Name: אקוסטופורזיס מיקרופלואידי להפרדת זרימה של חיידקים גראם-שליליים באמצעות חרוזי זיקה של אפטמר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: למד טכנולוגיית אקוסטופורזיס מיקרופלואידי להפרדת חיידקים גראם-שליליים באמצעות חרוזי זיקה של אפטמר. שיטה זו מאפשרת בידוד תאים ללא מגע עם תפוקה גבוהה לדגימות רפואיות וסביבתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (משרד המדע והתקשוב). (לא. NRF-2021R1A2C1011380)

1. תכנון שבבי אקוסטופורזיס מיקרופלואידי
הערה: איור 1 מראה סכמטיות של הפרדה ואיסוף של מיקרובי מטרה ממיקרו-ערוצים על-ידי אקוסטופורזיס. שבב האקוסטופורזיס המיקרופלואידי מתוכנן עם תוכנית CAD.
<ol><li>תכנן שבב אקוסטופורזיס מיקרופלואידי המשתמש בתערובת של חרוזים שעברו שינוי אפטאמר וחרוזים פוליסטירן מצופים סטרפטאבידין (PS) המתאימים לגודל החיידקים כדי לחקור את ביצועי ההפרדה של המכשיר.</li>
	<li>תכננו שבב אקוסטופורזיס מיקרופלואידי שאוסף חרוזי PS בשקע המטרה ומשליך את השאר דרך השקע לאחר הזרקת תערובת דגימת PS לכניסת הדגימה (ראו איור 2 וטבלה 1). הערה: למטרה זו, השבב האקוסטופלואידי מתוכנן להיות מורכב משני פתחים להזרקת דגימות ומאגר, ערוץ ראשי עם מתמר פיאזואלקטרי מחובר (PZT) כדי לאפשר ליישר את המיקרובים באופן מרכזי, ושני שקעים שדרכם נאספות דגימות ופסולת משוחררת (איור 3A)</li>
	<li>תכננו שבב אקוסטופורזיס מיקרופלואידי שבו מיקרובים, חיץ, חיידקים ואפטמרים עוברים דרך התעלה הראשית, כאשר המיקרובים מיושרים באופן מרכזי באמצעות אקוסטופורזיס בתוך השבב המושרה על-ידי ה-PZT (איור 3B,C)</li>
</ol>2. ייצור שבבי אקוסטופורזיס מיקרופלואידי
הערה: הרכיבו ארבע שכבות בסדר הבא: שכבת זכוכית-סיליקון בורוסיליקט, שכבת סיליקון, שכבת זכוכית בורוסיליקט ושכבת PZT, כפי שמוצג באיור 3A,B.
<ol><li>הכן זכוכית בורוסיליקט (השכבה העליונה ביותר) עם חורים בקוטר 2 מ"מ על ידי התזת חול17 בכניסה ובשקע לחיבור צינורות polyetheretherketone (PEEK). זכוכית בורוסיליקט מודד 20 × 80 × 0.5 מ"מ3.</li>
	<li>הכינו שכבת תעלת סיליקון בעובי 200 מיקרומטר עם מיקרו-ערוץ עם שטח חתך של 0.2 × 0.2 מ"מ2 שנוצר באמצעות פוטורסיסט ותבנית סיליקון המתקבלת באמצעות תחריט יונים תגובתי עמוק (RIE)18. קדחו חורים בקוטר 1 מ"מ לתעלות כניסת הדגימה והמאגר ותעלות האיסוף ויציאת הפסולת במהלך תחריט יונים תגובתי. הערה: כאן, תחריט יונים משתמש בתהליך RIE כדי ליצור מיקרו-ערוצים. פוטורסיסט הוחל בצורת תעלה על פרוסת סיליקון לשכבת תעלת הסיליקון. פרוסת הסיליקון המצופה PR נחרטה בפלזמה שנוצרה על ידי מריחת 13.56 מגה-הרץ על פלואור18.</li>
	<li>הכינו שבב עם השכבות שמעל ומתחת לשכבת הסיליקון (20 × 80 × 0.5 מ"מ 3) שהוכנו בשלב 2.2 (20 × 80 × 0.5 מ"מ3) שהודבקו לזכוכית הבורוסיליקט בשלב 2.1 ושכבת זכוכית בורוסיליקט שלישית באמצעות אנודיזציה ב-1,000 וולט ו-400 מעלות צלזיוס19.</li>
	<li>חברו PZT (20 × 40 מ"מ2) לשכבת הזכוכית הבורוסיליקטית לאורך התעלה המיקרופלואידית באמצעות דבק ציאנואקרילט (10 μL או פחות). הערה: יש למרוח את הדבק כשכבה דקה מאוד בתעלה באמצעות צמר גפן כדי למזער כל שינוי בגובה. איור 3C הוא תמונה של המכשיר.</li>
</ol>3. זני חיידקים ותרבית
הערה: עיין בטבלה 2 כדי לבחור ולדגור על חיידקי GN וחיידקי גראם-חיוביים (GP) לניסויים. עבור שיטת התרבות, עיין בשלבים 3.1-3.4. כל החיידקים צריכים להיות דגירה בתנאים אירוביים עד ספיגה של 0.4 ב 600 ננומטר (OD600) מתקבל.
<ol><li>עבור חיידקי GN כגון Escherichia coli DH5α, Escherichia coli KCTC2571, Sphingomonas insulae, וחיידקי Pseudomonas pictorum ו- GP כגון סטפילוקוקוס אפידרמידיס וסטפילוקוקוס פסטורי, דגירה בבינוני לוריא-ברטני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד למשך 16 שעות.</li>
	<li>עבור אנטרובקטר (GN) ובצילוס מגטריום (GP; KCTC 1021), דגירה בציר מזין בינוני ב-37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד למשך 16 שעות.</li>
	<li>עבור אנטרוקוקוס תאילנדיקוס (GP), דגירה בדה מאן, רוגוסה ושארפ (MRS) בינונית ב-37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד למשך 16 שעות.</li>
	<li>עבור ליסטריה אפורי (GP), דגירה בעירוי לב במוח בינונית ב-37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד למשך 16 שעות.</li>
	<li>צנטריפוגה (9056 x גרם) החיידקים בתרבית למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן יש לשטוף פעמיים עם חיץ מלח 1x עם אגירת פוספט (PBS).</li>
	<li>הכן את חיידקי ה-GN וה-GP שנבחרו לניתוח על-ידי השעיה חוזרת במאגר PBS.</li>
</ol>4. מיקרובים ואימוביליזציה של אפטמר על מיקרובים
<ol><li>יש להשעות את תערובת החיידקים המצופים בסטרפטווידין (10 מיקרומטר) (טבלת חומרים) לפני השימוש (לערבב באמצעות מערבולת במשך 20 שניות).</li>
	<li>הכינו את האפטמר על ידי דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ולאחר מכן התפוררות מחדש ב-0 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.</li>
