Name: הובלת ברזל כמותית על פני שליבת העכבר In Vivo באמצעות איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: למד כיצד לכמת הובלת ברזל איזוטופית ללא רדיואקטיביות בעכברים בהריון באמצעות ICP-MS. שיטה זו מאפשרת מעקב בטוח אחר הפצת ברזל ברקמות עובריות ומושליות ללא סיכוני רדיואקטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים על השימוש במתקן ICP-MS במרכז UC להשלכות סביבתיות של ננוטכנולוגיה ב-CNSI באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס על עזרתם באופטימיזציה של הפרוטוקול למדידות 58Fe. המחקר נתמך על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של NIH (NIDDK) (K01DK127004, to VS) והמכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD) (R01HD096863, ל-EN).

כל הפרוטוקולים והנהלים הניסיוניים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס.
1. הכנת 58Fe-Tf
הערה: הפרוטוקול משתמש ב- 58Fe; עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול זהה עבור 57Fe. ניתן להשתמש בכל אחד מהאיזוטופים ולהשליך אותם ככימיקל ברזל סטנדרטי ללא אמצעי זהירות נוספים.
<ol><li>יש להמיס 58 Fe ב-12 N HCl ב-50 μL של HCl/מ"ג של 58Fe.<ol><li>הוסיפו HCl למתכת בבקבוקון הזכוכית שסופק על ידי הספק, והחליפו את המכסה באופן רופף. כדי להמיס את הברזל, יש לחמם את תמיסת 58Fe/HCl ל-60°C למשך שעה אחת. אם עדיין לא מומס, השאירו את התמיסה למשך הלילה בטמפרטורת החדר במכסה האדים כדי להתמוסס. הערה: תמיסת 58Fe/HCl מומסת בצבע כתום-צהבהב. Fe3O4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4H2 O</li>
	</ol></li>
	<li>חמצנו את כל Fe(II)Cl2 הנותר כדי ליצור את תמיסת Fe(III)Cl3 .<ol><li>חממו את תמיסת 58Fe/HCl ל-60°C כשהמכסה כבוי כדי להקל על החמצון.</li>
		<li>יש להוסיף 1 μL של 35% H2 O2 לכל 50 μL של תמיסת 58Fe/HCl כדי להקל עוד יותר על החמצון. Fe(II)Cl2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2 O</li>
	</ol></li>
	<li>הכן את תמיסת ברזל כלוריד (58Fe(III)Cl3).<ol><li>השאירו את תמיסת הברזל כלוריד במכסה המנוע בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס כשהמכסה כבוי כדי לאדות את הדגימה. הערה: האידוי עשוי להימשך בין יום אחד למספר ימים.</li>
		<li>צור מחדש 58 Fe(III)Cl 3 עד 100 mM עם Ultrapure H 2 O, וחשב את כמות האולטרה-טהור H 2 O הנדרשת בהתבסס על משקל המתכת הראשוני המשמש בשלב 1.1 (משקל מולקולרי של 58 Fe(III)Cl3 הוא 162.2).</li>
	</ol></li>
	<li>הכן 58 Fe(III)-nitrilotriacetate (NTA) על ידי דגירה 58Fe(III)Cl 3 עם NTA ביחס טוחן 1:5 בנוכחות 20 mM NaHCO3.<ol><li>הכן 500 mM NTA ב 1 N NaOH.</li>
		<li>הכן 5x מאגר טעינה טרנספרין (0.5 M HEPES, pH 7.5; 0.75 M NaCl).</li>
