גם עושה בחירת פרוטוקול מתאים קשה יותר עבור מדענים שאינם מכירים עם ציאנובקטריה ו- PBS. לכן, פרוטוקול כללי ופשוט מפותח בעבודה זו עבור אלה המעוניינים להתחיל בידוד PBS מן ציאנובקטריה.
השיטות לבידוד PBS מפרסומים קודמים מסוכמות כאן. מאז PBS הוא קומפלקס חלבון מסיס במים והוא מנותק בקלות, מאגר פוספט כוח יוני גבוה נדרש כדי לייצב PBS במהלך החילוץ18. מספר מאמרי מחקר המתארים שיטות לבידוד PBS מציאנובקטריום פורסמו בעבר. רוב השיטות דורשות ריכוז גבוה של מאגר פוספט8,14,15,18,19. עם זאת, ההליכים לשיבוש מכני של התאים משתנים, כגון מיצוי בסיוע חרוזי זכוכית, sonication20, ועיתונות צרפתית 6,8,14. phycobiliproteins שונים ניתן להשיג על ידי משקעים עם אמוניום סולפט20 ומטוהר על ידי HPLC21 או טור כרומטוגרפי22. מצד שני, PBS שלם יכול להיות מבודד בקלות על ידי צפיפות סוכרוז שיפוע ultracentrifugation6,8,15.
בפרוטוקול זה, ציאנובקטריום מודל אחד וציאנובקטריום אחד שאינו מודל שימשו כחומרים לבידוד PBS. הם מודל חד תאי גלוקוז סובלני Synechocystis sp. PCC 6803 (להלן Syn6803) ולא מודל חוט Leptolyngbya sp. JSC-1 (להלן JSC-1), בהתאמה 7,23,24. הפרוטוקול מתחיל על ידי שיבוש של ציאנובקטריה חד-תאית ונימה במאגר פוספט בעל חוזק יוני גבוה. לאחר תמוגה, supernatants נאספים על ידי צנטריפוגה ולאחר מכן מטופלים עם חומר ניקוי לא יוני (טריטון X-100) כדי solubilize חלבונים מסיסים במים מן הקרומים thylakoid. סך החלבונים המסיסים במים מוחלים על שיפוע צפיפות סוכרוז בלתי פוסק כדי לחלק את ה- PBS. שיפוע הסוכרוז הבלתי פוסק בפרוטוקול זה מורכב מארבעה פתרונות סוכרוז ומחיצות PBS שלם בשברים הנמוכים ביותר של שכבת סוכרוז25. ניתן לנתח את השלמות של PBS על ידי SDS-PAGE, כתמי אבץ, ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית 77K6,7,8,26. שיטה זו מתאימה למדענים שמטרתם לבודד PBS שלם מציאנובקטריה ולחקור את תכונותיו הספקטרליות, המבניות וההרכביות.
ישנם מספר יתרונות של פרוטוקול זה. (1) שיטה זו מתוקננת וניתן להשתמש בה לבידוד PBS שלם הן מציאנובקטריה חד-תאית והן מציאנובקטריה נימית. רוב המאמרים מתארים את השיטה שחלה בכל סוג אחד של ציאנובקטריה4,7,8,12,13,14,16,18. (2) שיטה זו מבוצעת בטמפרטורת החדר, כאשר PBS מתנתק בטמפרטורה נמוכה19,27. (3) שיטה זו מתארת שימוש במקצף חרוזים כדי לשבש את התאים; לכן, זה זול ובטוח יותר מאשר עיתונות צרפתית בלחץ גבוה ונזק שמיעה אפשרי מ sonicator בשיטות אחרות8,13,14,20. (4) שיטה זו מבודדת PBS שלם על ידי צנטריפוגה אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית סוכרוז. בדרך זו, PBS שלם עם גדלים שונים PBS מנותק חלקית ניתן להפריד בהתבסס על ריכוז סוכרוז.

