Name: דור של הוק איסכמיה-רפרפוזיה מודל באמצעות שלושה ימים מתפתח אפרוח עובר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: למדו כיצד ליצור מודל פשוט ויעיל של פגיעת איסכמיה-רפרפוזיה באמצעות עובר אפרוח בן שלושה ימים. שיטה זו מאפשרת מחקר בזמן אמת של מנגנוני פגיעה ומענה תרפויטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו רוצים להביע את הכרת התודה שלנו להארי שנקר על התשומות הביקורתיות שלו במהלך צילום וידאו ועריכה, מר בקר חוסיין לקריינות, מר אסגהאר ריזווי לעריכת וידאו, מר מוחמד היידר לצילומי וידאו, מר מוחמד דני סידיקי לסיוע במהלך הניסויים.

הוועדה הממסדית לאתיקה לבעלי חיים במכללה הרפואית ובבית החולים של Era's Lucknow פרסמה ויתור בכתב לפיו לא נדרש אישור רשמי לביצוע ניסויים אלה בהתאם לוועדה לצורך בקרה ופיקוח על ניסויים בבעלי חיים (CPCSEA). עם זאת, נהלי הפעלה סטנדרטיים בוצעו כדי למזער כל פוטנציאל למצוקה עוברית.
1. הכנת מאגר (טבלה 1)
<ol><li>הכן את הפתרון של רינגר<ol>
<li>כדי להכין את הפתרון של רינגר, להמיס 0.72 גרם של NaCl (123 מ"מ מ"מ), 0.017 גרם של CaCl2 (1.53 מ"מ), 0.037 גרם של KCl (4.96 מ"מ) ב 70 מ"ל של H2O מזוקק סטרילי, עם נפח סופי של 100 מ"ל. כוונן את ה-pH ל-7.4. תן לו להתמוסס לחלוטין ו autoclave. לאחר מכן, לסנן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, aliquot לתוך כמויות חד פעמיות (כ 10 מ"ל) ולאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן תמיסת מלח רגילה (0.9% נתרן כלורי, NaCl).<ol>
<li>ב 70 מ"ל של H2O מזוקק סטרילי, להמיס 0.9 גרם של NaCl (154 mM). האיפור את עוצמת הקול ל- 100 מ"ל. כל נסיעה אוטומטית למשך 15 דקות ב-121 °C (70 °F). התאימו את ה-pH ל-7.4 עם 0.1 N HCl או 0.1 N NaOH במידת הצורך. הפוך 10 mL aliquots בצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל ולאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן 70% אתנול (v/v).<ol>
<li>יש לערבב 70 מ"ל של אתנול טהור (Mol. wt. 46.07 גרם/ליטר) עד 30 מ"ל של H2O סטרילי. התכוננו לפי הצורך או אחסנו בטמפרטורת החדר. אין צורך בחיטוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן 1x תמיסת מלח פוספט (1x PBS).<ol>
<li>הכן 100 מ"ל של 1x PBS על ידי הוספת 0.144 גרם של Na2HPO4·7H2O (5.37 מ"מ), 0.8 גרם של NaCl (136.8 מ"מ), 0.2 גרם של KCl (26.8 מ"מ), 0.2 גרם של KH2PO4 (14. 6 מ"מ) עד 70 מ"ל של מים מזוקקים. להמיס ולהשלים את הנפח ל 100 מ"ל ו autoclave במשך 15 דקות ב 121 °C (70 °F). הביאו את רמת ה-pH ל-7.4, הוסיפו כמה טיפות של 0.1 N HCl או 0.1 N NaOH, במידת הצורך. הפוך aliquots של 10 מ"ל בצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל ולאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. יום 1
<ol><li>מסדרים את כל הכלים הדרושים לעיקור ביצים (70% אתנול, מגבונים לניקוי, מתלה ביצים וסמן OHP).</li>
	<li>נקו את הביצים ל-0 ימים עם 70% אתנול באמצעות מגבונים מנייר טישו. השתמש רק ביצה 0 ימים, כמו ביצים מבוגרות לא יכול להוליד עובר.</li>
	<li>כתוב את התאריך הנוכחי על ביצים עם סמן OHP.</li>
	<li>מניחים את הביצים באינקובטור ביצים שנקבע לטמפרטורה של 36-37 מעלות צלזיוס ורמת לחות של 60%-65%. לדגור על הביצים במשך 24 השעות הבאות.</li>
</ol>3. יום 2
<ol><li>סדר את הציוד הדרוש לנסיגה של 5-6 מ"ל של אלבומין (מספריים חדים קצה, מזרק 5 מ"ל, מחט 18 G, משליך מזרק, וסרט הדבקה).</li>
	<li>לנגב את המספריים כירורגי עם 70% אתנול או לחטא באמצעות autoclave לאחר ניגוב אותם עם 70% אתנול.</li>
	<li>עכשיו לקחת את הביצה מן אינקובטור ביצה 37 °C לספירה עבור שכבות.</li>
	<li>מניחים את הביצה על מתלה ביצים נקי.</li>
	<li>חבר חתיכה קטנה של סרט הדבקה (גודל: כ 1 אינץ 'אורך x רוחב) לקצה הביצה.</li>
	<li>לעשות חור קטן בקצה קליפת הביצה באמצעות מספריים קצה מחודד חד. הכנס מזרק של 5 מ"ל בזווית משוערת של 75°. הערה: מזרק 5 מ"ל מגיע עם מחט 24 G x 1 (סטרילי), אבל זה טוב להחליף את 24 G x 1 מחט עם מחט 18 G x 1.5 (סטרילי). המחט 18 G x 1.5 היא 1.25 x 38 מ"מ רוחב. לכן, זה יקל על הסרת אלבומין.</li>
	<li>לאחר החדרת המחט לתוך שק החלמון, לאט לסגת 5-6 מ"ל של אלבומין. הערה: זה מספק לעובר מיטה שעליה הוא יכול לגדול. משיכת אלבומין מונעת ספיגת יתר של אלבומין בעת הקמת חלון. לבסוף, הסיכון של העובר להיפגע במהלך החלון הוא מקל על ידי ביטול 5-6 מ"ל של אלבומין.</li>
	<li>לאחר הסרת האלבום, לאחם מחדש את הפתח עם סרט הדבק ולהשאיר את הביצים לדגור ב 37 °C (48 °F).</li>
</ol>4. יום 4
<ol><li>הכן את הפתרון של הצלצול, 0.9% תמיסת מלח רגילה, ו- PBS 1x כמתואר בסעיף 1 של הפרוטוקול. לאחר מכן, תבודדו אוטומטית את שלושת הפתרונות. לאחר autoclaving, למקם את הפתרון המתאים בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מוציאים את הביצה מאינקובטור הביצים 37 מעלות צלזיוס וחותכים את הקליפה לצורה מעגלית. לפני חיתוך קליפת הביצה, לכסות את האזור כדי להיות חתוך עם סרט דבק. הערה: כיסוי אזור החלון בסרט דבק מונע שבירת קליפת הביצה למקומות לא רצויים. עם זאת, אם אתה פורץ למקום לא רצוי, לאטום את האזור עם סרט הדבק. כיסוי המקומות לחיתוך בנייר דבק מונע מחתיכות קליפה ליפול על שק החלמון.</li>