	<li>העבירו 250 מיקרו-ליטר מתערובת החיידקים המצופים בסטרפטווידין לצינור של 1.5 מ"ל ושטפו עם חיץ Tris-HCl (50 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 5 mM KCL, 100 mM NaCl) ב-RT. לאחר מכן להוסיף 100 μL של biotinylated DNA aptamer לצינור.</li>
	<li>דגרו את התערובת ב-RT למשך 30 דקות תוך כדי סיבוב (25 סל"ד).</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה (9056 x גרם), יש לשטוף את הצינור פעמיים עם 200 μL של חיץ Tris-HCl ב-RT.</li>
	<li>יש להוסיף 10 μL של BSA (100 מ"ג/מ"ל) לצינור הדגימה שנשטף ולדגור במשך 30 דקות ב-RT עם סיבוב (25 סל"ד).</li>
	<li>לבסוף, שטפו את המיקרובים שעברו שינוי אפטמר פעמיים על ידי צנטריפוגה (9056 x גרם) במאגר Tris-HCl ב-RT.</li>
</ol>5. התקנה והפעלה של אקוסטופורזיס
<ol><li>חברו את צינורות PEEK לשני המפרצים להזרקת שתי דגימות וחיץ ולשני השקעים לאיסוף ופריקה של פסולת (איור 4).</li>
	<li>מלאו ידנית את תעלת האקוסטופורזיס המיקרופלואידית במים שעברו דה-מינרליזציה ללא בועות באמצעות מזרק של 10 מ"ל.</li>
	<li>הכן בקר לחץ מדויק עם שני ערוצי יציאה או יותר כדי לשלוט בזרימת הנוזל. לאחר מכן, חצי למלא את הבקבוקונים עם מדגם ומאגר עם שני חורים בכובעים שלהם, בהתאמה, ולהתחבר לכניסת השבב. הערה: ניתן להחליף בקר לחץ מדויק עם שני ערוצי יציאה או יותר בבקרי לחץ מדויקים מרובים. בכניסת החיץ, חוצץ המסוגל ליצור זרימה למינרית המונעת מהדגימה לנוע למרכז במהלך הזרקת הדגימה מוזרק דרך בקר זרימה.</li>
	<li>לאחר הכנת המכשיר, הזרקת הדגימה והמאגר על ידי הפעלת לחץ של 2 kPa על כניסת הדגימה ו- 4 kPa לכניסת החיץ באמצעות התקן בקרת הלחץ המדויק. הערה: בשלב זה, עבור זרימה למינרית חלקה, לחץ ההזרקה של המאגר צריך להיות גבוה יותר מלחץ ההזרקה של הדגימה. הזרימה נשלטת על ידי בקר זרימה המקובע לאספירטור המחובר לערוץ הכניסה.</li>
	<li>התמקדו בחרוז כדי להעביר אותו למרכז התעלה המיקרופלואידית באמצעות ה-PZT תוך כדי בדיקה דרך המיקרוסקופ. הערה: ככל שהחרוז גדול יותר, כך ההשפעה על צורת הגל גדולה יותר, כך שקל יותר ליישר אותו עם נקודת הצומת. מחולל פונקציות עם מגבר מחיל כוח על PZT כדי ליצור גל סינוס במיקרו-ערוץ. מכיוון שהחלקים העליונים והתחתונים של המיקרו-ערוץ עשויים מזכוכית, גל הסינוס שנוצר מוחזר ויוצר נקודת צומת7.</li>
	<li>צור תדר תהודה של 3.66 MHz באמצעות מחולל פונקציות חד-ערוצי והגבר אות טיפוסי ב-16 dB (בערך פי תשעה) באמצעות מגבר הספק (איור 4). הערה: תדר התהודה של המפעיל חייב להתאים לגודל הערוץ; מכיוון שהערוץ מרובע, ה-PZT פועל בתדר מדויק כדי ליצור צומת יחיד.</li>
	<li>שימו לב לתהליכי ההפרדה וההעשרה על השבב האקוסטופלואידי עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומצלמה במהירות גבוהה הפועלת בקצב של 1,200 פריימים לשנייה.</li>
	<li>לכמת ולנתח את נוכחותם או היעדרם של חיידקי GN וחיידקי GP על ידי בדיקת התמונות שצולמו במצלמת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי של החרוזים והחיידקים הקשורים לחיידקים המוזרמים דרך דגימות האיסוף ושקעי הפסולת. הערה: מיקרובים עם מאגר, חיידקים ואפטמרים עוברים דרך התעלה הראשית, והמיקרובים מיושרים באופן מרכזי באמצעות אקוסטופורזיס בתוך השבב המושרה על-ידי ה-PZT. לבסוף, מיקרובים שיש להם חיידקי GN קשורים נאספים בשקע האיסוף, והחיידקים שלא נאספו משוחררים דרך שקע הפסולת.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidic+separation+of+cells+and+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystem+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidic separation of cells and particles.</a> Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).</li>
<li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+affinity-bead+mediated+capture+and+displacement+of+Gram-negative+bacteria+using+acoustophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis.</a> Micromachines. 10 (11), 770(2019).</li>
<li>Hirvonen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+sample+preparation+of+positive+blood+cultures+for+the+direct+detection+of+methicillin-sensitive+and+-resistant+Staphylococcus+aureus+and+methicillin-resistant+coagulase-negative+staphylococci+within+one+hour+using+the+automated+GenomEra+CDXTM+PCR+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).</li>
<li>Swaminathan, B., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+food-borne+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria.</a> Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+manipulation+of+single+microparticles%2C+cells%2C+and+organisms+using+surface+acoustic+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).</li>