		<li>הכן 1 M NaHCO3 ב-H2O אולטרה-טהור.</li>
		<li>לצינור חרוטי של 15 מ"ל, הוסף 150 μLשל 100 mM 58 Fe(III)Cl 3 פתרון (משלב 1.3.2), 150 μL של 500 mM NTA מוכן ב 1 N NaOH, 480 μL של ultrapure H2O, 200 μL של 5xמאגר טעינה טרנספרין, ו 20 μLשל 1 M NaHCO 3 פתרון.</li>
		<li>דוגרים את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li>
	<li>טען apo-Tf עם 58 Fe(III)-NTA כדי ליצור 58Fe-Tf. הערה: פרוטוקול זה הותאם ממקארתי וקוסמן28.<ol><li>יש להמיס 500 מ"ג של apo-Tf ב-4 מ"ל של מאגר טעינת Tf אחד.</li>
		<li>לצינור החרוטי של 15 מ"ל בשלב 1.4.4 המכיל 1 מ"ל מתמיסת 58Fe(III)-NTA, הוסף 4 מ"ל של תמיסת apo-Tf. הערה: זהו יחס טוחן 3:1 של 58Fe-NTA עם apo-Tf. כל Tf מכיל 2 אתרי קשירה Fe; עודף 58Fe-NTA נוסף כדי להבטיח כי Tf היה טעון במלואו.</li>
		<li>כדי לאפשר טעינה מקסימלית של 58Fe-NTA על apo-Tf, בדוק שהפתרון נמצא ב- pH 7.5, והתאם את ה- pH, במידת הצורך, עם NaHCO3 או HCl.</li>
		<li>דגירה במשך 2.5 שעות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li>
	<li>הסר עודפים לא מאוגדים 58Fe(III)-NTA ושחרר את NTA.<ol><li>מעבירים את תמיסת 58 Fe-Tf לעמוד חיתוך במשקל מולקולרי (חיתוך של 30 kDa) וצנטריפוגה ב-2,500 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>שטפו את העמוד ב-10 מ"ל של חיץ העמסת טרנספרין 1x וצנטריפוגה ב-2,500 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הכביסה והצנטריפוגה, בצע שטיפה מלוחה עם 10 מ"ל של מלח, וצנטריפוגה ב 2,500 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li>
	<li>חישוב הריכוז של 58Fe-Tf. הערה: בשל תוספת של עודף 58Fe בשלב 1.5.2, נניח שכל הטרנספרין הוא דיפרי. כמו 500 מ"ג של apo-Tf שימש, ~ 500 מ"ג 58Fe-Tf הופק בשלב 1.5.4.<ol><li>מדוד את הנפח שהתאושש מהצנטריפוגה לאחר שטיפת המלח בשלב 1.6.2.</li>
		<li>חלקו 500 מ"ג בנפח שהתאושש כדי לקבוע את הריכוז (במ"ג/מ"ל) של תמיסת Fe-Tf 58.</li>
	</ol></li>
	<li>לעקר את תמיסת Fe-Tf 58באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר; יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. הערה: 58תמיסת Fe-Tf שימשה בין שבוע לארבעה שבועות לאחר ההכנה.</li>
</ol>2. הגדרת הריונות עכבר מתוזמנים
<ol><li>יש להשתמש בעכברים בני 6 עד 8 שבועות. יש להניח את בעלי החיים על תזונה דלת ברזל (ברזל 4 ppm) או צ'או סטנדרטי (ברזל 185 ppm) במשך שבועיים לפני ההזדווגות ולשמור על בעלי חיים בתזונה המתאימה לאורך כל ההריון.</li>