	<li>צור חור קטן בקליפת הביצה עם מספריים מחודדים בחדות במקום שבו החלון הרצוי ולהתחיל לחתוך פתח מעגלי. תהליך זה נקרא חלון. הערה: ודא כי החתך המעגלי גדול מספיק כדי לאפשר גישה קלה לעובר מכל כיוון. במידת הצורך, לשנות את תנוחת הביצה כדי להתאים את המיקום של העובר.</li>
	<li>לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ כירורגי זום סטריאו, לאתר את העורק vitelline הנכון (RVA). הערה: עוברי עוף בדרך כלל עוברים פיתול בית החזה (יחד עם כיפוף צוואר הרחם, וכו ') כפי שהם מתפתחים, כך הצד השמאלי של הראש הוא נגד החלמון בשלב 72 שעות. באופן יותר ערמומי, כאשר עורקי הרטט יוצאים מהגוף, העובר אינו מעוות בהרבה, וחלק זה של הגוף שוכב בצד הגחון כלפי מטה לכיוון החלמון. לכן, בצפייה ישירה, זכות העובר היא מימין לחוקר.</li>
	<li>לאחר מיקום ה-RVA, צרו שני חורים קטנים בצד שמאל ובצד ימין של ה-RVA באמצעות מחט 26 G (איור 2).</li>
	<li>הנח את בדיקת הדמיית זרימת הדם דופלר מעל RVA. ודא כי בדיקת הדמיית זרימת הדם דופלר ממוקמת 5 ± 1 מ"מ מאתר איסכמיה ולקראת הקצה הדיסטלי של RVA. קח קריאת שטף במשך 2 דקות ו 30 s (או יותר אם תרצה). זו תהיה קריאת השלב הנורמוקסית.</li>
	<li>בינתיים, באמצעות צבת האף ומלקחיים עם שיניים, עיצבו ידנית את קצה מחט עמוד השדרה בצורת וו (איור 3). לעשות זאת על ידי כיפוף הקצה של מחט עמוד השדרה עבור כ 1 מ"מ. גודל גדול יותר יקשה על החדרה והסרה של מחט עמוד השדרה במהלך הליך ה- I/R.</li>
	<li>הכנס את מחט עמוד השדרה ישירות מתחת לעורק הרטט הימני באמצעות מיקרו-מניפולטור. הערה: הכנס את מחט עמוד השדרה בזהירות רבה כדי למנוע פגיעה ב- RVA או בעורקים סמוכים. הטכניקה האופטימלית היא להתאים את הוו המותאם אישית של מחט עמוד השדרה בדיוק מעל הצד הימני של חור ה- RVA, ולאחר מכן להכניס בהדרגה את הקצה המותאם אישית של מחט עמוד השדרה לתוך שק החלמון בסיוע מיקרו-מניפולטור בהנחיית מיקרוסקופ כירורגי זום סטריאו דרך החור הימני. ברגע שהקרס של מחט עמוד השדרה נמצא בשכבת החלמון, התאם בהדרגה את הוו מתחת ל- RVA כך שהקצה שלו ממוקם בדיוק מתחת לחור השמאלי. עכשיו זה הזמן להרים את מחט עמוד השדרה.</li>
	<li>עכשיו, בסיועו של micromanipulator, בהדרגה להרים את העורק עד שטף זרימת הדם דופלר מצביע על ירידה מינימלית של 80% בזרימת העורקים.</li>
	<li>לאחר ירידה של 80% או יותר בשטף דופלר מושגת, להשאיר את מחט עמוד השדרה הרים (מושך את העורק כלפי מעלה) במשך 5 דקות. זו תהיה תקופת איסכמיה ב- RVA. הערה: זה קריטי כדי לפקח על שטף דופלר במהלך איסכמיה. אם נמצאה כמות משמעותית של תנודות, סיים את הבדיקות.</li>
	<li>לאחר תקופת איסכמיה של 5 דקות, שחררו בהדרגה את העורק כדי לשחזר את רמות זרימת הדם הרגילות. ודא קריאת מד זרימת דם דופלר מציג ערכים דומים לאלה שהושגו במהלך נורמוקסיה. זו תהיה תקופת הרפרפוזיה ב-RVA (איור 4).</li>
	<li>לאחר הליך I/R, להחיל כמה טיפות (2-3) של 1x PBS לעובר ולצפות בו במשך 2-3 דקות. הערה: השימוש ב- 1x PBS מסייע במניעת התייבשות העובר.</li>
	<li>לבסוף, לאחסן מחדש את החלון עם סרט דבק ולהניח את הביצה בחזרה באינקובטור הביצים במשך 5 שעות ו 55 דקות.</li>
	<li>לאחר 5 שעות ו -55 דקות, לקחת את הביצה מן אינקובטור הביצה, למקם אותו על מדף הביצים, לפתוח מחדש את החלון, ופעל לפי פרוטוקול הטיפול במורד הזרם.</li>
</ol>5. טיפולים
<ol><li>לטיפול בעורקים עם תרופות, מפעילים או מעכבים, excise את RVA לאחר 1 שעה של תהליך I/R.</li>
	<li>עבור מחקרים במורד הזרם, הראשון להסיר את העובר מן קליפת הביצה על ידי הצבתו על צלחת פטרי סטרילי 90 מ"מ.</li>
	<li>לאחר העובר משתחרר לתוך צלחת פטרי, excise RVA באמצעות קשתית העין תחת הדרכתו של מיקרוסקופ כירורגי זום סטריאו.</li>
	<li>ודא כי ממד כריתה של RVA הוא עד 15 ± 1 מ"מ (distal מן תא המטען), 5 ± 1 מ"מ כל בצד שמאל וימין של העורק, ו 2 ± 1 מ"מ לכיוון תא המטען. הערה: ניתן להשתמש בסרגל כדי למדוד את האזור שיש לסלקו (אופציונלי).</li>
	<li>לאחר כריתת RVA, לשטוף אותו עם 1x PBS בצלחת פטרי סטרילית המכילה 1x PBS.</li>
	<li>עבור הטיפולים הרצויים, מניחים את העורק בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל (מעוקר) מלא 500 μL של הפתרון של רינגר. מניחים את RVA בצינור הצנטריפוגה ומניחים אותו בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות ו -55 דקות. הערה: בהתאם לטיפולים, או להשתמש בתמיסה של רינגר ללא כל טיפול, או טיפול עם הנפח הרצוי וריכוז של תרופה, מפעיל, או מעכב.</li>
	<li>לאחר 5 שעות ו 55 דקות של דגירה, להוציא את RVA מן החממה במעבדה 37 °C, ולהמשיך עם הטיפולים הרצויים.</li>
</ol>

