טכניקת שבירת מיקרוטובולים כמותית להפרדת מיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים לאביליים וטובולין חופשי ברקמות עכבר
17 בנובמבר 2023
מיקרוטובולים, שהם פולימרי טובולין, ממלאים תפקיד מכריע כמרכיב שלד ציטוקריוטי בתאים אאוקריוטים וידועים בחוסר היציבות הדינמי שלהם. מחקר זה פיתח שיטה להפרדת מיקרוטובולים כדי להפריד אותם למיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים שפתיים וטובולין חופשי כדי להעריך את יציבותם של מיקרוטובולים ברקמות עכבר שונות.
הפרוטוקול החדש שלנו מסייע להבחין ולכמת שלושה סטטוסים של טבעות צינור, כגון מיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים שפתיים וצינוריות חופשיות ברקמות בעלי חיים. טכניקה זו מורכבת מצעדים פשוטים ויכולה להעריך את היציבות המבנית של הצינורות, שלא ניתן לזהות על ידי כימות של צינורות לאחר שינוי תרגומי. שיטה זו חיונית למחקר ופיתוח של דרכים טיפוליות למחלות שבהן יציבות המיקרוטובולים היא קריטית, כגון מחלת אלצהיימר וסרטן.
התחל את ההליך על ידי הכנת ללבוש מעבדה עבור דיסקציה רקמות. ממלאים קופסה בקרח כתוש ומניחים עליה שתי צלחות פטרי. מלאו צלחת אחת בתמיסת חיץ פוספט קרה כקרח או PBS לשטיפה חולפת ואחסון של רקמות מנותחות.
הניחו נייר פילטר טבול ב-PBS על המנה השנייה. לאחר מכן, לשקול את microtubes 1.5 מיליליטר מלא PBS עבור אחסון רקמות מנותחות. לאחר חילוץ הרקמות מעכבר שעבר המתת חסד, העבירו אותן לצינורות ושקלו מחדש כל מיקרו-צינור.
העבר את הרקמות לתוך הומוגנייזר זכוכית עם חיץ מייצב מיקרוטובול קר כקרח או MSB + מדיום, והומוגניזציה של הרקמה באופן מיידי באמצעות הומוגנייזר מצונן. עכשיו להעביר את הרקמה הומוגנט מיקרו שני מיליליטר באמצעות פיפטה פסטר צנטריפוגה ב 2, 400 גרם במשך שלוש דקות בשתי מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנאטנט למיקרו-צינור חדש של 1.5 מיליליטר כדי להסיר את הפסולת.
מערבול את הסופרנאטנט או את שבר S1 במיקרו-צינור חדש של 1.5 מיליליטר. מיד פיפטה 200 מיקרוליטר של חלק S1 לתוך מיקרו צינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 100, 000 G באמצעות רוטור TLA-55 במשך 20 דקות בשתי מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה השנייה, הפרידו את הסופרנאטנט S2 מהמשקע P2.
מיד להעביר את כל כמות של חלק S2 לתוך microtube צנטריפוגה ולהשתמש ברוטור TLA-120.2 כדי לסובב אותו ב 500, 000 G במשך 60 דקות בשתי מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה השלישית, הפרידו את הסופרנאטנט S3 מהשקע P3. ממיסים את כל מקטע S3 ב-200 מיקרוליטר של 2X נתרן דודציל סולפט, או מאגר דגימות SDS.
ערבב את שברי S1 הנותרים עם נפח שווה של מאגר דגימות SDS 2X לשימוש כעקומה סטנדרטית עבור כתמים מערביים. לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר דגימת SDS לצינורות השבר P2 ו- P3. לאחר מכן, הפעל בקצרה את התמיסה כדי להמיס את המשקע לפני העברת הדגימות למיקרו-צינוריות חדשות של 1.5 מיליליטר והצבתן בארגז הקרח.
מרתיחים את כל הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. מיקרוטובולים במקטע P2 היוו 34.86% מכלל האלפא-טובולין במוח עכבר, בעוד שאלו בשברים P3 ו-S3 היוו 56.13% ו-9.01% בהתאמה. אחוז הטובולין בטא-3 בשברים P2, P3 ו-S3 לא היה שונה באופן משמעותי מזה של אלפא-טובולין.
שבר S2 הראה מעבר מוגבל של טובולין דרך עמוד ספין אולטרה-סינון של 300 קילודלטון, בעוד שחלק S3 איפשר מעבר מלא של קומפלקסים של טובולין. הפרדה כרומטוגרפית הביאה לפליטה של 100 קילודלטון של טובולין S3. פרופורציות שוות של אלפא ובטא-טובולין נמצאו בכל שבר.