<table><tbody><tr><td>0.1 מ"מ חרוזי זכוכית</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td>למיצוי PBS</td></tr><tr><td>13 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>היטאצ'י</td><td>13PA</td><td>אולטרה צנטריפוגה</td></tr><tr><td>40 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>היטאצ'י</td><td>40PA</td><td>אולטרה צנטריפוגה</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Merck</td><td>8.1875.2500</td><td>עבור Coomassie כחול מכתים</td></tr><tr><td>B-HEPES בינוני</td><td></td><td></td><td>מדיום ציאנובקטריאלי שונה ממדיום BG-11</td></tr><tr><td>כחול מבריק R-250</td><td>Sigma</td><td>B-0149</td><td>לצביעה כחולה של Coomassie</td></tr><tr><td>כחול ברומופנול</td><td>Wako תעשיות כימיות טהורות</td><td>2-291</td><td>מאגר טעינת חלבון</td></tr><tr><td>איזון אלקטרוני</td><td>Radwag</td><td>WLC 2/A2/C/2</td><td>למדידת משקל רטוב של כדורי תאים</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי</td><td>היטאצ'י</td><td>F-7000</td><td>ספקטרופוטומטר</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>BioShop</td><td>Gly001.500</td><td>מאגר העמסת חלבון</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוהה</td><td>Hitachi</td><td>CR22N</td><td>להחלפת חיץ</td></tr><tr><td>Leptolyngbya sp. JSC-1</td><td></td><td></td><td>מד"ר דונלד א. בראיינט מאוניברסיטת פנסילבניה, ארה"ב.</td></tr><tr><td>אביזר למדידת טמפרטורה נמוכה</td><td>היטאצ'י</td><td>5J0-0112</td><td>האביזר כולל מיכל Dewar שקוף לספקטרוסקופיה פלואורסצנטית של 77K.</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Merck</td><td>1.07018,2511</td><td>עבור Coomassie כחול מכתים</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>תרמו פישר</td><td>פיקו 21</td><td>עבור PBS מיצוי</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>דגם 607</td><td>עבור PBS מיצוי</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט dibasic</td><td>PanReac AppliChem</td><td>121512.121</td><td>עבור מיצוי PBS</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>PanReac AppliChem</td><td>141509.121</td><td>למיצוי PBS</td></tr><tr><td>בקבוקון מכסה בורג</td><td>BioSpec</td><td>10832</td><td>למיצוי PBS</td></tr><tr><td>SmartView Pro Imager</td><td>מדע עיקרי</td><td>UVCI-2300</td><td>לזיהוי אותות צביעת Znic</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Zymeset</td><td>BSD101</td><td>מאגר טעינת חלבון</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Zymeset</td><td>BSU101</td><td>לבידוד</td></tr> <tr><td>PBSSynechocystis sp. זן עמיד לגלוקוז PCC 6803</td><td></td><td></td><td>מאת ד"ר צ'ו, Hsiu-An באקדמיה סיניקה, טייוואן</td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioShop</td><td>TRS 011.1</td><td>מאגר טעינת חלבון</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX 506.500</td><td>למיצוי PBS</td></tr><tr><td>מסנן צנטריפוגלי ממברנה אולטרה 10 K</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td>להחלפת</td></tr> <tr><td>חיץמסנן צנטריפוגלי ממברנה אולטרה 3 K</td><td>Millipore</td><td>UFC500324</td><td>להחלפת חיץ</td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>היטאצ'י</td><td>CP80WX</td><td>אולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר UV / Vis</td><td>Agilent</td><td>Cary 60</td><td>ספקטרופוטומטר</td></tr><tr><td>אבץ גופרתי</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131787.121</td><td>לצביעה Znic</td></tr> <tr><td>ובטא;-Mercaptoethanol</td><td>BioBasic</td><td>מאגר טעינת חלבון</td> <td>MB0338</td></tr></tbody></table>

בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

ב ציאנובקטריה, phycobilisome הוא קומפלקס חלבון אנטנה חיוני אשר קוצר אור ומעביר אנרגיה למערכות פוטו-מערכת I ו- II עבור פוטוכימיה. לימוד המבנה וההרכב של phycobilisome הוא עניין רב למדענים כי זה חושף את האבולוציה ואת הסטייה של פוטוסינתזה ציאנובקטריה. פרוטוקול זה מספק שיטה מפורטת וממוטבת לשבירת תאים ציאנובקטריאליים בעלות נמוכה על ידי מקצף חרוזים ביעילות. לאחר מכן ניתן לבודד את הפיזיקוביליוזום השלם מתמצית התא על ידי אולטרה-צנטריפוגציה הדרגתית של סוכרוז. שיטה זו הוכיחה שהיא מתאימה הן לדגם והן לציאנובקטריה שאינה מודל עם סוגי תאים שונים. הליך שלב אחר שלב מסופק גם כדי לאשר את השלמות והרכוש של phycobiliproteins על ידי ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות 77K ו- SDS-PAGE מוכתם על ידי אבץ גופרתי וכחול קומאסי. phycobilisome מבודד יכול גם להיות נתון ניתוחים מבניים נוספים קומפוזיציה. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק מדריך התחלה מועיל המאפשר לחוקרים שאינם מכירים ציאנובקטריה לבודד ולאפיין במהירות פיקוביליזום שלם.

