בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

מילה זו מתארת ניתוח נשימה בעיבוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר. פרוטוקול זה מפחית במידה ניכרת את זמן הטיהור ומאפשר עיבוד של דגימות מרובות בו-זמנית. מיטוכונדריה מבעלי חיים בכל שמונה מינים של רקע מאוחד ניתן להשחתה באמצעות פרוטוקול זה המאפשר את חקר הנשימה במגוון רחב של תנאים ניסיוניים.

שיטה זו מתאימה לכל תחומי המחקר שבהם תפקוד המיטוכונדריה רלוונטי כולל הזדקנות, בדיקות סמים, סרטן או פיתוח. זה יכול אפילו להיות מותאם לרקמות ואורגניזמים אחרים גם כן. ודא שכל החומרים קרים על ידי הנחת הכל על הקרח במהלך ההליך כדי להגן על המיטוכונדריה מפני נזק.

מניחים שלוש כוסות 50 מיליליטר לכל מדגם על קרח ומוסיפים 10 מיליליטר של PBS בכוס אחת, 10 מיליליטר של 10 מילימטרים EDTA PBS בכוס שתיים, וארבעה מיליליטר IB1 בכוס שלוש. לרסס את הגפה האחורית הימנית של עכבר מורדם עם 70% אתנול כדי למנוע פרווה לשפוך ולהדביק את האיבר ללוח כריתת הפקק ולאחר מכן להדביק את איבר החזית השמאלית. בצע חתך עם אזמל חד פעמי סטרילי דרך העור מכף רגל ועד ראש.

לאחוז את העור עם מלקחיים שיניים בגובה הקרסול לחתוך אותו עם מספריים עדינים סביב הקרסול. הקלו את העור הרחק מהשרירים שמתחתיו עם פינצטה עדינה ביד אחת תוך משיכתו למעלה עם מלקחיים בעלי שיניים ביד השנייה. לנתח את כל שרירי השלד מהקרסול לברך ולהסיר את כל רקמת החיבור מעל השריר הקדמי tibialis באמצעות פינצטה עדינה ומספריים.

מצא את ארבעת הגידים הדיסטליים של שריר longus ארוך digittensor digitoror extensor ולחתוך אותם קרוב הוספות שלהם בהונות. אתר את הגיד הדיסטלי הקדמי של טיביאליס וחתוך אותו קרוב להכנסתו מתחת לקרסול. משוך את הגידים הקדמיים וההרחבה של digitorum longus מעל הקרסול כדי לשחרר את הקצוות הרופפים.

לאחוז את הקצוות הרופפים של הגידים ולהקל על השרירים הרחק משאר השרירים בעצמות על ידי משיכתם למעלה. חותכים את הגידים הפרוקסימליים של השרירים האלה קרוב ככל האפשר לפיקת הברך. הפוך את העכבר כדי להמשיך עם גסטרוקנימוס ומיצוי שריר סולוס.

לאחוז בכיס שנוצר בין שרירי הזרוע, עצם הירך, ואת gastrocnemius ולהפריד את השרירים האלה באמצעות מספריים עדינים כדי לדמיין את גיד gastrocnemius הפרוקסימלי. לאחוז ולחתוך בזהירות את גיד אכילס דיסטלי עם מספריים עדינות. חותכים את גיד הגסטרוקנמיוס הפרוקסימלי ומשחררים אותו עם הסוליה הבסיסית.

בזהירות לנתח את השרירים הנותרים ולהצמיד מחדש את העכבר במיקום הראשוני כדי לנתח את שריר הארבע ראשי. להשליך את רקמת השומן ולאחר מכן להכניס פינצטה עדינה בין quadriceps ואת עצם הירך כדי להפריד את השריר מן העצם. אוחזים בגידי השרירים של שריר הארבע ראשי הדיסטלי וחותכים את הגיד קרוב ככל האפשר לפיקת הברך.

משכו את שריר הארבע ראשי למעלה ושחררו אותם עם מספריים עדינות בהכנסה הפרוקסימלית. חזור על אותו הדבר עבור הגפה האחורית השמאלית. לשטוף את כל השרירים בכוס אחת, אז שתיים, ואחריו שלוש.

לבסוף, לטחון את כל השרירים בכוס שלוש עם מספריים חדים על קרח. מעבירים את ההשעיה לצינור C, סוגרים אותו בחוזקה, ומצמידים אותו הפוך על שרוול ההומוגניזר. מחלקים את ההומוגנט לשני צינורות מיקרו צנטריפוגות מיקרו מצוננים מראש 2 מיליליטר וצנטריפוגה במשך 10 דקות.