<ol><li>Fauzia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+Embryo%3A+A+Preclinical+Model+for+Understanding+Ischemia-Reperfusion+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism.</a> Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034(2018).</li>
<li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Raza, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+naringenin+is+mediated+through+suppression+of+NF-%CE%BAB+signaling+pathway+in+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke.</a> Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).</li>
<li>Raza, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hesperidin+ameliorates+functional+and+histological+outcome+and+reduces+neuroinflammation+in+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke.</a> Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).</li>
<li>Raza, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silymarin+protects+neurons+from+oxidative+stress+associated+damages+in+focal+cerebral+ischemia%3A+a+behavioral%2C+biochemical+and+immunohistological+study+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats.</a> Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).</li>
<li>Fan, L., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AG490+protects+cerebral+ischemia%2Freperfusion+injury+via+inhibiting+the+JAK2%2F3+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway.</a> Brain and Behavior. 11 (1), 01911(2021).</li>
<li>Wu, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Mechanistic+Concepts+in+Ischemia+and+Reperfusion+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).</li>
<li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology%2C+clinical+manifestations%2C+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li>
<li>Allen, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+as+in+vitro+models+for+drug+screening+and+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+and+Industrial+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).</li>
<li>Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+modulate+heat+shock+protein+expression+and+enhance+retinal+ganglion+cell+survival+after+transient+retinal+ischemia%2Freperfusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).</li>
<li>Huang, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+and+meta-analysis+of+acupuncture+for+improving+learning+and+memory+ability+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complementary+and+Alternative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297(2016).</li>
<li>Sommer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke%3A+Experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).</li>
<li>Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+targets+for+treating+ischemia-reperfusion+injury+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302(2018).</li>
<li>Seabra, R., Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+research+using+early+life+stage+models%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">In vivo research using early life stage models.</a> In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+peptide+alleviates+oxidative+stress+and+NLRP3+inflammasome+activation+after+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+by+regulating+AMPK%2FGSK-3beta%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta.</a> Experiments in Neurology. 329, 113302(2020).</li>
<li>Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lavender+oil+%28Lavandula+angustifolia%29+attenuates+renal+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rats+through+suppression+of+inflammation%2C+oxidative+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).</li>
<li>Wallert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Tocopherol+preserves+cardiac+function+by+reducing+oxidative+stress+and+inflammation+in+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury.</a> Redox Biology. 26, 101292(2019).</li>
<li>Ashafaq, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catechin+hydrate+ameliorates+redox+imbalance+and+limits+inflammatory+response+in+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia.</a> Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lung+metastasis+in+mouse+mammary+tumor+models+by+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53329(2016).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathelicidin+aggravates+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury+via+activating+TLR4+signaling+and+P2X%287%29R%2FNLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75(2020).</li>
<li>Franke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NLRP3+inflammasome+drives+inflammation+in+ischemia%2Freperfusion+injury+after+transient+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behaviour+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Brain Behaviour and Immunity. 92, 223(2021).</li>
<li>Lawrence, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+factor+NF-kappaB+pathway+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651(2009).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pterostilbene+attenuates+astrocytic+inflammation+and+neuronal+oxidative+injury+after+ischemia-reperfusion+by+inhibiting+NF-kappaB+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2408(2009).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sivelestat-loaded+nanostructured+lipid+carriers+modulate+oxidative+and+inflammatory+stress+in+human+dental+pulp+and+mesenchymal+stem+cells+subjected+to+oxygen-glucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C+Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700(2021).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+enhances+autophagy+in+stem+cells+through+Erk1%2F2+signaling+pathway+-+implications+for+neurotransplantations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li>
<li>Ahmad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin-coated+polycaprolactone+nanoparticle-mediated+naringenin+delivery+rescue+human+mesenchymal+stem+cells+from+oxygen+glucose+deprivation-induced+inflammatory+stress%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).</li>
<li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroprotective+effects+of+carvacrol+on+ischemia%2Freperfusion-induced+hippocampal+neuronal+impairment+by+ferroptosis+mitigation%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science%22%5BJournal%5D)">The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation.</a> Life Science. 235, 116795(2019).</li>
<li>Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+irisin+against+cerebral+ischemia%2F+reperfusion+injury+via+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452(2019).</li>
<li>Wainrach, S., Sotelo, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+study+of+the+developing+chick+embryo+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+fur+Zellforschung+und+mikroskopische+Anatomie%22%5BJournal%5D)">Electron microscope study of the developing chick embryo heart.</a> Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).</li>
<li>Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+the+terminal+enzyme+of+the+stearoyl+coenzyme+A+desaturase+system+using+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes.</a> Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).</li>
<li>Kain, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+as+an+expanding+experimental+model+for+cancer+and+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research.</a> Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).</li>
<li>Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+in+the+u%7Ee+of+the+early+chick+embryo+88+a+teratological+model%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model.</a> Teratology. 7, 22-23 (1973).</li>
<li>Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+English+and+Translation+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro models of ischemia-reperfusion injury.</a> Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).</li>
<li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cerebral+ischemia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Animal models of cerebral ischemia: A review.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686(2020).</li>
<li>Bromage, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+ischaemic+conditioning+reduces+infarct+size+in+animal+in+vivo+models+of+ischaemia-reperfusion+injury%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracardiac+blood+flow+patterns+related+to+the+yolk+sac+circulation+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo.</a> Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((angiogenesis-inflammation+cross+talk+in+diabetic+retinopathy%3A+novel+insights+from+the+chick+embryo+chorioallantoic+membrane%2Fhuman+vitreous+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform.</a> Frontiers in Immunology. 11, 581288(2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

