כימות של התפלגות גליקוגן תת-תאית בסיבי שריר השלד באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

המידה של תוכן גליקוגן בתאים בודדים ובארגונים תת-תאיים חשובה מכיוון שברוב סוגי התאים, תאים בודדים מסתגלים באופן שונה למצבים ומחלות פיזיולוגיים משתנים. אז, היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הרזולוציה הגבוהה מאוד במיקרוסקופ האלקטרונים של השידור. זה משפר את האפשרות שיש מבנים תת-תאיים מקומיים וגם בתוכן זה בטכניקה זו כאן, חשוב כי כתמי גליקוגן הוא ללא נוגדנים.

אז, אין לנו שום פרטים לדאוג לגביהם. על מנת לקבל ניגודיות טובה יותר על גליקוגן, פשוט להשתמש אשלגן ferrocyanide 1.5% במקום אשלגן ferrocyanide. הכן 1.6 מיליליטר של הפתרון הקיבוצי העיקרי על ידי הוספת 2.5% glutaraldehyde ב 0.1 חיץ קקודילאט נתרן טוחן בצינור מיקרו-צנטריפיקציה שני מיליליטר.

יש לאחסן אותו בטמפרטורה של 5 מעלות צלזיוס למשך 14 יום לכל היותר. לבודד דגימה קטנה מן הביופסיה שריר או שריר שלם אשר יש קוטר מקסימלי של מילימטר אחד בכל כיוון והוא ארוך יותר אורך מאשר חתך. מניחים את הדגימה בצינור המכיל את פתרון הקיבעון הראשי הקר.

לאחסן אותו בחמש מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר מכן לשטוף את הדגימה ארבע פעמים במאגר 0.1 טוחן נתרן קקודילאט. באמצעות פיפטות העברה, הסר את המאגר המשומש מהצינור והשאיר את הדגימה ללא פגע והוסף את המאגר הטרי.

לאחר תיקון הדגימה עם 1% אוסמיום tetroxide ו 1.5% אשלגן ferrocyanide ב 0.1 חיץ קקודילאט נתרן טוחן במשך 120 דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש לשטוף את הדגימה פעמיים במים מזוקקים כפולים בטמפרטורת החדר. להתייבש על ידי שקיעה בסדרה מדורגת של אתנול בטמפרטורת החדר.

לחדור את הדגימה עם תחמוצת פרופילן ו שרף אפוסידי מדורג תערובות בטמפרטורת החדר באמצעות יחסי נפח שהוזכרו. למחרת, הטמע דגימות ב 100% שרף epossidic טרי בתבניות פולימרי ב 60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. הר בלוק של דגימה על מחזיק ultramicrotome.

חותכים את הבלוק על פני השטח עם סכין גילוח כדי להגיע לרמת הרקמה. הצמידו סכין יהלום לפני הדגימה ויישרו את משטח הדגימה במקביל לסכין. הפק קטע דק למחצה של עובי מיקרומטר אחד עם סכין היהלום כדי לבדוק את כיוון המדגם.

הכתימו את החלק הדק למחצה בכחול טולואידין לתצפית עם מיקרוסקופיה קלה. לאחר מכן לקצץ את הבלוק עוד יותר כדי להפחית את שטח העניין כדי לקבל קטעי ultrathin מתאימים. חותכים 60 עד 70 ננומטר עובי ultrathin קטעים עם סכין יהלום שנייה.

אסוף מקטע אחד או שניים על רשת נחושת שלמה אחת באמצעות לולאה מושלמת. להשוות את החלקים, לטבול את הרשתות בתמיסת אצטט uranyl במשך 20 דקות ולשטוף את הרשתות במים מזוקקים כפול ולאחר מכן לטבול את הרשתות ציטראט עופרת במשך 15 דקות ולשטוף מחדש את הרשתות במים מזוקקים כפול. הפעל את מחשב מיקרוסקופ אלקטרוני השידור ותוכנת הקלטת תמונה, להקליט תמונות דיגיטליות עם מצלמת CCD סריקה איטית דיגיטלית ואת תוכנת ההדמיה המשויכת.