לאחר מכן להעביר את supernatant לצינורות מצוננים מראש חדשים צנטריפוגה במשך 10 דקות נוספות. שלבו את הכדור ב-500 מיקרוליטרים של IB2 העבירו את הסופר-נרטיב לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש של 2 מיליליטר שצונן מראש ותייגו אותו כמספר שתיים על-טבעי, או SN2. להשעות מחדש את הכדור המיטוכונדריאלי הסופי ב 200 מיקרוליטרים של חיץ השעיה מחדש.

הקצו במהירות 10 מיקרוליטרים לכימות חלבונים והוסיפו מיד 10 מיקרוליטרים של 10% FFA BSA למתלים המיטוכונדריאליים הנותרים כדי למנוע נזק. צנטריפוגה ההשעיה המיטוכונדריאלית המרוכזת ב 10, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשעות מחדש את הכדור המיטוכונדריאלי ב 100 microliters של 1X צימוד בדיקת מדיום עם BSA, 1X זרימת אלקטרונים בדיקת מדיום עם BSA, או 1X בטא חמצון מדיום עם BSA, בהתאם לפרוטוקול להתבצע.

לדלל מדגם מיטוכונדריאלי מרוכז זה ל 0.2 מיקרוגרם לכל מיקרוליטר באמצעות מדיום הבדיקה המתאים. זרע 50 מיקרוליטרים של ההשעיה לבאר בצלחת מיקרו 24 מצוננת מראש על קרח. בבארות תיקון הרקע, הוסף את מדיום הבדיקה המתאים בלבד.

יש לאחסן את ההשעיה המיטוכונדריאלית הנותרת במינוס 80 מעלות צלזיוס לקביעת טוהר הפיצול. מסובבים את צלחת המיקרו בצנטריפוגה הכנה מצוננת מראש במשך 20 דקות. בינתיים, לחמם את המדיום הבדיקה הנותרת עד 37 מעלות צלזיוס.

לאחר צנטריפוגה, להשאיר את צלחת מיקרו על הספסל במשך חמש דקות כדי שיווי משקל. הוסף 450 מיקרוליטרים של מדיום הבדיקה החמה לבאר לאט ובזהירות כדי למנוע ניתוק של המיטוכונדריה. מניחים את צלחת המיקרו מיד במכשיר מדידת צריכת החמצן ללא המכסה ולהתחיל את תוכנית המדידה.

ודא כי הצעד הראשון הוא דגירה של 10 דקות כדי לאפשר לצלחת המיקרו להתחמם. לאחר סיום הניסוי, הסר את המחסנית ואת לוחית המיקרו, כבה את המכשיר והתחל בניתוח. פרופילי חלבון כלליים מהשברים השונים שהושגו באמצעות צנטריפוגות סדרתיות הראו אוכלוסיות חלבונים שונות בשברים המבודדים.

נוכחותו של כל התוכן המיטוכונדריאלי ניכרת על ידי האותות החזקים עבור סמנים של הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית והפנימית וחלבונים הקשורים לנוקלואיד. שבר N מייצג גרעינים וחומר לא מסולף. רוב הרשתית האנדופלזמית, קרום הפלזמה או סמני הציטופלסמה בשברירי SN1 או SN2 מדגישים את הטוהר הגבוה המתקבל במהלך הבידוד.

עלייה בצריכת החמצן נצפתה לאחר תוספת ADP בבדיקות צימוד חמצון בטא. לאחר קרבונל ציאניד-p-trifluoromethoxy פנילhydrazone תוספת, צריכת חמצן הגיעה לרמה הגבוהה ביותר שלה. יחס שליטה נמוך בדרכי הנשימה מבטיח את שלמות המיטוכונדריה המבודדת.

בדיקת זרימת האלקטרונים בחנה את הפעילות של מתחמי שרשרת הובלת האלקטרונים בנפרד או בשילוב באמצעות הזרקת מצעים ומעכבים ספציפיים. בידוד המיטוכונדריה רגיש ביותר. לפיכך כל השלבים לאחר הפחתת רקמות צריך להתבצע בחריצות ובזהירות כדי לשמור על הכדאיות שלהם.

בדיקות ניסיוניות ניתן להחמיא עם ניתוח סמטי דטרמיניסטי של מולקולות מיטוכונדריה מפתח או עם המחקר של הרכבה של קומפלקסים respirometric באמצעות אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד יליד כחול.