מטרת מחקר איסכמיה-רפרפוזיה היא ליצור אסטרטגיות טיפוליות המונעות מוות של תאים ומקדמות התאוששות29,30. כדי להתגבר על האילוצים הנוכחיים במחקר I/R, עיצבנו מודל של עובר של הוק I/R כדי לייצר מודל I/R אמין ושחזורי. למיטב ידיעתנו, מודל ה- I/R הראשון שנוצר אי פעם בעובר אפרוח בן 3 ימים לניסויי I/R שגרתיים, מלבד לימוד אותות מתח (למשל, מתח חמצוני ודלקתי). בהתחשב ביתרונות הגודל והנגישות ביום 3 של development31, העובר האפרוח שימש בשלב התפתחותי של 72 שעות...

פגיעה ברקמת איסכמיה-רפרפוזיה נקשרה למספר פתולוגיות, כולל התקפי לב, שבץ איסכמי, טראומה ומחלות כלי דם היקפיות1,2,3,4,5. זאת בעיקר בשל חוסר הבנה מקיפה של התקדמות המחלה והיעדר מודל מחקר יעיל. פגיעה איסכמית מתרחשת כאשר אספקת הדם לאזור מסוים של הרקמה מנותקת. כתוצאה מכך, רקמה איסכמית בסופו של דבר נמק, אם כי הקצב משתנה בהתאם לרקמה. לפיכך, שיקום אספקת הדם עשוי לעזור למתן את הנזק. עם זאת, נצפתה, במקרים מסוימים, כי רפרופוזיה גורמת יותר נזק לרקמות מאשר איסכמיה לבד עושה 6,7,8. לכן, הבנת המנגנונים המולקולריים והתאים של איסכמיה-רפרפוזיה נדרשת לפתח התערבות טיפולית יעילה. נכון לעכשיו, לא ידוע על טיפול יעיל לפציעות מס 30. פער זה הניע את יצירתם של מודלים ניסיוניים חדשים, החל מהפריה ויטרו ועד דגמי ויוו, כדי לטפל בבעיה הקיימת9,10,11,12,13.
עוברים אפרוח (Gallus gallus domesticus) נמצאים בשימוש נרחב במחקר בגלל קלות הגישה שלהם, מקובלות אתית, גודל גדול יחסית (בהשוואה לעוברים אחרים), עלות נמוכה, וצמיחה מהירה14. השתמשנו בעובר אפרוח בשעה 72 שעות של פיתוח כדי ליצור I/R ovo על ידי חסימת ושחרור העורק vitelline הנכון בסיוע מחט עמוד השדרה. קראנו לו מודל איסכמיה-רפרפוזיה הוק-I/R (איור 1). המודל המשמש במחקר זה מסוגל לדמות במדויק את כל התהליכים במורד הזרם, כולל מסלולים חמצוניים ודלקתיים, הקשורים לעתים קרובות לנזקי I/R15,16,17.

