מיקרוסקופיה תוך-ורידית אורכית באמצעות חלון הדמיה של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה

בלוטת החלב היא דינמית מאוד ועוברת סבבים מרובים של שיפוץ במהלך החיים. הפרוטוקול שלנו מאפשר ללכוד את הדינמיקה התאית המניעה סידור מחדש של רקמות בבלוטת החלב הבריאה והחולה. חלון הדמיית החלב שלנו עם מכסה הניתן להחלפה מאפשר לבצע הדמיה תוך-ורידית אורכית של בלוטת החלב לאורך תקופות זמן ארוכות, עד מספר שבועות.

המכסה הניתן להחלפה של חלון ההדמיה של החלב מבטיח תנאי הדמיה אופטימליים בכל עת ומאפשר מניפולציה של רקמות או מתן תרופות בין מפגשי הדמיה. השיטה שלנו לא רק מספקת תובנות על ביולוגיה בריאה של בלוטת החלב, אלא גם מאפשרת לנו לחקור את התחלת גידולי החלב וההתקדמות שלהם ברמת התא הבודד. התחילו בהנחת המכסה של חלון הדמיון של היונק על משטח סטרילי והחלת דבק דבק ציאנואקרילט סביב כל היקף מכסה החישוק.

יש להניח בזהירות כיסוי זכוכית עגול בקוטר 10 מילימטרים על גבי המכסה. השתמשו במקל עץ סטרילי כדי למקם את החלקת כיסוי הזכוכית ולהפעיל כוח מסוים כדי לדחוף אותה כלפי מטה כדי להבטיח אטימה אטומה בין החלקת כיסוי הזכוכית למסגרת המכסה. וודאו שהזכוכית אינה מכסה את החורים בזרועות המכסה.

יש לחטא את המכסים ואת חלון ההדמיה של החלב על ידי טבילתם ב-80% אתנול למשך 30 דקות לפחות בצלחת פטרי סגורה. השתמשו בקצה כותנה ספוג באצטון כדי להסיר את עודפי הדבק של הציאנואקרילט על החלקת כיסוי הזכוכית. כדי להכין את העכבר לניתוח, גילחו את האזור סביב בלוטת החלב הרביעית באמצעות סכין גילוח.

השתמשו בפטמה הרביעית כנקודת ציון והסירו את השערות הרפויות באמצעות סרט דביק. בצע בדיקת משיכת כפות כדי לוודא אם בעל החיים מורדם כראוי. הרימו בעדינות את העור באמצעות מלקחיים עדינים של Graefe והשתמשו במספריים קפיציים קטנים כדי לבצע חתך אלכסוני של 10 עד 15 מילימטרים בעור על גבי כרית השומן של החלב הרביעי השתמש בפטמה הרביעית כנקודת כיוון והקפיד לא לחתוך או לפגוע בצפק או בבלוטת החלב.

הפרד את העור מכרית השומן של החלב ומשכבות הרקמה שמתחתיו באמצעות כריתה קהה של עד חמישה עד שמונה מילימטרים סביב קו החתך כדי ליצור כיס שיתאים למסגרת החלון הדמיה של החלב. הגדר את אזור העניין, או ROI, בהתבסס על התכונות המקרוסקופיות של רקמת החלב, כולל מיקום בלוטת הלימפה או נגע הגידול. נסו לשמור על ה-ROI במרכז בכל הנוגע לחתך.

הרימו את חלון ההדמיה של החלב באמצעות מלקחיים סטריליים ובדקו אם החתך גדול מספיק כדי להכניס את החלון. במידת הצורך, הגדל מעט את החתך עד שחלון הדמיה של היונק יתאים. הסר את החלון והשתמש בתפר משי 5-0 כדי להניח תפר מיתר ארנק במרחק של 1-2 מילימטרים מקצה החתך החל מהקצה הקאודלי ומבחוץ אל פנים העור.

נעים כחמישה מילימטרים למעלה לאורך החתך ומעבירים את חוט התפר דרך העור מבפנים לחוץ. חזור על הליך זה לאורך קצה החתך, ובכך צור תפר מעגלי המורכב מחמש עד שש לולאות. היציאה הסופית של חוט התפר צריכה להיות ממוקמת במרחק של כשני עד חמישה מילימטרים מהכניסה הראשונה.

התאימו את חלון הדמיון של היונק בתוך החתך והשתמשו במלקחיים של Graefe כדי למקם בזהירות את העור בחריץ החלון. הקפידו להשאיר את הלולאות של התפר בחוץ. משוך את הלולאות של תפר חוט הארנק ומושך בעדינות את שני קצות התפר כדי להדק אותו בחריץ של חלון הדמיה של החלב.

קשרו קשרים כירורגיים וחתכו את החוט העודף. השתמש בקיסם כדי למרוח ג'לי נפט על השפה הפנימית של החלון, תוך הימנעות מהרקמה שמתחת. דחפו בעדינות את מסגרת החלון כלפי מטה עם מלקחיים סטריליים והניחו את המכסה לתוך מסגרת החלון.

זה ימנע נפח של אוויר בין רקמת בלוטת החלב לבין מכסה החלון הדמיה של החלב. מניחים את קצות המלקחיים הדקים דרך החורים בזרועות המכסה ומהדקים את המכסה על ידי סיבובו בכיוון השעון. אם נשאר קצת אוויר לאחר הידוק המכסה, מכניסים מחט אינסולין סטרילית דרך העור לתוך החלל שבין רקמת החלב למכסה ולאט לאט שולפים את הבוכנה, ובכך יוצרים ואקום בין רקמת בלוטת החלב למכסה החלון הדמיה של החלב.

