מדידות רפלקס H טרמינלי בעכברים
16 ביוני 2022
ההערכה הקלינית של ספסטיות המבוססת על רפלקס הופמן (H-reflex) ושימוש בגירוי חשמלי של עצבים היקפיים היא שיטה מבוססת. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לגירוי עצבי טרמינלי וישיר לכימות H-רפלקס בכף הקדמית של העכבר.
רפלקס H מאפשר אימות אלקטרופיזיולוגי של שלמות המעגלים העצביים. אנו מציגים פרוטוקול טרמינלי לכימות רפלקס H ישירות בעצבי הכף הקדמית בעכברים. בשונה מהקלטות טרנסעוריות קונבנציונליות ולא ספציפיות לעצבים, התוצאות פחות משתנות בין עכברים לימי מדידה.
בדומה לרישומי H-רפלקס בחולים, כימות מדויק מאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי במודלים של מחלות, כגון פגיעה בעמוד השדרה ושבץ. הפרוטוקול דורש מיומנויות ניסוי מוצקות בעבודה עם ציוד ניתוח בעכברים.
אם אינכם בטוחים כיצד להפריד עצבים מרקמת החיבור וכלי הדם, תרגלו תחילה. הדגמת ההליך תהיה על ידי פרדריק ויטרס, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הניחו את העכבר השחור/6J C57 הבוגר בן 8 עד 16 שבועות על כרית החימום המכוסה והמתינו עד שהעכבר יהיה רגוע, הנשימה תהיה יציבה והרפלקסים ייעדרו.
סובב את העכבר על גבו. לאחר מכן, לתקן את הכפות הקדמיות עם קלטת. מקם את הסרט כך שאלקטרודות המדידה יוכנסו בקלות לכפות הקדמיות.
כדי למדוד את הטמפרטורה של עכבר, הכנס בדיקה רקטלית ותקן אותה עם קלטת. יש למרוח משחת עיניים כדי למנוע התייבשות של העיניים. הסירו את הפרווה בזהירות עם זוג מספריים עדינים ומעוגלים תוך הרמת העור בפינצטה.
לאחר מכן, בצע חתך של סנטימטר אחד בעור לאורך ציר ventroposterior של הכף הקדמית עם זוג מספריים עדינים ומעוגלים. הסר בזהירות את רקמת החיבור וחשף את השריר והעצב שמתחת. לאחר מכן להסיר את שריר pectoralis profundus חשוף באמצעות מלקחיים כדי להעריך את העצב המדיאני.
הסר כמויות קטנות של דם ונוזל רקמות עם נייר טישו רך. לאחר מכן, לחתוך בזהירות את השד או שריר בית השחי מלמעלה למטה כדי לחשוף את צרור העצבים. שחררו את צרור העצבים מרקמת החיבור והשריר לאורך של כ-1.5 סנטימטרים.
הפרידו בזהירות את העצב האולנרי והמדיאני של הכף הקדמית באמצעות פיפטה מזכוכית כפופה. העצב העליון הוא העצב האולנרי והתחתון הוא העצב המדיאני. סדרו את אלקטרודות וו המגרה במקביל במרחק של 0.5 עד מילימטר והשתמשו במיקרומניפולטור כדי למקם את הוו הכפול קרוב לעצב.
השתמש בוו הזכוכית כדי להרים את העצב האולנרי אל אלקטרודות וו הגירוי. לאחר מכן, משוך את האלקטרודה לאחור עם העצב והפרד אותה מהעצבים האחרים. הניחו את האלקטרודות לאורך הציר הארוך של הכף כדי להפחית את הדיבור בין השרירים.
יבשו באופן שטחי את ווי האלקטרודות המחוברים לעצב ומרחו וזלין באמצעות מזרק כדי לספק בידוד חשמלי מהרקמה הסמוכה. כדי למדוד את רפלקס H, מקם את אלקטרודות האלקטרומיוגרפיה תוך שרירית בכפה הקדמית. לאחר מכן, מקם את אלקטרודת הייחוס באופן תת עורי בגפה האחורית, המוחזקת על ידי קליפס תנין מיניאטורי.
כאשר הממריץ מופעל, שימו לב לגירוי מוצלח כמו עוויתות זעירות של הכף הקדמית. זרם הגירוי המינימלי המעורר את גל M ועוויתות זעירות הנראות לעין בכפה הקדמית הם בין 10 ל -50 מיקרואמפר. בצע את הגירוי העצבי 15 פעמים עם פולסים באורך 0.2 אלפיות השנייה כל אחד.
עם הפסקות של שתי דקות בין קבוצות הגירויים, התדירות מוגברת מ 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, ל 5 הרץ. איור של ההקלטה שהוצבה במסלולים למדידת רפלקס הופמן ותגובת השרירים מוצג כאן. היחס בין משרעת גל H למשרעת גל M הוערך.
הגירוי וחפץ הגירוי בהתאמה נקבעו על אפס אלפיות השנייה, ואחריו גל M ישיר והשיא הקטן יותר שבא אחריו המייצג את גל H. גל M מתרחש כשתי אלפיות שנייה לאחר הגירוי, וגל H לאחר שש עד שמונה אלפיות השנייה בשל זמן המעבר הארוך יותר דרך חוט השדרה. לצד ההפרדה של העצבים, היישום של וזלין ג'ל על האלקטרודה וגם בין שני ווים הם קריטיים.