<table><tbody><tr><td>(-80&deg; ג) מקפיא</td><td>Haier,</td> <td>סין-1.5</td><td></td></tr> <tr><td>מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>TARSONS, הודו</td><td>500010X</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחת פטרי (סטרילית)</td> <td>Tarsons, הודו</td><td>460050</td><td></td></tr><tr><td>18G מחט (18G&times; 1.5 (1.25 ופעמים; 38 מ"מ)</td> <td>רמסונס, הודו</td><td>13990</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>DISPO</td> <td>VAN-26G</td><td></td></tr> <tr><td>מחט (26G& 1/2 (10.45x13 מ"מ)</td> <td>DISPO VAN, הודו</td><td>30722D</td><td></td></tr><tr><td>37&deg; חממת ביצים C עם אחוז לחות מתכוונן</td><td>Gentek, הודו</td><td>GL-100</td><td></td></tr><tr><td>37&deg; חממת מעבדה C</td><td>SCIENCE TECH, הודו</td><td>CB 101-14</td><td></td></tr><tr><td>3-מתילאדנין (3-MA)</td><td>סיגמא אולדריץ', ארה"ב</td><td>M9281</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל פיפטת מרעה</td><td>TARSONS, הודו</td><td>940050</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל</td><td>TARSONS,</td> <td>הודו-מזרק</td><td></td></tr> <tr><td>5 מ"ל</td><td>DISPO VAN, הודו</td><td>IP53</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>Merck Millipore, ארצות הברית</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>סרט דבק / סרט צ'לו</td><td>זריחה,</td> <td>הודו-אמברה</td><td></td></tr> <tr><td>1 פריימרים</td><td>יישומיים ביוסיסטמס, פוסטר סיטי, ארה"ב</td><td>Hs00387943_m1</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיית איתות תאי</td><td>IgG נגד עכברים</td>, ארה"ב <td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories, ארה"ב</td><td>711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>Atg7</td><td>R& D Systems, ארה"ב</td><td>MAB6608</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים Atg7</td><td>Applied Biosystems, פוסטר סיטי, ארה"ב</td><td>Hs00893766_m1</td><td></td></tr><tr><td>תיק חיטוי</td><td>Tarsons, הודו</td><td>550022</td><td></td></tr><tr><td>מכונת חיטוי</td><td>תוצרת מקומית, לאקנאו,</td><td></td> הודו-Beclin-1 <td></td></tr><tr><td></td><td>Proteintech, ארה"ב</td><td>66665-1-IG</td><td></td></tr><tr><td>בטא אקטין</td><td>ImmunoTag, ארה"ב</td><td>ITT07018</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Himedia, מומבאי, הודו</td><td>TC194</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>Himedia, מומבאי, הודו</td><td>GRM534</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>ImmunoTag, ארה"ב</td><td>ITT5155</td><td></td></tr><tr><td>מגבוני ניקוי</td><td>קימברלי-קלארק, הודו</td><td>370080</td><td></td></tr><tr><td>Cleaved Caspase3</td><td>ImmunoTag, ארה"ב</td><td>ITT07022</td><td></td></tr><tr><td>די-נתרן מימן פוספט heptahydrate</td><td>Himedia, מומבאי, הודו</td><td>GRM39611</td><td></td></tr><tr><td>מד זרימת דם דופלר</td><td>מכשיר Moors, בריטניה</td><td>moorVMS-LDF1</td><td></td></tr><tr><td>מתלה ביצים</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מתלה ביצים</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GAPDH</td><td>ImmunoTag, ארה"ב</td><td>M1000110</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים GAPDH</td><td>Applied Biosystems, פוסטר סיטי, ארה"ב</td><td></td><td></td>Hs02758991_g1</tr><tr><td>Glycine</td><td>Himedia, מומבאי, הודו</td><td>MB013</td><td></td></tr><tr><td>מגש כליות</td><td>HOSPITO-LC3A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>/B</td><td>טכנולוגיית איתות תאים, ארה"ב</td><td>4108S</td><td></td></tr><tr><td>מעבדות מתנול</td><td>Rankem, מומבאי, הודו</td><td>M0252</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Narishige, יפן</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC)</td><td>סיגמא אולדריץ', ארה"ב</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>Naringenin</td><td>Sigma Aldrich, ארה"</td>ב <td>67604-48-2</td><td></td></tr><tr><td>NF-k&beta;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב</td><td>51-0500</td><td></td></tr><tr><td>NLRP3</td><td>ImmunoTag, ארה"ב</td><td>ITT07438</td><td></td></tr><tr><td>צבת אף</td><td>תוצרת מקומית, לאקנאו,</td> <td>הודו-מלקחיים</td><td></td></tr> <tr><td>עיניים</td><td>סטולטינג, גרמניה</td><td>52106-40</td><td></td></tr><tr>מכשירים כירורגיים<td>לקשתית העין</td><td>, ג'איפור, הודו</td><td>מספריים מיקרו מספריים לגיל קשה בזווית 8 ס"מ / 3 1/8 אינץ'</td><td></td></tr> <tr><td>OHP עט טוש</td><td>Camlin,</td><td></td> הודו-ORP-150 <td></td></tr><tr><td></td><td>ImmunoTag, ארה"ב</td><td>ITT08329</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מחודדים בקצה חד</td><td>Stoelting, גרמניה</td><td>52132-11</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Himedia, מומבאי, הודו</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט חד בסיסי</td><td>נטול מים Himedia, מומבאי, הודו</td> מעכב פרוטאז <td>MB050</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam, ארצות הברית</td><td>Ab65621</td><td></td></tr><tr><td>SOD-1</td><td>ImmunoTag, ארה"ב</td><td>ITT4364</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק, מומבאי, הודו</td><td>27605</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Himedia, מומבאי, הודו</td><td>GRM886</td><td></td></tr><tr><td>מחט עמוד השדרה 25GA; 3.50 אינץ' (90.51 X 90 מ"מ)</td> <td>רמסון, הודו</td><td>GS-2029</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כירורגי סטריאו זום</td><td>אולימפוס, יפן</td><td>SZ2-STU3</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים</td><td>BIOHAZARD</td><td>882210</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עם שיניים</td><td>Stoelting, גרמניה</td><td>52102-30</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>G Biosciences, ארצות הברית</td><td>RC1217</td><td></td></tr><tr><td>Tris Hydrochloric Acid Himedia</td><td>, מומבאי, הודו</td><td>MB030</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>G Biosciences, ארצות הברית</td><td>RC1227</td><td></td></tr><tr><td>ביצי עוף לגהורן לבן 0 יום</td><td>-</td><td>-</td>Z-Val-Ala-Asp <td></td></tr><tr><td>(OMe)-FMK</td><td>MP Biomedicals, LLC, ארה"ב</td><td>FK009</td><td></td></tr></tbody></table>

דור של הוק איסכמיה-רפרפוזיה מודל באמצעות שלושה ימים מתפתח אפרוח עובר

Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo

הפרעות איסכמיה ורפרפוזיה (I/R), כגון אוטם שריר הלב, שבץ ומחלות כלי דם היקפיות, הן חלק מהגורמים המובילים למחלות ומוות. מודלים רבים במבחנה וב-in vivo זמינים כיום לחקר מנגנון ה-I/R במחלות או ברקמות פגומות. עם זאת, עד כה, לא דווח על מודל Ovo I/R, אשר יאפשר הבנה טובה יותר של מנגנוני I/R הקרנת סמים מהירה יותר. מאמר זה מתאר מידול I/R באמצעות וו מותאם אישית של מחט עמוד השדרה בעובר אפרוח בן 3 ימים כדי להבין מנגנוני פיתוח וטיפול במנת מ"ר. המודל שלנו יכול לשמש כדי לחקור אנומליות ברמות ה- DNA, הרנ"א והחלבון. שיטה זו פשוטה, מהירה וזולה. ניתן להשתמש במודל הנוכחי באופן עצמאי או בשילוב עם דגמי הפריה ויטרו קיימים ובדגמי I/R של vivo.

טכניקת הדמיית זרימת הדם דופלר שימשה להערכת האפקטיביות של המודל שלנו. בקיצור, השווינו את הנתונים מקבוצת הביקורת עם הנתונים מקבוצת RVA כדי לקבוע את הצלחת היצירה שלנו. איור 4A מתאר שטף אופייני הקשור לחית השליטה, ואילו איור 4B מתאר את התוצאות שהתקבלו מ-RVA. המספר 1-8 מייצג את האירועים השונים המשויכים לשלבי I/R. בקצרה, מספר 1-3 מתאים לשלב הנורמוקסיה, בעוד ירידה חדה בשטף בנקודות 3 ו -4 מייצגת את האירועים הקשורים לירידה בזרימת הדם ב- RVA. לאחר שהושגה ירידה של 80% ומעלה...