עכשיו את בלוטת הלימפה ניתן לראות בקלות לאחר הליך זה. בדוק את מצב מסגרת החלון הדמיה של החלב ואת המכסה, כולל יציבות התפרים או כל נזק פוטנציאלי למכסה. מקם את העכבר על השיבוץ באופן כזה שחלון הדמיית החלב נופל בחור של שיבוץ תיבת ההדמיה.

יש למרוח סרט שקוף למחצה ונייר דבק על גב העכבר כדי לייצב את העכבר ולהפחית את תנועת הרקמה עקב הנשימה. עבור מפגשי הדמיה הגדולים משלוש שעות, הניחו מחט גמישה באופן תת עורי בצוואר העכבר ואבטחו אותה באמצעות נייר דבק. חברו מזרק של 10 מילימטרים עם תערובת חומרים מזינים לצינור סיליקון גמיש ודחפו את תערובת החומרים המזינים עד שהיא מגיעה לקצה הצינור.

חברו את צינור הסיליקון למחט הגמישה והזיקו 50 מיקרוליטרים של התמיסה החדורה כל 30 דקות. הניחו את המכסה מעל תיבת ההדמיה כדי לסגור אותה. לאחר מכן, אבטח את תיבת ההדמיה בשלב המיקרוסקופ.

ודא שהעכבר יציב בתוך תיבת ההדמיה. הגדר את אזור העניין באמצעות מצב האפיפלואורסצנציה של המיקרוסקופ ויישם את הגדרות המיקרוסקופ. השתמש בפונקציה ספירלה במצב נווט תוכנת ההדמיה כדי ליצור סריקת אריחי סקירה גדולה וליצור מפת ייחוס של הרקמה.

הגדר את אזור תחומי העניין בתוך הסקירה הספירלית ולאחר מכן הגדר את מישורי Z העליונים והתחתונים כדי לקבוע את מחסנית Z. לחץ על התחל כדי לקבל את ערימות Z התלת-ממדיות או הארבע-ממדיות המפורטות של הרקמה. מניחים את קצות המלקחיים הדקים דרך חורי החלון המדמיינים של החלב בזרועות המכסה ומשחררים את המכסה על ידי פיתול נגד כיוון השעון.

לחלופין, ניתן לתמרן את הרקמה או למקם אותה מחדש באמצעות מלקחיים קהים סטריליים כדי לייעל את תנאי ההדמיה לאזור העניין הספציפי. מרחו ג'לי נפט על השפה הפנימית של חלון הדמיה של החלב, תוך הימנעות מהרקמה שמתחת. דחפו בעדינות את מסגרת החלון כלפי מטה עם מלקחיים סטריליים והניחו את המכסה לתוך מסגרת החלון.

לבסוף, מניחים את קצות המלקחיים הדקים דרך חורי זרועות המכסה ומבהירים את המכסה על ידי סיבובו בכיוון השעון. לעכברי GFP ממברנת עגבניות-ממברנה Rosa26-Pubertal Rosa26 הוזרקה מינון נמוך של טמוקסיפן, מה שהוביל לרקומבינציה בתיווך Cre של אלל GFP של ממברנת עגבניות-ממברנה Rosa26. העכברים צולמו בימים הראשון, השלישי והחמישי כדי לעקוב אחר השינויים הדינמיים בבלוטת החלב המתפתחת.

התמונות הייצוגיות מציגות את העיבוד התלת-ממדי של צינור חלב מוארך ומסתעף במשך מספר ימים שצולמו דרך חלון הדמיה של יונקים. תמונות מישור Z בודדות של קצה ההסתעפות והענף המאריך מוצגות כאן. תאים בודדים בסטרומה מודגשים על ידי כוכביות לבנות.

התמונות המייצגות מראות את בלוטת הלימפה המפשעתית של העכבר המצולמת דרך חלון הדמיה של יונקים. הדור ההרמוני השני מתואר בירוק. תמונות מעובדות בתלת-ממד של מבנה תעלת החלב של נקבת עכבר CFP של קרום E-cadherin בוגר במשך מספר ימים רצופים מוצגות כאן.

תבנית הקולגן I שימשה כדי לשחזר את אותו ROI ואות CFP של קרום E-cadherin שימש לסימון תאי הצינור. עכברים ירוקים-אדומים של Kikume צולמו ביום אפס לפני ואחרי החשיפה לאור סגול. מפגשי ההדמיה חזרו על עצמם בימים 2, 6 ו-10 לאחר ההמרה.

אותו אזור של בלוטת החלב צולם דרך חלון הדמיה של יונקים במשך 10 ימים. אזורים קטנים יותר הומרו באופן מצולם ביום אפס והראו קצב דילול דומה של האות האדום של קיקומה לאורך זמן, מה שמעיד על קצב תחלופה שווה בכל האפיתל. תמונות זום של האזורים המצוינים מראות הטרוגניות מתפשטת ברמה התאית שישה ועשרה ימים לאחר המרת תמונות.

כימות היחס בין אדום לירוק של תאים שונים 10 ימים לאחר המרת תמונה חשף שיעורי דילול משתנים מאוד של תאים מסוימים בתוך אותה מיקרו-סביבה של צינורות. שלב מכריע בהליך זה הוא פתיחת המכסה בין מפגשי ההדמיה. תכונה ייחודית זו של החלון משפרת את תנאי ההדמיה ומאפשרת הדמיה אורכית של הרקמה.

חלון ההדמיה של החלב עם מכסה הניתן להחלפה יאפשר שאלות חדשות לגבי in vivo, בדיקות תרופות מהירות והקרנה בתחום התחלת הגידול וההתקדמות בבלוטת החלב של העכבר.