<li>Karthick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+impedance-based+size+independent+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+using+acoustophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 2802(2018).</li>
<li>Lenshof, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidics+8%3A+Applications+of+acoustophoresis+in+continuous+flow+microsystems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).</li>
<li>Persson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+microfluidic+chip+technology+to+facilitate+automation+of+phage+display+selection%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+journal%22%5BJournal%5D)">Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection.</a> The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).</li>
<li>Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKlussmann%2C+S+%22The+aptamer+handbook%3A+Functional+oligonucleotides+and+their+applications%22">The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications</a>. , John Wiley & Sons. Hoboken, New Jersey. (2006).</li>
<li>Ellington, A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li>
<li>Namnabat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+numerical+simulation+of+acoustophoretic+motion+induced+by+boundary-driven+acoustic+streaming+in+standing+surface+acoustic+wave+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11326(2021).</li>
<li>Nimjee, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+as+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Aptamer as therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+aptamer+discovery+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Recent advances in aptamer discovery and application.</a> Molecules. 24 (5), 941(2019).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acousto-microfluidics+for+screening+of+ssDNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Persson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+microfluidic+chip+technology+to+facilitate+automation+of+phage+display+selection%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection.</a> The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).</li>
<li>Van Toan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+processes+for+glass+micromachining%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">An investigation of processes for glass micromachining.</a> Micromachines. 7 (3), 51(2016).</li>
<li>Jansen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+on+the+reactive+ion+etching+of+silicon+in+microtechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14(1996).</li>
<li>Hanneborg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon-to-silicon+anodic+bonding+with+a+borosilicate+glass+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139(1991).</li>
<li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+filter+microchip+for+rapid+separation+of+plasma+and+viruses+from+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).</li>
<li>Ai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+Escherichia+coli+bacteria+from+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+standing+surface+acoustic+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves.</a> Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).</li>
<li>Ohlsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+impedance+matched+buffers+enable+separation+of+bacteria+from+blood+cells+at+high+cell+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+dielectrophoretic+bacterial+separation+and+concentration+from+physiological+media+of+high+conductivity%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity.</a> Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).</li>
<li>Kim, U., Soh, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+sorting+of+multiple+bacterial+targets+using+integrated+Dielectrophoretic-Magnetic+Activated+Cell+Sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter.</a> Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).</li>
<li>Cai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluidic+device+for+immunomagnetic+separation+of+foodborne+bacteria+using+self-assembled+magnetic+nanoparticle+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains.</a> Micromachines. 9 (12), 624(2018).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