מאמר זה מתאר איסכמיה-reperfusion (I/R) דוגמנות בעובר אפרוח 3 ימים באמצעות מחט עמוד השדרה מותאם אישית וו כדי להבין טוב יותר את התפתחות I / R וטיפול. דגם זה פשוט, מהיר וזול.

Ischemia and reperfusion (I/R) disorders, such as myocardial infarction, stroke, and peripheral vascular disease, are a few of the leading causes of ...

היי, אני ד"ר סעיד שאדאב רזא, החוקר הראשי של המעבדה לתאי גזע ונוירולוגיה משקמת, הממוקמת במחלקה לביוטכנולוגיה בקמפוס אוניברסיטת עידן, לאקנאו, הודו. במעבדה שלי, אנו שואפים להבין את המנגנון הפתופיזיולוגי שבבסיס הפרעות איסכמיה-רפרופסיה ואת ההתערבויות שיכולות להפוך תהליכים אלה. בהקשר זה, אנו מעסיקים לעתים קרובות את ההפריה המו ויטרו ואת מודל in vivo של שבץ איסכמי.לאחרונה, יצרנו מודל לפציעה איסכמית-רפרפוזיה בשלושה ימים בפיתוח עובר אפרוח. אז עכשיו התלמידים שלי יראו לכם איך לשכפל את הפציעה של איסכמיה-רפרופוזיה בעובר אפרוח מתפתח של שלושה ימים. עכשיו אנחנו הולכים להראות לכם איך ליצור איסכמיה-רפרפוזיה בעובר אפרוח של שלושה ימים.המודל שלנו חסכוני, יעיל בזמן ושחזורי מאוד. אז בואו נתחיל. היום הראשון.דרישות ליום הראשון. פרוצדורה. נקו את ביצת האפס יום עם 70% אתנול באמצעות מגבונים מנייר טישו. לאחר מכן, לכתוב את היום הנוכחי, תאריך, על ביצים עם סמן OHP ולאחר מכן למקם את הביצים באינקובטור ביצה עם טמפרטורה של 36 עד 37 מעלות צלזיוס ו 60 עד 65% לחות.לדגור על הביצים במשך 24 השעות הבאות. היום השני. דרישות ליום השני. פרוצדורה.נגב את המספריים הניתוחיים עם 70% אתנול או ואחריו אוטוקלבה. לאחר 24 שעות של דגירה, להסיר את הביצה מתוך האינקובטור עבור שכבות. לאחר מכן, לצרף חתיכה קטנה של Sellotape כ אורך ורוחב של סנטימטר אחד לקצה הביצה ולאחר מכן לעשות חור קטן בקצה קליפת הביצה באמצעות מספרי קצה מחודד חד ואחריו החדרת מזרק חמישה מ"ל בזווית של כ 75 מעלות.לאחר החדרת המחט לתוך שק החלמון, לאט למשוך חמישה עד שישה מ"ל של אלבומין. לאחר הסרת האלבום, חסן מחדש את החור עם Sellotape והחזיר את הביצה לתוך 37 מעלות צלזיוס ביצה אינקובטור במשך 48 השעות הבאות. היום הרביעי.דרישות ליום הרביעי. פרוצדורה. הכן את תמיסת הצלצול, 0.9% תמיסת מלח רגילה ותמיסת מלח חיץ X פוספט אחת לפי הטבלאות המופיעות בכתב יד זה. לאחר מכן תבודדו אוטומטית את שלושת הפתרונות.לאחר autoclave, הפתרונות המתאימים עשויים להיות ממוקמים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוציא את הביצה מן אינקובטור ביצה 37 מעלות. עכשיו, לפני חיתוך הקליפה, לכסות את האזור של חלונות עם Sellotape.ועכשיו לעשות חור קטן על קליפת הביצה ולהתחיל לחתוך פתח מעגלי. תהליך זה נקרא חלון. ודא כי החתך המעגלי הוא גדול מספיק, כך העובר יכול בקלות להיות נגיש מכל כיוון, כמו המיקום של הביצה ייתכן שיהיה צורך להתאים לפי המיקום של העובר.עכשיו, באמצעות מיקרוסקופ כירורגי זום סטריאו, לאתר את העורק החיוני הנכון או RVA. כאן, החץ מציין את השלב ההתפתחותי בן שלושת הימים של העובר. לאחר RVA ממוקם, עם השימוש מחט 26 G לעשות שני חורים קטנים בצד שמאל וימין של RVA.לאחר מכן, להתאים את בדיקת הדמיית זרימת הדם דופלר על RVA. יש למקם את בדיקת הדמיית זרימת הדם דופלר חמישה פלוס מינוס מילימטר אחד מאתר איסכמיה ושני שלישים מהקצה הדיסטלי של ה- RVA. קח קריאת שטף במשך 30 שניות עד שתי דקות, לפי הצורך.זה יגרום לקריאת שלב הנורמוקסיה. עכשיו לעצב באופן ידני את קצה מחט עמוד השדרה כדי לתת לקצה צורה של וו בעזרת צבת האף ואחריו מלקחיים שיניים. עכשיו, באמצעות מיקרו מניפולטור, להכניס את מחט עמוד השדרה ממש מתחת לעורק החיוני הנכון.אתה מוכן להרים את מחט עמוד השדרה. עכשיו בסיועו של מניפולטור מיקרו, לאט להרים את העורק עד שטף זרימת הדם דופלר מראה ירידה מינימלית של 80% בזרימת העורקים. לאחר ירידה של 80% או יותר בשטף דופלר מושגת, להשאיר את מחט עמוד השדרה הרים כלפי מעלה, מושך את העורק במשך חמש דקות.זו תהיה תקופת איסכמיה. לאחר תזמון איסכמי זה של חמש דקות, לאט לשחרר את העורק בעזרת מיקרו מניפולטור כדי לשחזר את רמות זרימת הדם נורמלית. עכשיו מד זרימת הדם דופלר צריך להראות קריאות דומות לאלה שנצפו במהלך נורמוקסיה.זו תהיה תקופת הרפרפוזיה ב- RVA. לאחר תהליך ה- I/R, יש למרוח שתיים, שלוש טיפות של PBS 1X על העובר. לבסוף, לסגת מחדש את החלון עם Sellotape ולאחר מכן למקם את הביצה בחזרה בחממת הביצים במשך חמש שעות ו 55 דקות.לאחר חמש שעות ו -55 דקות, להוציא את הביצה מן אינקובטור הביצה ומניחים על מגש הביצים ולפתוח מחדש את החלון. דרישות הטיפול. פרוצדורה. לטיפול בעורקים עם התרופות, המפעילים או המעכבים, יש לחתוך את ה- RVA לאחר שעה אחת של תהליך I/R.