לאחר החדרת הרשת עם מקטעים מרובים בשלב המיקרוסקופ, לסנן את הרשת בתחילה בהגדלה נמוכה כדי לבחור את החלקים באיכות הטובה ביותר ולקבוע את הכיוון של סיבי השריר. המוקד הבא, התמונה בהגדלה מעל 30,000 עם הקורה מרוכזת בסיבים היקפיים במקטע ולהקליט תמונות עם זמן חשיפה של שנייה אחת בהגדלה הרצויה. ודא כי התמונות מופצות על פני האורך והרוחב של הסיבים בסדר שיטתי בוטים אקראי כדי להשיג תוצאות לא משוחדות ולחזור על ההדמיה עד שישה עד 10 סיבים הם בתמונה.

יבא תמונות לתמונה J על-ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן פתח. הגדר קנה מידה כללי כך שיתאים לגודל המקורי של התמונה על-ידי לחיצה על ניתוח ולאחר מכן הגדרת קנה מידה. כדי להגדיל את התצוגה ב- 100%, לחץ על התמונה, עבור אל מרחק מתצוגה ולחץ על.

מדוד את העובי של דיסק Z אחד לכל תמונה של שטח myofibrillar באמצעות הכלי קו ישר מתפריט הכלים וחשב את עובי דיסק Z הממוצע של כל אחד מששת עד 10 סיבים. השתמש בכלי הקו המפולח כדי למדוד את אורך המיופיבריל החיצוני ביותר הנראה ממש מתחת לאזור התת-קרקעי. כדי להוסיף רשת, לחץ על נתח, בחר כלים ולאחר מכן בחר רשת.

עכשיו להגדיר את השטח לנקודה ב 32, 400 ננומטר רבוע. ספור את מספר הלהיטים באורך הזמין ב- 12 התמונות התת-קרקעיות שבהן צלב פוגע בגליקוגן התת-קרקעי. הוסף רשת על ידי לחיצה על ניתוח ולאחר מכן בחר כלים, ואחריו רשת והגדר שטח לנקודה ב 160, 000 ננומטר מרובע.

ספרו את מספר הלהיטים בתמונות המיופיברילר ה-12 שבהן צלב פוגע בחלל התוך-מיופיברילר. לאחר מכן, כדי להוסיף רשת, לחץ על נתח, בחר כלים ולאחר מכן בחר רשת. עכשיו להגדיר את השטח לנקודה ב 3, 600 ננומטר מרובע.

ספרו את מספר הלהיטים בתמונות המיופיברילר ה-12 שבהן צלב פוגע בגליקוגן התוך-מיופיברילר. הוסף רשת על ידי לחיצה על ניתוח, ולאחר מכן בחר כלים, ואחריו רשת והגדר שטח לנקודה ב 32, 400 ננומטר מרובע. תספור את מספר הלהיטים בתמונות המיופיברילר ה-12 שבהן צלב פוגע בגליקוגן הבין-מיופיברילר.

באמצעות רשת 32, 400 מ"ר כדי לבחור באופן אקראי את חלקיקי הגליקוגן, להתחיל עם הריבוע השמאלי העליון ולנוע שמאלה במידת הצורך. באמצעות הכלי קו ישר, מדוד את הקוטר של חמישה חלקיקי גליקוגן שנבחרו באקראי של כל מאגר עבור כל אחת מ-12 התמונות כדי להשיג בממוצע 60 חלקיקים לבריכה לכל סיב. נתון זה מציג את הערכים הרגילים של שלוש בריכות הגליקוגן.

ניתן לראות כי ערכי גליקוגן intermyofibrillar מופצים קרוב לנורמלי, ואילו הן intramyofibrillar והן גליקוגן תת-קרקעי להראות התפלגות מוטה שבו סיבים לפעמים יש כמות מופרזת של גליקוגן. בין כל השלבים חשוב מאוד להשתמש אשלגן ferrocyanide. הניתוח של גליקוגן יכול להיות משולב עם ניתוח של מיטוכונדריון וטיפות שומנים אשר יכול לשפר את ההבנה שלנו כיצד רכיבים מטבוליים מפתח אחרים בקורלציה עם גליקוגן ובריאות השרירים.