פיתחנו מכשיר מיקרופלואידי לריחוף קולי ללכידה והעברה של חיידקי GN מדגימות תרבית במהירות גבוהה על בסיס שיטת ריצה רציפה בהתאם לגודלם ולסוגם, ומיקרובים שעברו שינוי אפטמר. המיקרו-ערוץ הארוך והמרובע מאפשר תכנון פשוט יותר ויעילות גבוהה יותר עבור אקוסטופורזיס דו-ממדי ממה שדווח בעבר 20,21,22,23,24,25,26.</...

פלטפורמות מיקרופלואידיות מפותחות כדי לבודד חיידקים מדגימות רפואיות וסביבתיות, בנוסף לשיטות המבוססות על העברה דיאלקטרית, מגנטופורזיס, מיצוי חרוזים, סינון, מיקרופלואידיקה צנטריפוגלית ואפקטים אינרציאליים, וגלים אקוסטיים על פני השטח 1,2. הזיהוי של חיידקים פתוגניים נמשך באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), אך בדרך כלל הואמייגע, מורכב וגוזל זמן רב 3,4. מערכות אקוסטופורזיס מיקרופלואידיות הן חלופה לטיפול בכך באמצעות תפוקה סבירה ובידוד תאים ללא מגע 5,6,7. Acoustophoresis היא טכנולוגיה המפרידה או מרכזת חרוזים באמצעות תופעה של תנועת חומר דרך גל קול. כאשר גלי קול נכנסים למיקרו-ערוץ, הם ממוינים לפי הגודל, הצפיפות וכו' של החרוזים, וניתן להפריד את התאים לפי התכונות הביוכימיות והחשמליות של מדיום התלייה 7,8. בהתאם לכך, מחקרים אקוסטופורטיים רבים נערכו באופן פעיל 9,10,11, ולאחרונה, סימולציות נומריות תלת-ממדיות של תנועה אקוסטופורטית המושרה על ידי זרימה אקוסטית מונחית גבולות במיקרופלואידיקה של גלים אקוסטיים במשטח עמידה, הוצגו 12.
מחקרים בתחומים שונים בוחנים כיצד להחליף נוגדנים 2,3. אפטמר הוא חומר מטרה בעל סלקטיביות וספציפיות גבוהות, ומחקרים רבים נערכים 2,9,10,13. לאפטמרים יש יתרונות של גודל קטן, יציבות ביולוגית מצוינת, עלות נמוכה ויכולת שכפול גבוהה בהשוואה לנוגדנים והם נחקרים ביישומים אבחוניים וטיפוליים 2,3,14.
במאמר זה מתואר פרוטוקול בטכנולוגיית אקוסטופורזיס מיקרופלואידית שניתן להשתמש בו להפרדה מהירה ויעילה של חיידקים גראם-שליליים (GN) ממדיום באמצעות מיקרובים שעברו שינוי אפטמר. מערכת זו מייצרת גל עמידה אקוסטי דו-ממדי (2D) באמצעות הפעלה פיאזואלקטרית יחידה על ידי גירוי בו-זמני של שתי תהודות אורתוגונליות בתוך מיקרו-ערוץ מלבני ארוך כדי ליישר ולמקד מיקרובים המחוברים לאפטמר בנקודות הצומת והאנטי-צומת ליעילות הפרדה 2,11,15,16 . בכניסה ובשקע יש תעלה דו-פרצופית, המאפשרת הפרדה, טיהור וריכוז בו זמנית.
פרוטוקול זה יכול להיות מועיל בתחום של אבחון מוקדם של מחלות זיהומיות חיידקיות, כמו גם תגובה מהירה, סלקטיבית ורגישה לזיהומים חיידקיים פתוגניים באמצעות ניטור מים בזמן אמת.