מוציאים את העובר מהקליפה על ידי הוצאתו מהקליפה לצלחת פטרי סטרילית של 100 מ"מ. לאחר העובר משתחרר בצלחת פטרי, excise את RVA באמצעות קשתית העין בהנחיית מיקרוסקופ כירורגי זום סטריאו. ממד כריתת הצואה של RVA צריך להיות עד 15 פלוס מינוס דיסטלי מילימטר אחד מתא המטען ושניים פלוס מינוס מילימטר אחד לכיוון תא המטען.לאחר כריתת RVA, לשטוף אותו עם 1X PBS בצלחת פטרי חדשה, סטרילי. לטיפולים הרצויים, יש לשים את העורק בצינור צנטריפוגה מעוקר של 1.5 מיליליטר מלא ב-500 מיקרוליטרים של הפתרון של רינגר. ואחרי הנחת העורק בצינור הצנטריפוגה, הכניסו לאינקובטור המעבדה הצנטריגרדי 37 מעלות במשך חמש שעות.לאחר חמש שעות של דגירה, להוציא את RVA מן החממה מעבדה Centigrade 37 מעלות ולהמשיך לטיפולים הרצויים. ועכשיו, כדי להציג את התוצאות. כדי לאמת את התועלת של המודל שלנו במחקר איסכמי-reperfusion בעורקים איסכמיים, תחילה הסתכלנו על הפעילות של חלבונים רגולטוריים חמצן 150 או ORP150, ציטופלסמוס סופראוקסיד dismutase אחד או SOD1 וקטלסה.RVAs שטופלו ב- I/R הראו פעילות מוגברת של ORP150, SOD1 ציטופלסמי וקטלאז בהשוואה לקבוצת הביקורת, עם זאת, שכשהם עם N-אצטיל-L-ציסטאין, או NAC, ROS quencher, הפחתת סטרס חמצוני בקבוצת I /R, כפי שניתן לראות באיור הנוכחי. כדי לבסס את כלי השירות של מודל זה עבור חקירות דלקתיות, בדקנו את הביטוי של I /R-1 בטא ו- TNF-אלפא ב- RVAs שטופלו ב- I /R לעומת RVAs בקרה. שני האינטרלוקים נמצאו מבוטאים יתר על המידה בקבוצת הוק-I/R בהשוואה לקבוצת הביקורת.תוספי Naringenin, תרופה אנטי דלקתית, הפחית באופן משמעותי את רמות IL1-בטא, כמו גם TNF-אלפא. לאחר מכן, בדקנו את הביטוי של NLRP3 ו- NF-kappa beta באמצעות סופג מערבי. ניתוח זה גילה ראיות להפעלה של NLRP3 מודלק, כמו גם NF-kappa בטא בתגובה I / R המיוצר RVA.בדומה לתוצאות קודמות, Naringenin הפחית את הביטוי של NLRP3 ו- NF-kappa בטא. תוצאות אלה הראו כי המודל שלנו יכול לשמש כדי לחקור שינויים דלקתיים. לאחר מכן, בדקנו את ההשפעה של I/R על אפופטוזיס ומסלולים autophagy.ראשית, באיור א', ניגשנו לביטוי של קספאזה-3. ראינו ביטוי משופר של caspase-3 מחשוף בקבוצת קלט/פלט בהשוואה לקבוצת הביקורת, בעוד שקבוצת הקלט/R שקיבלה ZVADFMK הראתה ירידה בביטוי של caspase-3. באופן דומה עבור autophagy, קבוצת I/R הציג רמות חלבון גבוהות של LC3, סמן autophagosome Beclin-1, רגולטור מפתח של אוטופגיה בתאי יונקים, ו ATG-7, חלבון הנדרש עבור autophagy בסיס, מאשר קבוצת הביקורת, בעוד הקבוצות המקבלות 3-ma, מעכב autophagy, הראו ירידה בביטוי של שלושת חלבונים autophagy לעיל, כפי שניתן לראות מהנתונים B עד D.הדמות E מדגימה את ההשפעה של I/R בתיווך הוק על רמות ambra-1 ו- ATG-7 mRNA.תוצאות אלה היו בקנה אחד עם התוצאות הקודמות, כלומר, ביטוי mRNA משופר נצפתה עבור ambra-1 ו ATG-7 ב RVAs שטופלו ב- I/R בהשוואה לפקדים המתאימים שלהם. עם זאת, התוצאות היו הפוכות כאשר 3-ma נוסף לקבוצת I /R. הדמות הנוכחית מייצגת את האפקטיביות של המודל שלנו ללמוד את השינויים בדנ"א.ראינו מריחת דנ"א אינטנסיבית בקבוצה שטופלו ב- I /R בהשוואה לקבוצת הביקורת. עם זאת, התוספת של NAC לקבוצת I/RVA הפכה את התוצאה. כדי לבחון עד כמה המודל שלנו יעיל בניגוד למודלים אחרים, השווינו את הנתונים שנוצרו על ידי מודל Hook-I/R שלנו ומודל MCAO בניסוי הנוכחי.לתקציר, הביטוי של חלבון אפופטוטי, caspase-3 מחשוף, חלבונים autophagy, Beclin-1 ו ATG-7, ואת interleukins דלקתי, TNF ו- IFN, היה חייב להיות גבוה יותר בקרוואנים שטופלו ב- I / R מאשר בקרוואנים בקרה. מעניין, מודל Hook-I/R נתן תוצאות דומות מאוד לאלה שהושגו על ידי מודל MCAO, בין אם זה היה ניתוח עבור מתח דלקתי או מסלולי מוות תאי. המודל שלנו יכול לשמש לניסויים שגרתיים של איסכמיה-רפרופוזיה, לבד או במקביל למודלים הקיימים.עם זאת, במהלך חיקוי איסכמיה-reperfusion, אמצעי זהירות הגבוה ביותר יש לנקוט במהלך ביצוע חורים, בצד ימין ושמאל של RVA, וגם תוך איסור או שחרור RVA, כך שזה לא צריך לפגוע כל עורקים או ורידים. בביולוגיה מולקולרית שגרתית כגון סופג מערבי, מנתח QRT-PCR, חומצות כימיות וטכניקות הדמיה ניתן לאלתר כדי לקשר פתופיזיולוגיה הקשורים איסכמיה-reperfusion בשלושה ימים פיתוח עובר אפרוח. מודל זה יכול לשמש ביעילות לחקר מכניקה מולקולרית ברמות DNA, RNA וחלבון.כפי שהראינו לכם, דוגמנות I/R בשלושה ימים בפיתוח עוברים אפרוחים, אנו מאמינים כי המודל שלנו יפתח אפיקים חדשים בתחום מחקר I/R. עם העבודה הזאת, אני מאחל לך כל טוב לניסויים שלך. תודה.