תאי Syn6803 ו- JSC-1 טופחו בבקבוקונים חרוטיים עם ערבוב מתמיד במדיום B-HEPES בטמפרטורה של 30 °C (תחת אור לבן LED (50 מיקרומול פוטונים m-2s-1) בתא צמיחה מלא 1% (v / v) CO2. בשלב הצמיחה המעריכית (OD750 = ~ 0.5), התאים היו תת-תרבותיים למדיום טרי עם OD750 צפיפות אופטית סופית = ~ 0.2. לאחר שהגיעו לשלב הצמיחה המעריכית המאוחרת (OD750 = 0.6-0.8), התרבויות נאספו וצנטריפוגות (10,000 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות). הסופר-ננט הושלך, וכדורי התא אוחסנו בטמפר...

הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הבידוד של phycobililisomes מציאנובקטריה על ידי צנטריפוגציה באמצעות שיפוע צפיפות סוכרוז בלתי פוסק. השברים של phycobilisomes שלמים מאושרים על ידי ספקטרום פליטה פלואורסצנטי 77K וניתוח SDS-PAGE. שברי הפיזיקוביליוזום המתקבלים מתאימים להכתמה שלילית של TEM וניתוח ספקטרומטריית מסה.

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

זהו פרוטוקול פשוט ומהיר המאפשר לאנשים שאינם מכירים ציאנובקטריה לבודד phycobilisome בנוחות. היתרון של טכניקה זו הוא שזה מותאם בקנה מידה קטן וזה קל לבצע. זוהי שיטה פשוטה, אמינה ויעילה לבידוד פיקוביליוזומים שלמים של מודל וצינובקטריה שאינה מודל.התחל על ידי העברת תרבית התא של 0.8 OD ב 750 ננומטר לתוך בקבוקון ליטר אחד לדלל אותו ב 500 מיליליטר של מדיום B-HEPES כדי להשיג את OD של 0.2 ב 750 ננומטר. הגדל את התרבות עם ערבוב מתמיד ב 30 מעלות צלזיוס עד OD מגיע 0.8 ל 1, המציין שלב צמיחה מעריכי מאוחר. צנטריפוגה התרבות במהירות של 10, 000 פעמים g במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant.להשעות את כדורי התא ולשטוף פעמיים עם 0.75 טוחן אשלגן פוספט חוצץ, pH שבע. גלולה את התאים בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר על ידי צנטריפיקציה בטמפרטורת החדר. להשליך את supernatant ו resuspend התאים עם 0.75 חיץ אשלגן פוספט טוחן.למדוד את המשקל הרטוב של הכדור על ידי איזון אלקטרוני resuspend את המשקל הרטוב גרם אחד של הכדור בחמישה מיליליטר של החיץ. הוסף מיליליטר אחד של השעיית תאים ו 0.4 עד 0.6 גרם של 0.1 חרוזי זכוכית מילימטר לתוך בקבוקון כובע בורג שני מיליליטר. לשבור את התאים במשך 30 שניות על ידי מקצף חרוזים.אפשר לצינורות להתקרר באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. לאחר תמוגה, צנטריפוגה הבקבוקונים במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר במהירות של 500 פעמים g. לאסוף את supernatant עם פיפטה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.לשטוף את החרוזים עם 0.5 מיליליטר של 0.75 טוחן אשלגן פוספט חוצץ פעם אחת, ולאחר מכן הועבר לאותו צינור צנטריפוגה. הוסיפו את Triton X-100 למתלי התאים המסודרים ודגרו בשייקר נדנדה בטמפרטורת החדר ו-40 סל"ד למשך 20 דקות או עד שהפתרון יהפוך להומוגני. צנטריפוגה הצינורות במשך 20 דקות ב 17, 210 פעמים g ולאחסן את supernatant ללא שכבת micelle טריטון העליון בטמפרטורת החדר עד שעה אחת.