<table><tbody><tr><td>1 ומיקרו; מיקרו-חרוזי פוליסטירן m</td><td>מעבדות באנג</td><td>PS04001</td><td>חרוזים בגודל תא</td></tr><tr><td>10 ומיקרו; m מיקרו-חרוזים מצופים סטרפטווידין</td><td>מעבדות באנג CP01007</td><td></td><td>חרוזי זיקה של אפטמר</td></tr> 4 <tr><td>אינץ 'פרוסת סיליקון / תבנית SU-8</td><td>4science</td><td>29-03573-01</td><td>רכיבי שבב</td></tr><tr><td>Aptamer</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>GN3-6'RNA</td> <td>לצימוד חיידקים</td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקט</td><td>Schott</td><td>BOROFLOAT 33</td><td>רכיבי</td></tr><tr><td>צנטריפוגת</td> שבב<td>Daihan</td><td>CF-10</td><td>חלקיקי שחיקה</td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט</td><td>3M</td><td>AD100</td><td>חבר PZT לשבב</td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha;</td><td>KCTC</td><td>KCTC2571</td><td>יעד חיידקים</td></tr><tr><td>מחולל פונקציונלי</td><td>GW Instek</td><td>AFG-2225</td><td>לייצר</td></tr><tr><td>תדר מצלמה במהירות גבוהה</td><td>Photron</td><td>FASTCAM מיני</td><td>תצפית על הפרדה</td></tr><tr><td>פלטה חמה</td><td>כצלחת</td> חימום <td>אחת HI-1000</td><td>לריפוי נוזל PDMS</td></tr><tr><td>מזרק KOVAX-מזרק 10 מ"ל</td><td>קוריאה חיסון</td><td>22G-10 מ"ל</td><td>מלאו את תעלת האקוסטופורזיס המיקרופלואידית במים דה-מינרליים נטולי בועות.</td></tr><tr><td>פולידימתילסילוקסן נוזלי, PDMS</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>רכיבי שבב</td></tr><tr><td>LB מרק מילר</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>תרבית תאים (מדיום לוריא-ברטני)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס קורפ.</td><td>IX-81</td><td>תצפית על הפרדה</td></tr><tr><td>מאגר PBS</td><td>מזל גדי מדעי</td><td>PBS-1A</td><td>חיידקים שוצפים</td></tr> צינורות <tr><td>הצצה</td><td>Saint-Gobain Ppl Corp.</td><td>AAD04103</td><td>להזריק או לאסוף חלקיקים</td></tr><tr><td>מתמר פיזואלקטרי</td><td>Fuji Ceramics</td><td>C-213</td><td>צור גל ספציפי בערוץ</td></tr><tr><td>מגבר כוח</td><td>מגבר מחקר</td><td>75A250A</td><td>תגבר תדר</td></tr><tr><td>בקר לחץ/&mu; flucon</td><td>AMED</td><td>AMED-&mu; flucon</td><td>בקרת לחץ אוויר/בקר זרימה</td></tr><tr><td>Tris-HCl מאגר</td><td>invitrogen</td><td>15567027</td><td>חלקיקי בזבוז</td></tr><tr><td>מסובב צינור</td><td>SeouLin Bioscience</td><td>SLRM-3</td><td>שינוי אפטמר וחרוז</td></tr></tbody></table>

אקוסטופורזיס מיקרופלואידי להפרדת זרימה של חיידקים גראם-שליליים באמצעות חרוזי זיקה של אפטמר

Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads

מאמר זה מתאר את הייצור וההפעלה של שבבי אקוסטופורטי מיקרופלואידיים באמצעות טכניקת אקוסטופורזיס מיקרופלואידית ומיקרובים שעברו שינוי אפטמר שיכולים לשמש לבידוד מהיר ויעיל של חיידקים גראם-שליליים ממדיום. שיטה זו משפרת את יעילות ההפרדה באמצעות שילוב של מיקרו-ערוצים ארוכים ומרובעים. במערכת זו, המדגם והמאגר מוזרקים ליציאת הכניסה באמצעות בקר זרימה. עבור מרכוז חרוזים והפרדת דגימות, כוח AC מוחל על המתמר הפיאזואלקטרי באמצעות מחולל פונקציות עם מגבר כוח כדי ליצור כוח קרינה אקוסטית במיקרו-ערוץ. בכניסה ובשקע יש תעלה דו-פרצופית, המאפשרת הפרדה, טיהור וריכוז בו זמנית. למכשיר שיעור התאוששות של >98% וטוהר של 97.8% עד לריכוז מנה של פי 10. מחקר זה הדגים קצב התאוששות וטוהר גבוהים יותר מהשיטות הקיימות להפרדת חיידקים, מה שמרמז על כך שהמכשיר יכול להפריד חיידקים ביעילות.