generation-hook-ischemia-reperfusion-model-using-three-day-developing

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

צ'יק ב electroporation אובו היא טכניקה המאפשרת מניפולציה גנטית של העובר העופות. יישומים נפוצים של טכניקה זו כוללות אנליזה פונקציונלית של גנים המשוערת אלמנטים משפר. וידאו זה מדגים electroporation neural tube אצל ה"ה 10 עוברי אפרוח. טכניקת הזרקת וטיפול נאות ביצה הם דנו.

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

במאמר זה, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לאפשר לטווח...

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

לראשונה אנו מציגים כאן הליך רצועה הניתן לשחזור כדי לשנות את ההמודינמיקה בלב המתפתח ex ovo. זה מושג על ידי כיווץ חלקי של דרכי הזרימה (OFT).

רומן<em&gt; אקס אובו</em&gt; טכניקת פסים לאלטר ופרמטרים המודינמיים intracardiac במערכת עוף עוברי

בשיטה זו, רקמות הלב עובריים הם בניתוח microdissected, חלופה מועדפת, הנקרא fluorescently, מושתל לתוך רקמות עובריים המארח. זה מספק פלטפורמה לומד הפרט או רקמות ברמה התפתחותית הארגון תחת תנאים והמודינמיקה חוץ רחמי, ו/או שינו סביבות paracrine/juxtacrine.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

פרוטוקול זה מתאר שלוש שיטות כיצד להשיג ולהשתמש בעוברי עוף בני 5 עד 8 ימים ובממברנה הכוריאואלנטואית שלהם (CAM) כמודל in vivo לחקר הדמיית אולטרסאונד משופרת ניגודיות ואספקת תרופות בתיווך מיקרו-בועות.

הכנת עוברי עוף אקס אובו וכלי קרום כוריואלנטואיים כמודל In Vivo להדמיית אולטרסאונד משופר ניגודיות ומחקרי אספקת תרופות בתיווך מיקרו-בועות

זוהי שיטה יעילה לסנן מדכאים או נהגים של גרורות סרטן. תאים, המועברים בספריית ביטויים, מוזרקים לתוך כלי הקרום chorioallantoic עוף כדי ליצור מושבות גרורתיות. מושבות שיש להם ירידה או פולשניות מוגברת הם excised, מורחב, reinjected כדי לאשר פנוטיפ שלהם, ולבסוף, מנותח באמצעות רצף תפוקה גבוהה.

גילוי של רגולטורים גרורתיים באמצעות מודל ממברנה צ'יק תוך-ויאטואי מהיר וכמותי

עוברים עוף, כמודל התפתחותי קלאסי, משמשים במעבדה שלנו להערכת cardiotoxicic התפתחותי בעקבות חשיפה מזהמים סביבתיים שונים. שיטות חשיפה ושיטות הערכה מורפולוגיות/פונקציונליות שנקבעו מתוארות בכתב יד זה.

שימוש בעובר עוף ככלי רב עוצמה להערכת לב-קרדיוקסיות התפתחותית

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ניתן לנתח את הקרנית המתחדשת או המשוחזרת במלואה עבור פוטנציאל התחדשות באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.

חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לפיתוח מודל קסנוגרפטינג של קרום כוריואלנטואי אפרוח (CAM) עבור רקמת שחלה אנושית ומדגימים את יעילות הטכניקה, מסגרת הזמן של רה-וסקולריזציה של השתל ויכולת הקיום של הרקמה על פני תקופת השתלה של 6 ימים.

מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח (CAM) ככלי לחקר השתלת רקמת שחלה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חזותי מפורט לביצוע מודל קשירת פרוזדורים שמאלית (LAL) בעובר העופות. מודל LAL משנה את הזרימה התוך-לבבית, אשר משנה את העמסת הלחץ של גזירת הקיר, ומחקה תסמונת לב שמאל היפופלסטית. מוצגת גישה להתגבר על האתגרים של מודל מיקרוכירורגיה קשה זה.

קשירת פרוזדורים שמאלית בעובר העופות כמודל לשינוי עומס המודינמי במהלך התפתחות כלי הדם המוקדמת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת אורגנואידים במוח האנושי בשלבי הבשלה מרובים לתוך קרום כוריואלנטואי אפרוח (CAM). אורגנואידים במוח גודלו בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים לא מונחים.

אורגנואיד מוח אנושי מוקדם לא מונחה מידול נישה נוירו-וסקולרית לתוך קרום עובר אפרוח מתירני Chorioallantoic

למדו כיצד ליצור מודל פשוט ויעיל של פגיעת איסכמיה-רפרפוזיה באמצעות עובר אפרוח בן שלושה ימים. שיטה זו מאפשרת מחקר בזמן אמת של מנגנוני פגיעה ומענה תרפויטי.

דור של הוק איסכמיה-רפרפוזיה מודל באמצעות שלושה ימים מתפתח אפרוח עובר

גלה סרטונים נוספים