שברי P2 הועשרו באופן משמעותי באלפא-טובולין אצטילט, בעוד שאלפא-טובולין עם טירוזין היה דומיננטי במקטע P3. הקפאת המוח לפני ההומוגניזציה גרמה לירידה בריכוז אלפא-טובולין בשברי P2. עם זאת, אלפא-טובולין גדל בחלק P3.
הקפאה גם הפחיתה את רמות האצטילציה והעלתה את רמות הטירוזינציה של אלפא-טובולין בחלק P2. הטיפול בנוקודזול הפחית אלפא-טובולין בחלק P2. בניגוד להקפאה, נוקודזול לא השפיע על השינויים שלאחר התרגום של טובולין P2.
רקמת המוח הציגה ריכוז גבוה משמעותית של טובולינים P2, בעוד שטובולינים P3 התרכזו ברקמת שגשוג. כתמים מערביים הראו כי טובולין P2 שנמצא במיוחד במערכת העצבים מקורו במיקרוטובולים יציבים, וטובולין P3 מקורו במיקרוטובולים שפתיים. יציבות מיקרוטובולים היא דינמית ביותר.
חשוב להשלים פרוטוקול זה במהירות, ללא הפרעות, בסביבת הטמפרטורה הקרה. כמו כן, ודא שהרקמות והשברים לא הוקפאו עד שהומסו במאגר דגימת SDS. שילוב של הצגה חיסונית באמצעות כל שבר עם פרוטאומיקה צפוי לזהות גורמים המעורבים בדינמיקה של מיקרוטובול.
באמצעות שיטה זו גילינו כיצד טאו נורמלי קיים על מיקרוטובולים. זה יכול לשמש גם כדי לחקור איך זה הופך להיות חריג במוחות זקנים על מנת לזהות מטרות סמים חדשות של דמנציה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול חדש להבחנה וכמימות של מיקרוטובוליים יציבים, מיקרוטובוליים לא יציבים וטובולין חופשי ברקמות בעלי חיים. השיטה מעריכה את היציבות המבנית של המיקרוטובוליים, שהיא קריטית להבנת מחלות כגון אלצהיימר וסרטן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- דינמיקה של מיקרוטובוליים
רקע
- מיקרוטובוליים הם מרכיבים חיוניים של השלד התאי בתאים איקריוטיים.
- הם מפגינים אי-יציבות דינמית, המשפיעה על תפקודים תאיים.
- הבנת היציבות של המיקרוטובוליים היא קריטית לפיתוחים טיפוליים.
- מחלות כמו אלצהיימר וסוגים מסוימים של סרטן קשורות לתפקוד לקוי של המיקרוטובוליים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לפראקציונציה של מיקרוטובוליים ברקמות עכבר.
- הערכת היציבות של מצבים שונים של מיקרוטובוליים.
- העמקת ההבנה של מחלות הקשורות למיקרוטובוליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת ביגוד מעבדה עבור דיסקציה של רקמות.
- שימוש בתמיסת בופר פוספט קרה (קרח) לטיפול ברקמות.
- פרקציונציה של מיקרוטובוליים לטובולין יציב, לא יציב (labile) וחופשי.
- כימות יציבות המיקרוטובוליים באמצעות הפרוטוקול החדש.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מבדיל ביעילות בין מיקרוטובוליים יציבים לבין מיקרוטובוליים לא יציבים (labile).
- הכמיית הנתונים חושפת תובנות לגבי יציבות המיקרוטובוליים ברקמות שונות.
- השיטה פשוטה וניתנת לשחזור לשימוש במעבדה.
- הממצאים תורמים להבנת הדינמיקה של המיקרוטובוליים בהקשרי מחלה.
מסקנות
- פרוטוקול חדש זה הוא כלי בעל ערך עבור חוקרים הבוחנים את יציבות המיקרוטובוליים.
- יש לו יישומים פוטנציאליים בהבנה ובטיפול במחלות הקשורות לתפקוד לקוי של המיקרוטובוליים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לבחון נתיבים טיפוליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
הערכה מדויקת של יציבות המיקרוטובוליים חיונית לבחינת מנגנונים טיפוליים במחלות ניווניות של מערכת העצבים ובסרטנים, שבהם הדינמיקה של השלד התאי משפיעה על התגובה לתרופה. טכניקת הפרקציה זו מאפשרת כימות ישיר של מאגרי טובולין יציבים, לא יציבים (labile) וחופשיים ברקמות טבעיות, ובכך מספקת מדד ביוכימי המשלים דימוי ובדיקות ספציפיות למודיפיקציות. על ידי הבחנה בין מצבים פונקציונליים של המיקרוטובוליים, השיטה תומכת בתיקוף של מטרות ובצמצום סיכונים מנגנוניים בתוכניות גילוי מוקדמות המתמקדות בחומרים המשפיעים על מיקרוטובוליים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזה טיפולית על ידי כימות שינויים באוכלוסיות של מיקרוטובוליים יציבים לעומת לא יציבים בתגובה לטיפול בתרכובת.