איור 5 מציג את התמונה של זרימת חרוזים כפונקציה של מתח PZT (OFF, 0.1 V, 0.5 V, 5 V). במקרה של שבב acoustophoretic שהוצג במחקר זה, אושר כי ככל שהמתח של PZT גדל, הריכוז המרכזי של חרוזים בגודל 10 מיקרומטר גדל. רוב החרוזים בגודל 10 מיקרומטר התרכזו במרכז ב-5 וולט של מתח ה-PZT. באמצעות תוצאה זו, תדר תהודה של 3.66 MHz נוצר במחולל פונקציות ערוץ יחיד, ואות כללי הוגבר על ידי 16 dB (כ 9 פעמים) באמצעות מגבר כוח.
טבלה 3 מראה כי תערובת המיקרובים של 1 מיקרומטר (ג...

מאמר זה מתאר את הייצור וההפעלה של שבבי אקוסטופורטי מיקרופלואידיים באמצעות טכניקת האקוסטופורזיס המיקרופלואידית ומיקרובים שעברו שינוי אפטאמר שיכולים לשמש לבידוד מהיר ויעיל של חיידקים גראם-שליליים ממדיום.

This article describes the fabrication and operation of microfluidic acoustophoretic chips using a microfluidic acoustophoresis technique and ...

