בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה

זהו פרוטוקול פשוט ומהיר המאפשר לאנשים שאינם מכירים ציאנובקטריה לבודד phycobilisome בנוחות. היתרון של טכניקה זו הוא שזה מותאם בקנה מידה קטן וזה קל לבצע. זוהי שיטה פשוטה, אמינה ויעילה לבידוד פיקוביליוזומים שלמים של מודל וצינובקטריה שאינה מודל.

התחל על ידי העברת תרבית התא של 0.8 OD ב 750 ננומטר לתוך בקבוקון ליטר אחד לדלל אותו ב 500 מיליליטר של מדיום B-HEPES כדי להשיג את OD של 0.2 ב 750 ננומטר. הגדל את התרבות עם ערבוב מתמיד ב 30 מעלות צלזיוס עד OD מגיע 0.8 ל 1, המציין שלב צמיחה מעריכי מאוחר. צנטריפוגה התרבות במהירות של 10, 000 פעמים g במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant.

להשעות את כדורי התא ולשטוף פעמיים עם 0.75 טוחן אשלגן פוספט חוצץ, pH שבע. גלולה את התאים בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר על ידי צנטריפיקציה בטמפרטורת החדר. להשליך את supernatant ו resuspend התאים עם 0.75 חיץ אשלגן פוספט טוחן.

למדוד את המשקל הרטוב של הכדור על ידי איזון אלקטרוני resuspend את המשקל הרטוב גרם אחד של הכדור בחמישה מיליליטר של החיץ. הוסף מיליליטר אחד של השעיית תאים ו 0.4 עד 0.6 גרם של 0.1 חרוזי זכוכית מילימטר לתוך בקבוקון כובע בורג שני מיליליטר. לשבור את התאים במשך 30 שניות על ידי מקצף חרוזים.

אפשר לצינורות להתקרר באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. לאחר תמוגה, צנטריפוגה הבקבוקונים במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר במהירות של 500 פעמים g. לאסוף את supernatant עם פיפטה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.

לשטוף את החרוזים עם 0.5 מיליליטר של 0.75 טוחן אשלגן פוספט חוצץ פעם אחת, ולאחר מכן הועבר לאותו צינור צנטריפוגה. הוסיפו את Triton X-100 למתלי התאים המסודרים ודגרו בשייקר נדנדה בטמפרטורת החדר ו-40 סל"ד למשך 20 דקות או עד שהפתרון יהפוך להומוגני. צנטריפוגה הצינורות במשך 20 דקות ב 17, 210 פעמים g ולאחסן את supernatant ללא שכבת micelle טריטון העליון בטמפרטורת החדר עד שעה אחת.

הפוך ארבעה ריכוזים של סוכרוז ב 0.75 טוחנת אשלגן פוספט חוצץ ב- pH שבע. מניחים 2.8 מיליליטר של שני חיץ סוכרוז טוחן בתחתית צינור צנטריפוגה 40 מיליליטר וכיסוי עם שלוש שכבות של פתרונות סוכרוז. לבסוף, להוסיף שלושה מיליליטרים של PBS המכיל את שבר supernatant וצנטריפוגה שיפועים וכתוצאה מכך.

עם אולטרה-מרכזיזציה, לדחוס את PBS מחולק ו phycobiliproteins בין השכבות ולצפות ברצועות הכחולות ב Syn6803 וממשקים. הסר את הסוכרזה על ידי ריכוז ודילול חוזר ונשנה של השברים עם 0.75 חיץ אשלגן פוספט טוחן וקרום יחידות המסנן הצנטריפוגליות. למדידת פלואורסצנטיות PBS לדלל את מדגם PBS מרוכז עם 0.75 חיץ אשלגן פוספט טוחן כדי ליצור עד 500 מיקרוליטר נפח.

מוסיפים את דגימת PBS המדוללת לצינור זכוכית שקוף ומקפיאים את הצינור בחנקן נוזלי עד שהוא קפוא לחלוטין. מעבירים את הצינור הקפוא למיכל דיואר שקוף מלא מראש בחנקן נוזלי. תמוגת תאים מלאה מציגה את הצבע הכחול-ירוק-על-טבעי והכהה לפני צנטריפיקציה.

הפרדת ההדרגה של צפיפות סוכרוז של PBS מבודד מראה כמה שברים של phycobiliproteins מנותקים ואת השבר הנמוך ביותר מייצג את PBS שלם. ספקטרום הספיגה מן PBS מנותק שלם ומנותק של JSC אחד ו Syn6803 יש את אותו שיא ב 622 ננומטר, המתאים phycocyanin. יתר על כן, שיא ספיגת phycoerythrin ב 571 ננומטר הן PBS מנותק ושלם של JSC-1.

ספקטרום הפליטה של PBS מנותק יש שיא אחד חזק על כ 650 ננומטר ב Syn6803 ו JSC-1, המייצג את הפליטה מ phycocyanin. פסגות מקסימום פליטה פלואורסצנטית ב 651 ננומטר ו 684 ננומטר לחשוף כי האנרגיה שנקטפו על ידי phycocyanin הועבר ביעילות allophycocyanin ופולטים מסוף, שהם ApcD ו ApcE, בליבה. האיור מראה אבץ מוכתם SDS-PAGE תחת הקרנת UV שבו יחידות המשנה phycobiliprotein הם פלואורסצנטיים מאוד ApcE הראה פלואורסצנטיות חלשה, המצוין עם החץ.

כתמים כחולים Kumasi מראה כי השברים העליונים מכילים חלבונים אחרים שאינם מסיסים במים PBS ו- PBS ו- Syn6803 שלמים מציגים רצועת ApcE בולטת, המצוינת בחץ, חסרה שברי PBS מנותקים. Ultracentrifugation מדגים כי שיפוע סוכרוז מוכן ביחס של 1:3 מציג רצועות רחבות יותר מאשר שיפוע עשה ביחס של 1:10. חשוב לתדלק את התאים ואת solvolysis supernatants לחלוטין כדי להשיג יותר phycobilisomes.

שיטות אחרות, כמו cryo-EM או ספקטרומטריה מעורבת, ניתן להשתמש כדי ללמוד את מבנה החלבון או את הרכב החלבון של phycobilisomes.