אקוסטופורזיס מיקרופלואידי להפרדת זרימה של חיידקים גראם-שליליים באמצעות חרוזי זיקה של אפטמר
17 באוקטובר 2022
מאמר זה מתאר את הייצור וההפעלה של שבבי אקוסטופורטי מיקרופלואידיים באמצעות טכניקת האקוסטופורזיס המיקרופלואידית ומיקרובים שעברו שינוי אפטאמר שיכולים לשמש לבידוד מהיר ויעיל של חיידקים גראם-שליליים ממדיום.
פרוטוקול זה מתאר את טכנולוגיית האקוסטופורזיס המיקרופלואידית שלנו, שיכולה לשמש להפרדה מהירה ויעילה של חיידקים גראם-שליליים ממדיום באמצעות חרוזי מיקרו שעברו עיבוד אפתמר. מערכות אקוסטופורזיס מיקרופלואידיות מאפשרות הפרדת חיידקים גראם-שלילית עם תפוקה סבירה ובידוד תאים ללא מגע. ניתן לייעל את האקוסטופורזיס המיקרופלואידי לבידוד חיידקים מדגימות רפואיות וסביבתיות.
כדי להתחיל, תכננו שבב אקוסטופורזיס מיקרופלואידי שאוסף חרוזי PS בשקע היעד ומשליך את השאר לאחר הזרקת תערובת דגימת PS לכניסת הדגימה. מכינים שבב כשהשכבות מעל ומתחת לשכבת הסיליקון מחוברות לזכוכית הבורוסיליקט. ושכבת זכוכית בורוסיליקט שלישית, באמצעות אנודיזציה, מוסיפה 1000 וולט ו 400 מעלות צלזיוס.
חברו PZT לשכבת הזכוכית הבורוסיליקטית לאורך התעלה המיקרופלואידית באמצעות פחות מ-10 מיקרוליטרים של דבק ציאנואקרילט. לחסן את חיידקי ה-GN וה-GP במדיום לוריא-ברטני ולדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-220 סיבובים לדקה למשך 16 שעות. צנטריפוגה של חיידקים מתורבתים ב 9, 056 RCF במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן יש לשטוף פעמיים עם מאגר PBS 1X. הכן את חיידקי ה- GN וה- GP שנבחרו לניתוח על ידי החייאתם מחדש במאגר הקשירה. יש להשהות את תערובת המיקרו-חרוזים המצופה בסטרפטווידין בגודל 10 מיקרומטר לפני השימוש.
מערבבים את התערובת במשך 20 שניות. הכינו את האפטמר על ידי דנאטציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, ולאחר מכן החזירו אותו לאפס מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. העבירו 250 מיקרוליטרים של תערובת מיקרו-חרוזים מצופה סטרפטאווידין לצינור של 1.5 מיליליטר והוסיפו 100 מיקרוליטרים של אפטמר DNA ביוטינילי לצינור.
לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות תוך סיבוב במהירות של 25 סיבובים לדקה. צנטריפוגה של תערובת התגובה ב 9, 056 RCF במשך 40 שניות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את הצינור פעמיים עם 200 microliters של חיץ Tris-HCl.
הוסיפו 10 מיקרוליטרים של 100 מיליגרם למיליליטר BSA לצינור הדגימה השטוף ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך סיבוב במהירות של 25 סיבובים לדקה. לבסוף, יש לשטוף את חרוזי המיקרו שעברו שינוי אפטמר פעמיים בחיץ Tris-HCl על ידי צנטריפוגה ב-9, 056 RCF למשך 40 שניות בטמפרטורת החדר. חבר צינורות PEEK לשני הפתחים להזרקת שתי דגימות וחיץ, ושני השקעים לאיסוף ופריקה של פסולת.
באמצעות מזרק של 10 מיליליטר, מלאו את תעלת האקוסטופורזיס המיקרופלואידית במים שעברו דה-מינרליזציה ללא בועות. הכן בקר לחץ מדויק עם שני ערוצי יציאה או יותר כדי לשלוט בזרימת הנוזל. לאחר הכנת המכשיר, הזרקת הדגימה והמאגר על ידי הפעלת לחץ של שני קילו-פסקלים על כניסת הדגימה וארבעה קילו-פסקלים לכניסת החיץ באמצעות התקן בקרת הלחץ המדויק.
באמצעות מיקרוסקופ, התמקדו בחרוז והזיזו אותו למרכז התעלה המיקרופלואידית באמצעות ה-PZT. צור תדר תהודה של 3.66 מגה-הרץ באמצעות מחולל פונקציות ערוץ יחיד והגבר אות טיפוסי ב-16 דציבלים באמצעות מגבר הספק. שימו לב לתהליכי ההפרדה וההעשרה על השבב האקוסטופלואידי עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומצלמה במהירות גבוהה הפועלת בקצב של 1, 200 פריימים לשנייה.