- ערך תפעולי: מספק בדיקה ביוכימית מבוססת רקמה לתיקוף של מעורבות המטרה (target engagement) של חומרים מייצבים או דסטביליזציה של מיקרוטובוליים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי מתאם בין ייצוב ביוכימי של מיקרוטובוליים לתוצאות תפקודיות במערכות רלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצרת נתונים כמותיים של הפרדת טובולין המתאימים לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של ספריות תרכובות המכוונות לדינמיקה של מיקרוטובוליים.
- שחזוריות: משתמשת בשלבי אולטרסנטריפוגציה סטנדרטיים כדי להשיג הפרדה עקבית של פרקציוני מיקרוטובוליים בין ניסויים שונים.
- יכולת הרחבה: תואמת ל-western blotting ולמעקב פרוטאומי לצורך זיהוי רגולטורים של יציבות מיקרוטובוליים מתוך מאגרי טובולין שהופרדו.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מזהה וריאציות ספציפיות לרקמות ביציבות של מיקרוטובוליים המתואמות עם יכולת פרוליפרטיבית, מה שמאפשר סטרטיפיקציה של מודלים פרה-קליניים.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין מצבים ביוכימיים של מיקרוטובוליים לבין חתימות של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות (למשל, acetylation במאגרים יציבים, tyrosination במאגרים לביליים) לצורך התאמה של ביומרקרים.
- קידום מותאם סיכון: תומך בהחלטות go/no-go על ידי אספקת מדדי יציבות כמותיים החוזים את האינדקס הטיפולי בתוכניות המכוונות למיקרוטובוליים.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המוליך (lead optimization), כאשר יציבות המיקרוטובוליים משמשת כביומארקר פרמקודינמי לאישור מנגנון הפעולה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מדידת שינויים במצבי פולימריזציה של מיקרוטובולי שנוצרו כתוצאה מחשיפה לתרכובות, בתוך ליזאטים של רקמות טבעיות.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות ספי סדימנטציה מוגדרים (100,000 × g עבור מיקרוטובולי יציבים, 500,000 × g עבור מיקרוטובולי לא יציבים) כדי להבטיח פראקציונציה הניתנת לשחזור.
- אנליטיקה: מייצר קריאות כמותיות של tubulin באמצעות western blot של פראקציות P2 (יציבה), P3 (לא יציבה) ו-S3 (tubulin חופשי) להשוואת השפעות של תרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשר נתוני פראקציונציה של מיקרוטובולי לדפוסי ביטוי ספציפיים לרקמה ולפרופילי מודיפיקציה לצורך תיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ביוכימית רב-פעמית להערכת תרכובות המכוונות למיקרוטובולי במגוון תחומי מחלה וסוגי רקמות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי מדידה ישירה של מצבי פולימריזציה של מיקרוטובוליים, במקום להסתמך אך ורק על מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות פרמטרי צנטריפוגה סטנדרטיים ועיבוד תחת בקרת טמפרטורה לשמירה על שלמות המיקרוטובוליים.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת תיקוף אורתוגונלי של מנגנון פגיעה במיקרוטובוליים מעבר לבדיקות תאיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם-סיכון בהתבסס על יעילות ייצוב כמותית ברקמות רלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות של הומוגניזציה של רקמות ואולטרסנטריפוגציה כדי לשמור על יציבות המיקרוטובוליים במהלך העיבוד.
- תלוי בגישה לרוטורים במהירות גבוהה (TLA-55 ו-TLA-120.2) המסוגלים להגיע ל-100,000 × g ו-500,000 × g לצורך הפרדת פראקציות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תזמון הפרקציונציה והטמפרטורה כדי להבטיח תוצאות עקביות בין מעבדות.
- נדרשת התאמה של הרכב הבאפר ושל פרמטרי הסנטריפוגציה בעת יישום השיטה על רקמות שאינן עצביות, בעלות צפיפויות שונות של מיקרוטובוליים.
- מוגבל על ידי הצורך בעיבוד מיידי כדי למנוע דפולימריזציה מלאכותית של המיקרוטובוליים במהלך הטיפול בדגימות.