פרוטוקול זה מתאר את טכנולוגיית האקוסטופורזיס המיקרופלואידית שלנו, שיכולה לשמש להפרדה מהירה ויעילה של חיידקים גראם-שליליים ממדיום באמצעות חרוזי מיקרו שעברו עיבוד אפתמר. מערכות אקוסטופורזיס מיקרופלואידיות מאפשרות הפרדת חיידקים גראם-שלילית עם תפוקה סבירה ובידוד תאים ללא מגע. ניתן לייעל את האקוסטופורזיס המיקרופלואידי לבידוד חיידקים מדגימות רפואיות וסביבתיות.כדי להתחיל, תכננו שבב אקוסטופורזיס מיקרופלואידי שאוסף חרוזי PS בשקע היעד ומשליך את השאר לאחר הזרקת תערובת דגימת PS לכניסת הדגימה. מכינים שבב כשהשכבות מעל ומתחת לשכבת הסיליקון מחוברות לזכוכית הבורוסיליקט. ושכבת זכוכית בורוסיליקט שלישית, באמצעות אנודיזציה, מוסיפה 1000 וולט ו 400 מעלות צלזיוס.חברו PZT לשכבת הזכוכית הבורוסיליקטית לאורך התעלה המיקרופלואידית באמצעות פחות מ-10 מיקרוליטרים של דבק ציאנואקרילט. לחסן את חיידקי ה-GN וה-GP במדיום לוריא-ברטני ולדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-220 סיבובים לדקה למשך 16 שעות. צנטריפוגה של חיידקים מתורבתים ב 9, 056 RCF במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן יש לשטוף פעמיים עם מאגר PBS 1X. הכן את חיידקי ה- GN וה- GP שנבחרו לניתוח על ידי החייאתם מחדש במאגר הקשירה. יש להשהות את תערובת המיקרו-חרוזים המצופה בסטרפטווידין בגודל 10 מיקרומטר לפני השימוש.מערבבים את התערובת במשך 20 שניות. הכינו את האפטמר על ידי דנאטציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, ולאחר מכן החזירו אותו לאפס מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. העבירו 250 מיקרוליטרים של תערובת מיקרו-חרוזים מצופה סטרפטאווידין לצינור של 1.5 מיליליטר והוסיפו 100 מיקרוליטרים של אפטמר DNA ביוטינילי לצינור.לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות תוך סיבוב במהירות של 25 סיבובים לדקה. צנטריפוגה של תערובת התגובה ב 9, 056 RCF במשך 40 שניות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את הצינור פעמיים עם 200 microliters של חיץ Tris-HCl.הוסיפו 10 מיקרוליטרים של 100 מיליגרם למיליליטר BSA לצינור הדגימה השטוף ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך סיבוב במהירות של 25 סיבובים לדקה. לבסוף, יש לשטוף את חרוזי המיקרו שעברו שינוי אפטמר פעמיים בחיץ Tris-HCl על ידי צנטריפוגה ב-9, 056 RCF למשך 40 שניות בטמפרטורת החדר. חבר צינורות PEEK לשני הפתחים להזרקת שתי דגימות וחיץ, ושני השקעים לאיסוף ופריקה של פסולת.באמצעות מזרק של 10 מיליליטר, מלאו את תעלת האקוסטופורזיס המיקרופלואידית במים שעברו דה-מינרליזציה ללא בועות. הכן בקר לחץ מדויק עם שני ערוצי יציאה או יותר כדי לשלוט בזרימת הנוזל. לאחר הכנת המכשיר, הזרקת הדגימה והמאגר על ידי הפעלת לחץ של שני קילו-פסקלים על כניסת הדגימה וארבעה קילו-פסקלים לכניסת החיץ באמצעות התקן בקרת הלחץ המדויק.באמצעות מיקרוסקופ, התמקדו בחרוז והזיזו אותו למרכז התעלה המיקרופלואידית באמצעות ה-PZT. צור תדר תהודה של 3.66 מגה-הרץ באמצעות מחולל פונקציות ערוץ יחיד והגבר אות טיפוסי ב-16 דציבלים באמצעות מגבר הספק. שימו לב לתהליכי ההפרדה וההעשרה על השבב האקוסטופלואידי עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומצלמה במהירות גבוהה הפועלת בקצב של 1, 200 פריימים לשנייה.השבב האקוסטופורטי שהוצג במחקר זה אישר כי ככל שהמתח של ה- PZT גדל, הריכוז המרכזי של החרוזים בגודל 10 מיקרומטר גדל. בחמישה וולטים של מתח PZT, רוב החרוזים בגודל 10 מיקרומטר התרכזו במרכז. היחס בין מספר החרוזים שנאספו בשקע למספר הכולל של חרוזים מוזרקים בגודל 10 מיקרומטר נקרא קצב ההתאוששות.היחס בין מספר החרוזים בגודל 10 מיקרומטר למספר הכולל של החרוזים שנאספו נקרא טוהר. התוצאות הצביעו על כך שלמכשיר הייתה יעילות הפרדה גבוהה לחרוזים בגודל של 10 מיקרומטר. המספרים של חיידקי GN ו-GP הקשורים לכל חרוז מיקרו שעבר שינוי אפטמר נמדדו באמצעות מיקרוסקופ עם מצלמה במהירות גבוהה.כל חמשת חיידקי ה-GN נקשרו לחרוזים, בעוד שפחות חיידקי GP נקשרו באופן משמעותי לחומרים שנבדקו. עוצמת האות הייתה שונה באופן משמעותי בין חיידקי ה-GN וה-GP. יש להשתמש בדבק המשמש לחיבור ה- PZT מעט ככל האפשר לדיוק הקורוגציה וה- PZT והמיקרו-ערוץ צריכים להיות מקבילים.מכשיר זה יכול לשמש לאיתור סמנים ביולוגיים חיים או חיידקים שמקורם בתקופה של אבחון מוקדם של מחלות זיהומיות חיידקיות.

microfluidic-acoustophoresis-for-flowthrough-separation-gram-negative

Research

JoVE Journal

Engineering

הנדסה

מכשירים microfluidic יכול לשמש כדי לחזות תהליכים טבעיים מורכבים בזמן אמת על המאזניים פיזי המתאים. פיתחנו מכשיר microfluidic פשוט המחקה התכונות העיקריות של התקשורת נקבובי טבעי ללימוד הצמיחה הובלה של חיידקים מתחת לפני הקרקע.

חלון על המיקרו: מערכות Microfluidic פשוט לחקר התחבורה מיקרוביאלית בתווך נקבובי

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic לחקירת chemotaxis חיידקים הדרגתיים ריכוז יציב של chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

Dielectrophoresis (DEP) היא שיטה יעילה לתפעל תאים. מעגלים מודפסים (PCB) יכול לספק אלקטרודות זול, לשימוש חוזר ויעיל מניפולציה מגע חופשי בתוך התא מכשירים microfluidic. על ידי שילוב של PDMS מבוססי ערוצי microfluidic עם coverslips על PCBs, אנחנו מדגימים מניפולציה חרוז תא הפרדה בתוך מכשירים microfluidic רב.

חרוזים ועל הפרדת תאים ריבוי ערוצים מכשירים microfluidic שימוש dielectrophoresis ו זרימה למינרית

מקור: Choi, H. J., et al. אקוסטופורזיס מיקרופלואידית להפרדת זרימה של חיידקים גראם-שליליים באמצעות חרוזי זיקה של אפטמר. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את השיטה של הפרדה סלקטיבית של חיידקים גראם-שליליים מדגימת חיידקים מעורבת באמצעות מיקרו-חרוזים מצופים אפטמר וכוחות אקוסטיים בתוך שבב מיקרופלואידי.