השבב האקוסטופורטי שהוצג במחקר זה אישר כי ככל שהמתח של ה- PZT גדל, הריכוז המרכזי של החרוזים בגודל 10 מיקרומטר גדל. בחמישה וולטים של מתח PZT, רוב החרוזים בגודל 10 מיקרומטר התרכזו במרכז. היחס בין מספר החרוזים שנאספו בשקע למספר הכולל של חרוזים מוזרקים בגודל 10 מיקרומטר נקרא קצב ההתאוששות.
היחס בין מספר החרוזים בגודל 10 מיקרומטר למספר הכולל של החרוזים שנאספו נקרא טוהר. התוצאות הצביעו על כך שלמכשיר הייתה יעילות הפרדה גבוהה לחרוזים בגודל של 10 מיקרומטר. המספרים של חיידקי GN ו-GP הקשורים לכל חרוז מיקרו שעבר שינוי אפטמר נמדדו באמצעות מיקרוסקופ עם מצלמה במהירות גבוהה.
כל חמשת חיידקי ה-GN נקשרו לחרוזים, בעוד שפחות חיידקי GP נקשרו באופן משמעותי לחומרים שנבדקו. עוצמת האות הייתה שונה באופן משמעותי בין חיידקי ה-GN וה-GP. יש להשתמש בדבק המשמש לחיבור ה- PZT מעט ככל האפשר לדיוק הקורוגציה וה- PZT והמיקרו-ערוץ צריכים להיות מקבילים.
מכשיר זה יכול לשמש לאיתור סמנים ביולוגיים חיים או חיידקים שמקורם בתקופה של אבחון מוקדם של מחלות זיהומיות חיידקיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכנולוגיית אקוסטיפוזיס (acoustophoresis) מיקרופלואידית להפרדה מהירה ויעילה של חיידקים גרם-שליליים (Gram-negative) ממסביב שונים. השיטה עושה שימוש במיקרו-חרוזים שעברו מודיפיקציה של אפטמרים כדי לשפר את תהליך הבידוד, ובכך מאפשרת הפרדת תאים ללא מגע עם ספיקת עיבוד סבירה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרופלואידיקה
- אקוסטיפוריה
- מיקרוביולוגיה
רקע
- מערכות מיקרופלואידיקה מאפשרות מניפולציה מדויקת של נוזלים בקנה מידה מיקרוסקופי.
- אקוסטיפוזיס (Acoustophoresis) היא טכניקה המשתמשת בגלי קול לצורך מניפולציה של חלקיקים.
- חיידקים גראם-שליליים מציבים אתגרים משמעותיים בבידודם בשל תכונותיהם המבניות.
- אפטמרים הם אוליגוניוקלאוטידים קצרים בעלי גדיל יחיד, המסוגלים להיקשר באופן סלקטיבי למטרות ספציפיות.
מטרת המחקר
- פיתוח שבב אקוסטי-מיקרופלואידי להפרדה יעילה של חיידקים.
- אופטימיזציה של תהליך הבידוד עבור דגימות רפואיות וסביבתיות כאחד.
- הדגמת היעילות של מיקרו-חרוזיים שעברו שינוי באמצעות aptamer בשיפור יעילות ההפרדה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון שבב אקוסטופורזיס (acoustophoresis) מיקרופלואידי.
- הדבקת שכבות של סיליקון וזכוכית בורוסיליקט לצורך ייצור השבב.
- הזרקת תערובת דגימות PS לתוך השבב לצורך הפרדה.
- ביצוע אנודיזציה תחת תנאי מתח וטמפרטורה ספציפיים.
תוצאות עיקריות
- מערכת האקוסטיפורזיס המיקרופלואידית בידלה בהצלחה חיידקים גרם-שליליים.
- הושגה הפרדה בעלת תפוקה גבוהה ללא מגע.
- מיקרו-חרוזיים ששופרו באמצעות אפטמרים שיפרו משמעותית את יעילות הבידוד.
- השיטה ישימה הן לדגימות רפואיות והן לדגימות סביבתיות.
מסקנות
- אקוסטופורזיס מיקרופלואידית היא טכניקה מבטיחה לבידוד חיידקים.
- מודיפיקציות של אפטמרים משפרות את הסלקטיביות ואת היעילות של התהליך.
- טכנולוגיה זו עשויה להועיל ליישומים שונים במיקרוביולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו של אקוסטופורזיס מיקרופלואידית מאפשרת בידוד מהיר ובטוהר גבוה של חיידקים גרם-שליליים ממטריצות מורכבות, ובכך נותנת מענה לבקבוק קריטי באבחון מוקדם של מחלות זיהומיות ובניטור סביבתי. באמצעות שילוב של הפרדה אקוסטית ללא סימון (label-free) עם ספציפיות מבוססת אפטמרים, הטכנולוגיה תומכת בהפחתת סיכונים של יעדים בתהליכי גילוי של חומרים אנטימיקרוביאליים ובזרימות עבודה של תיקוף סמנים ביולוגיים. ההשגות שהוכחן, הכוללות השגב >98% וטוהר של 97.8% בריכוז של 10x, מספקות חלופה ניתנת להרחבה וללא מגע לצנטריפוגציה או סינון לצורך הכנת דגימות פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות בחיידקים גרם-שליליים על ידי בידוד פתוגנים חיים מדגימות ביולוגיות או סביבתיות הטרוגניות.