הפוך ארבעה ריכוזים של סוכרוז ב 0.75 טוחנת אשלגן פוספט חוצץ ב- pH שבע. מניחים 2.8 מיליליטר של שני חיץ סוכרוז טוחן בתחתית צינור צנטריפוגה 40 מיליליטר וכיסוי עם שלוש שכבות של פתרונות סוכרוז. לבסוף, להוסיף שלושה מיליליטרים של PBS המכיל את שבר supernatant וצנטריפוגה שיפועים וכתוצאה מכך.עם אולטרה-מרכזיזציה, לדחוס את PBS מחולק ו phycobiliproteins בין השכבות ולצפות ברצועות הכחולות ב Syn6803 וממשקים. הסר את הסוכרזה על ידי ריכוז ודילול חוזר ונשנה של השברים עם 0.75 חיץ אשלגן פוספט טוחן וקרום יחידות המסנן הצנטריפוגליות. למדידת פלואורסצנטיות PBS לדלל את מדגם PBS מרוכז עם 0.75 חיץ אשלגן פוספט טוחן כדי ליצור עד 500 מיקרוליטר נפח.מוסיפים את דגימת PBS המדוללת לצינור זכוכית שקוף ומקפיאים את הצינור בחנקן נוזלי עד שהוא קפוא לחלוטין. מעבירים את הצינור הקפוא למיכל דיואר שקוף מלא מראש בחנקן נוזלי. תמוגת תאים מלאה מציגה את הצבע הכחול-ירוק-על-טבעי והכהה לפני צנטריפיקציה.הפרדת ההדרגה של צפיפות סוכרוז של PBS מבודד מראה כמה שברים של phycobiliproteins מנותקים ואת השבר הנמוך ביותר מייצג את PBS שלם. ספקטרום הספיגה מן PBS מנותק שלם ומנותק של JSC אחד ו Syn6803 יש את אותו שיא ב 622 ננומטר, המתאים phycocyanin. יתר על כן, שיא ספיגת phycoerythrin ב 571 ננומטר הן PBS מנותק ושלם של JSC-1.ספקטרום הפליטה של PBS מנותק יש שיא אחד חזק על כ 650 ננומטר ב Syn6803 ו JSC-1, המייצג את הפליטה מ phycocyanin. פסגות מקסימום פליטה פלואורסצנטית ב 651 ננומטר ו 684 ננומטר לחשוף כי האנרגיה שנקטפו על ידי phycocyanin הועבר ביעילות allophycocyanin ופולטים מסוף, שהם ApcD ו ApcE, בליבה. האיור מראה אבץ מוכתם SDS-PAGE תחת הקרנת UV שבו יחידות המשנה phycobiliprotein הם פלואורסצנטיים מאוד ApcE הראה פלואורסצנטיות חלשה, המצוין עם החץ.כתמים כחולים Kumasi מראה כי השברים העליונים מכילים חלבונים אחרים שאינם מסיסים במים PBS ו- PBS ו- Syn6803 שלמים מציגים רצועת ApcE בולטת, המצוינת בחץ, חסרה שברי PBS מנותקים. Ultracentrifugation מדגים כי שיפוע סוכרוז מוכן ביחס של 1:3 מציג רצועות רחבות יותר מאשר שיפוע עשה ביחס של 1:10. חשוב לתדלק את התאים ואת solvolysis supernatants לחלוטין כדי להשיג יותר phycobilisomes.שיטות אחרות, כמו cryo-EM או ספקטרומטריה מעורבת, ניתן להשתמש כדי ללמוד את מבנה החלבון או את הרכב החלבון של phycobilisomes.

isolation-characterization-intact-phycobilisome

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Shivaiah, K., et al. בידוד טיפות ליפידים של פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים את הבידוד של פלסטוגלובולות מציאנובקטריה. זה מתחיל בתרבית של ציאנובקטריה וממשיך דרך שיבוש תאים באמצעות כוח מכני. שחרור פיגמנטים פוטוסינתטיים מעיד על ליזה מוצלחת. לאחר מכן משתמשים בשיפוע צעד סוכרוז כדי להפריד רכיבים תאיים לפי צפיפות, מה שמאפשר לפלסטגלובולות בצפיפות נמוכה ליצור פס מובהק בחלקו העליון. חלק זה נאסף ונשמר להמשך ניתוח.