זהו ניסוי סופני. במעבדה שלנו, טכניקה זו סיפקה התייחסות תקן זהב חדש לרישומי H-רפלקס טרנסעוריים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לכימות רפלקס הופמן (H-reflex) בכף רגל הקדמית של עכבר באמצעות גירוי עצבי ישיר וטרמינלי. שיטה זו משפרת את ההקלטות התת-עוריות המקובלות על ידי אספקת תוצאות עקביות יותר בין עכברים שונים ובין ימים ניסויים שונים, במטרה להקל על האפיון האלקטרופיזיולוגי במודלים של מחלות כגון פגיעה בחבל השדרה ושבץ מוחי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- אלקטרופיזיולוגיה
- נוירוביולוגיה
- מידול מחלות
רקע
- רפלקס H הוא שיטה מבוססת להערכת ספסטיות.
- ניתן להעריך את שלמותם של מעגלים עצביים באופן אלקטרופיזיולוגי.
- הפרוטוקול נועד להפחית שונות במדידות הקשורות לביולוגיה של העכבר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקלטת רפלקס H באמצעות גרייה ישירה של העצב
- עכברים (C57 black/6J), בגילאי 8–16 שבועות
- אלקטרומיוגרפיה להערכת תגובת העצב והשריר
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול התרמינלי החדש מראה שונות מופחתת בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- סטימולציה מוצלחת הובילה לתגובות נצפיות בכף הרגל הקדמית, אשר תיקפו את רישומי ה-H-reflex.
- המדידות המרכזיות כוללות את יחסי האמפליטודה של גלי H וגלי M.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה מהימנה לכימות של H-reflex במחקר.
- פרוטוקול זה יכול לתמוך בחקר מצבים נוירולוגיים המשפיעים על ספסטיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה אלקטרופיזיולוגית ישירה של שלמות המעגלים העצביים תומכת בתיקוף מטרות במודלים של מחלות נוירולוגיות. פרוטוקול ה-H-reflex הטרמינלי מפחית את השונות בהערכת הספסטיות, ובכך משפר את הביטחון בניבוי למחקרים תרגומיים. הדבר מאפשר קבלת החלטות אמינה יותר לגבי המשכיות הפיתוח (go/no-go) בתיקי פיתוח פרה-קליניים המתמקדים בפגיעות חוט השדרה ובשבץ מוחי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות של שלמות מסלול הרפלקס החוטבלי.
- ערך תפעולי: מספק הפחתת סיכונים ביולוגית באמצעות מדידות של גרייה עצבית ישירה.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי מודלים של מחלה בעלי פנוטיפים אלקטרופיזיולוגיים של ספסטיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מספקת מדידות H-reflex סטנדרטיות עם שונות נמוכה בין עכברים וביני ימי ניסוי.
- פלט כמותי: מייצרת יחסי אמפליטודה בין H-wave ל-M-wave לצורך הערכה אובייקטיבית של ספסטיות.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ניתנת להתאמה לעצבים ulnar, median, tibial ו-sciatic באמצעות שינויים מינוריים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה ספסטיות לאחר שבץ באמצעות הגברה של רפלקס H המתואמת עם היפרטוניה והתכווצויות בלתי רצוניות.
- המשכיות תרגומית: משקף רישומים קליניים של רפלקס H בחולים, מה שמאפשר תיקוף בין מינים שונים.
- קידום מותאם סיכון: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי אישור מעורבות של המטרה במסלולים שדרתיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה נכללת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית במודלים של מחלות נוירולוגיות.
- ביולוגיה של הגילוי: בוחנת את הבהרת המסלול על ידי בידוד תרומות של רפלקס שדרתי לתגובת השריר.
- סריקה: מבטיחה את הדירות של הבדיקה באמצעות גירוי עצבי ישיר ובידוד באמצעות וזלין.
- אנליטיקה: מספקת את יחס H-wave/M-wave כקריאה כמותית להשוואה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: תואמת לסממנים ביולוגיים קליניים של ספסטיות באמצעות הומולוגיה אלקטרופיזיולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: קובעת רמת ייחוס של "gold-standard" לתיקוף אלקטרופיזיולוגי בין מעבדות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בניבוי על ידי הפחתת השונות במדידות של שלמות מעגלים עצביים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות בין נבדקים ובין ימי מדידה.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם יותר של מטרות שאינן ניתנות לתרגום קליני.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על תיעדוף תרכובות מותאם-סיכון על בסיס תיקוף אלקטרופיזיולוגי של המטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים בעכברים, דיסקציה של עצבים והקלטה אלקטרופיזיולוגית.
- מצריך מכשור מדויק הכולל מיקרו-מניפולטורים, מעוררים ומגברי EMG.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לטכניקות של בידוד עצבים ומיקום אלקטרודות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרוטוקול על עצבי כף הרגל האחורית.
- מוגבל בשל אופיו הסופי (terminal), דבר המונע מחקרים ארוכי טווח באותו בעל חיים.