- ערך תפעולי: מקצר את זמן עיבוד הדגימה וממזער נזק ביומולקולרי בהשוואה לטכניקות הפרדה מסורתיות.
- ערך ניבוי: תומך בהורדת סיכונים מכניסטית על ידי אספקת פרקציות חיידקיות מטוהרות למחקרי מעורבות מטרה ומנגנוני פעולה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תשומות חיידקיות מופקת עבור בדיקות סריקה פנוטיפיות, ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מזיהום של מינים גרם-חיוביים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות באמצעות מיקוד אקוסטי-פורטי (acoustophoretic) הדיר ולכידה מתווכת אפטמרים.
- יכולת הרחבה (Scalability): עיצוב תעלות מסועף מאפשר עיבוד, טיהור וריכוז סימולטניים, לצורך תפוקה גבוהה יותר ברצפי סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין שלב הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לבידוד עקבי של חיידקים גרם-שליליים ממטריצות דמויות-קליניות כגון דם או שתן.
- סנכרון ביומרקרים: מקלה על זיהוי חיידקים חיים או ביומרקרים נגזרים ביישומים של אבחון מוקדם, ובכך תומכת בפיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- קידום מותאם סיכונים: מדדי התאוששות וטוהר גבוהים משפרים את רמת הביטחון במבחנים המשלימים המשמשים להערכת תרכובות מובילות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף שבין שלבי הגילוי המוקדמים למחקרים פרה-קליניים, והיא תומכת במיוחד בהכנת דגימות לצורך תיקוף מטרות (target validation), מוכנות של בדיקות (assay readiness) ומחקרים מכניסטיים שבהם טוהר של חיידקים גרם-שליליים הוא קריטי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות באמצעות בידוד זנים ספציפיים של גרם-שליליים מתרביות מעורבבות או מדגימות סביבתיות לצורך הפחתת סיכונים במטרה.
- סריקה: מאפשרת השגת אוכלוסיות חיידקים מוכנות לבדיקה עם מינימום שאריות של רכיבים מפריעים, דבר המשפר את דיוק הסריקה.
- אנליטיקה: מספקת פלטים כמותיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית והדמיה במהירות גבוהה, המאפשרים השוואות של יחסי קישור בין חרוזיים לחיידקים ועוצמת אות.
- מחקר תרגומי: מתחבר לזרימות עבודה פרה-קליניות על ידי אפשור בידוד מדגימות רלוונטיות רפואית, ובכך תומך ברציפות בפיתוח מודלים של מחלות זיהומיות.
- שימוש חוזר ארגוני: תכנון מבוסס שבב וזרימה נוזלית מבוקרת לחץ מאפשרים סטנדרטיזציה בין מעבדות והתאמה לסוגי דגימות שונים ללא צורך בתכנון מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתקפוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית הנובעת מזיהומים בדגימות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות בקרה מדויקת של כוח אקוסטי והכנה סטנדרטית של חרוזי-אפטאמר.
- ערך אסטרטגי: משפר את מהימנות קבלת החלטות ה-go/no-go בתוכניות אנטימיקרוביאליות על ידי אספקת קלטים ביולוגיים בעלי נאמנות גבוהה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מובילים (leads) מותאם סיכון, בהתבסס על נתונים מכניסטיים נקיים יותר מfrak-tions בקטריאליים מופרדים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון מיקרופלואידיקה, אופטימיזציה של פרמטרים אקוסטופוריים ופרוטוקולים לצימוד אפטמר-חרוץ.
- תלוי במתמרים פיזואלקטריים, מחוללי פונקציות, מגברי הספק ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם יכולת דימוי במהירות גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה של תנאי התמיכה (buffer), קצבי זרימה (2 kPa לדגימה, 4 kPa לתמיכה) וכיול מתח PZT בין המשתמשים.
- התאמה למינים שונים של חיידקים או למטריצות דגימה עשויות לדרוש אופטימיזציה מחדש של בחירת האפטמר ותדר התהודה האקוסטית.
- מגבלות מעשיות כוללות גליות של התעלה הנגרמת מדבק במקרה של שימוש בכמות מופרזת של ציאנואקרילט, דבר המשפיע על אחידות השדה האקוסטית.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Microuidic Acoustophoresis Chip Design and Fabrication
1:23
Bacterial Strains and Culture
1:56
Microbeads and Immobilization of Aptamer onto Microbeads
3:10
Acoustophoresis Setup and Operation
4:19
Results: Using Microfluidics to Capture GN Bacteria from Culture Samples at High Speed
5:26
Conclusion