מיצוי וטיהור פלסטוגלובולות מחיידקים פוטוסינתטיים

מקור: ג'יאנג, ה., הו, מ. בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה. J. Vis. Exp.(2021).סרטון זה מדגים את ההליך לתרבית ציאנובקטריה להשגת ביומסה על ידי גידול תאים בתאורה רציפה עם אספקת פחמן דו חמצני ותנאים עשירים בחומרים מזינים, ולאחר מכן קציר באמצעות צנטריפוגה.

הכנת תרבית ציאנובקטריאלית לייצור ביומסה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד fucoxanthin כלורופיל a/c מחייב חלבונים (FCP) מ- diatoms ועד לשלב אותם בתוך ליפוזומים עם יצירות השומנים טבעית ללמוד עירור העברת אנרגיה על שינויים בהרכב יון.

בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות Cyclotella Meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע באופן כמותי phycobiliprotein בתוכן cyanobacterium Synechocystis באמצעות שיטת spectrophotometric. ההליך החילוץ היה הוחלו בהצלחה גם זנים אחרים כחוליות ואצות; עם זאת, בשל הבדלים ב ספקטרום בליעה פיגמנט, יש צורך לבחון את המשוואות spectrophotometric עבור כל זן בנפרד.

קביעת spectrophotometric תוכן Phycobiliprotein Cyanobacterium Synechocystis

כאן נתאר שיטת photobleaching כדי להפחית את autofluorescence של כחוליות. לאחר photobleaching, שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ משמשת כדי לקבל תמונות סופר-ברזולוציה תלת מימדי של הטבעת FtsZ cyanobacterial.

Photobleaching מאפשר הדמיה ברזולוציה-העל של הטבעת FtsZ Cyanobacterium Prochlorococcus

כאן, פרוטוקולים עבור בידוד של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות ובידוד של exoproteomes שלהם מתוארים. שני ההליכים לגלם שלבים מרכזיים כדי להשיג פולימרים או חלבונים עם דרגות טוהר גבוהה, כי ניתן להשתמש לניתוח נוסף או יישומים. הם יכולים גם להיות מותאמים בקלות בהתאם לצרכים ספציפיים של המשתמש.

מבט כלפי חוץ: בידוד של Cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים

פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד מסלעים ימיים. מאמר זה מתאר את הבידוד של חוטים ממקורות טבעיים, מיצוי DNA, ריצוף גנום, טרנספורמציה טבעית, ביטוי של sfGFP, קריוקונסרבציה ושיטות תנועתיות.

טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה

הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאורים מדוקדקים לבידוד, ריכוז ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות מתרביות ציאנובקטריאליות. כמו כן נדונו גישות לטיהור בועיות מתרבויות בקני מידה שונים, פשרות בין מתודולוגיות ושיקולים לעבודה עם דוגמאות שטח.

בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות ציאנובקטריאליות

פרוטוקול מהיר ויעיל מוצג לבידוד של טיפות שומנים plastoglobule הקשורים אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים. הכנה מוצלחת של פלסטוגלובולים מבודדים היא צעד ראשון מכריע שקדם למחקרים מולקולריים מפורטים כגון ניתוחים פרוטאומיים וליפידומיים.

בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה

מסמך זה מדגים שיטות לטיהור בידוד וזיהוי של exosomes, כמו גם טכניקות לניתוח של התוכן המולקולרי שלהם. שיטות אלה להתאמה עבור בידוד exosome משני תרבות התקשורת התא נוזלים ביולוגיים, והוא יכול מעבר ניתוח של התוכן המולקולרי להיות שימושית גם במחקרים תפקודית.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

למדו שיטה פשוטה ויעילה לבידוד פיקוביליזומים שלמים מציאנובקטריה באמצעות סריקת צפיפות סוכרוז ואנליזת פלואורסצנציה. הפרוטוקול מאפשר חקירת מבנה ותפקוד של מרכיבי איסוף אור בביוכימיה וביולוגיה תאית.

בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה

גלה סרטונים נוספים