אקוסטופורזה בסיוע אפטמר להפרדה מיקרופלואידית של חיידקים גראם-שליליים

בסרטון זה אנו מתארים ראשון ייצור ותפעול הליכים של גל אקוסטי פני השטח (SAW) מכשיר נגדי אקוסטי. לאחר מכן, אנו מדגימים התקנה ניסיונית שמאפשרת לשניהם להדמיה איכותית זרימה וניתוח כמותי של תזרים מורכב בתוך מכשיר השאיבה ראה.

ייצור, תפעול ויזואליזציה זרימה במיקרופלואידיקה אקוסטית-נגדית Surface--מונע גל אקוסטי

פרוטוקול זה מתאר ארכיטקטורת מערכת לביצוע הפרדות חלקיקים אוטומטיות בנפח קטן (0.15-1.5 מ"ל) באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, ודן בשיטות לייעול הביצועים והתפעול של מכשיר אקוסטופלואידי.

פלטפורמת microfluidic לעיבוד מדגם Precision הקטן-נפח ושימוש בו לגודל חלקיקים הביולוגיים נפרדים עם Microdevice אקוסטי

התקנים Acoustofluidic שימוש בגלי אולטראסאונד בתוך ערוצי microfluidic לתמרן, להתרכז ולבודד מיקרו מושעה וגופים הננוסקופי. פרוטוקול זה מתאר את הייצור ותפעול של מכשיר כזה התומך גלים עומדים אקוסטי בתפזורת להתמקד חלקיקים לייעל מרכזי ללא סיוע של נוזלי נדן.

ייצור והפעלה של Acoustofluidic התקנים התומכים גלים אקוסטיים המתמדת בכמות גדולה עבור Sheathless התמקדות של חלקיקים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של אסטרטגיית מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית חיץ החליפין לטהר תאים מהונדסים מיקרו / ננו-חלקיקים עם דלדול יעיל של חלקיקים מאוגד.

Microfluidic מאגר Exchange להנדסת תאים ללא התערבות מיקרו / Nanoparticle

אלקטרונואידים מבוססי מיקרופלואידיג דיגיטלי היא טכניקה העושה שינוי מונחה מתח בזווית המגע לכאורה של droplet מיקרוליטר-נפח כדי להקל על המניפולציה שלה. שילוב זה עם חרוזים מגנטיים פונקציונליזציה מאפשר שילוב של מספר מבצעים ביחידת מעבדה עבור הכנה לדוגמה וזיהוי של פתוגנים באמצעות חיסוני מקושר אנזים (אליסה).

האלקטרו-מערכות מבוססות-פלטפורמת מיקרופלואידיקה דיגיטלית עבור מערכת חיסונית אוטומטית מקושרת אנזימים

עקומות פורצות דרך (BTCs) הן כלים יעילים לחקר הובלת חיידקים במדיה נקבובית. כאן אנו מציגים כלים המבוססים על התקנים נוזליים בשילוב עם מיקרוסקופיה וספירת ציטומטרית זרימה כדי להשיג BTCs.

שילוב התקנים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציתום זרימה לחקר תחבורה מיקרוביאלית במדיה נקבובית על פני קשקשים מרחביים

Microfluidics הוא כלי רב עוצמה לפיתוח בדיקות אבחון. עם זאת, ציוד וחומרים יקרים, כמו גם טכניקות ייצור וטיפול מייגע, נדרשים לעתים קרובות. כאן אנו מפרטים את פרוטוקול הייצור של התקן מיקרופלואידי אקרילי עבור אימונו-אנליזות מגנטיות מבוססות מיקרו וננו-חלקיקים בסביבה זולה ופשוטה לשימוש.

מיקרומילינג בקרה נומרי ממוחשב של מכשיר אקרילי מיקרופלואידי עם הגבלה מדורגת עבור בדיקות חיסוניות מבוססות ננו-חלקיקים מגנטיים

למד טכנולוגיית אקוסטופורזיס מיקרופלואידי להפרדת חיידקים גראם-שליליים באמצעות חרוזי זיקה של אפטמר. שיטה זו מאפשרת בידוד תאים ללא מגע עם תפוקה גבוהה לדגימות רפואיות וסביבתיות.

אקוסטופורזיס מיקרופלואידי להפרדת זרימה של חיידקים גראם-שליליים באמצעות חרוזי זיקה של אפטמר

גלה סרטונים נוספים