	<li>אפשרות 01: אשר הריון לפי עלייה במשקל ב- E7.5.<ol><li>להקים כלובי רבייה מרובים. עבור כל כלוב, לשלב 2 נקבות עם זכר אחד לילה; היום שלמחרת שבו בעלי חיים מופרדים נחשב יום עוברי (E)0.5. שקלו את הנקבות ב-E7.5 כדי לקבוע אם בהריון. להזדווג שוב עם נקבות שלא עלו במשקל. הערה: ב- WT C57BL/6, עלייה במשקל של 1 גרם ב- E7.5 היא אינדיקטור טוב להריון. שיטה זו מבטיחה כי ההשתלה התרחשה במסגרת זמן מסוימת של 16 שעות, ומאפשרת טיפול סינכרוני בכל בעלי החיים שנכנסו להריון באותה תקופת הזדווגות.</li>
	</ol></li>
	<li>אפשרות 02: לאשר הריון על ידי בדיקות תקע.<ol><li>שלבו 2 נקבות עם זכר אחד ובצעו בדיקות תקע יומיות כדי לקבוע אם התרחשה התלקחות. הערה: שיטה זו עלולה לגרום להריונות מדשדשים, ונוכחות של תקע אינה מבטיחה הריון.</li>
	</ol></li>
</ol>3. מתן 58Fe-Tf לווריד לעכברות הרות E17.5
<ol><li>הכן 58Fe-Tf משלב 1.8 להזרקה.<ol><li>הכן 58תמיסת Fe-Tf ב 35 מ"ג / מ"ל במלח; להזריק 100 μL לכל עכבר.</li>
		<li>מלאו מזרק אינסולין ב-100 מיקרון מתוך תמיסת Fe-Tf 58. הערה: כל מנה מכילה 3.5 מ"ג של Fe-Tf אנושי 58Fe-Tf (5 מיקרוגרם מתוך 58Fe).</li>
	</ol></li>
	<li>הרדמת עכבר בהריון באמצעות איזופלורן.<ol><li>השתמש בווסת איזופלורן עם תא.</li>
		<li>השתמש בהגדרות הבאות: 5% איזופלורן, 2 ליטר למ"ל של O 2,2 דקות.</li>
		<li>ודא שהעכבר מורדם על ידי חיפוש חוסר תגובה לצביטת בוהן.</li>
		<li>יש למרוח חומר סיכה לעיניים על פני השטח של העין ולהניח את העכבר על כרית חימום.</li>
	</ol></li>
	<li>לאט ובזהירות להזריק את תמיסת 58Fe-Tf לתוך הסינוס הרטרו-מסלולי.</li>
	<li>אפשר לעכבר להתאושש מהרדמה; אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על משענת החזה.</li>
	<li>שש שעות לאחר ההזרקה, להרדים נקבות הרות E17.5 על ידי מנת יתר איזופלורן.<ol><li>בצע ניקור לב כדי exsanguinate העכבר כצורה של המתת חסד משנית.</li>
		<li>הצמידו את כפות הרגליים למטה עם מחטים לייצוב.</li>
	</ol></li>
	<li>לאסוף את השליה ואת כבדי העובר.<ol><li>באמצעות מלקחיים סטריליים ומספריים דיסקציה, להסיר בזהירות את הרחם מן העכבר ההרה. חתכו יחידת שליה עוברית שליה, הכוללת עובר יחיד ושליה בשק מי השפיר המוקף בחלק מהרחם.</li>
		<li>בזהירות לחתוך דרך הרחם ואת שק מי השפיר מבלי להפריע לעובר ואת השליה.</li>
		<li>מקלפים בחזרה את שק מי השפיר ומסירים את העובר והשליה.</li>
		<li>חותכים את חבל הטבור.</li>
		<li>כתם את העובר ואת השליה על ניגוב משימה נקייה כדי להסיר את עודף מי השפיר.</li>
		<li>רשום את המשקולות של השליה כולה.</li>
		<li>חותכים כל שליה לשניים בעזרת סכין גילוח, מניחים כל חצי בצינור של 2.0 מ"ל, ומקפיאים בחנקן נוזלי. הערה: מכיוון ש-58Fe אינו דורש אמצעי זהירות מיוחדים לטיפול וסילוק, ניתן להשתמש במחצית אחת של השליה למדידת 58Fe ובמחצית השנייה לכל ניתוח אחר, כולל כמות של קולטן טרנספרין (TFR1) וביטוי פרופורטין (FPN) על ידי כתם מערבי ו- qPCR.</li>
		<li>כדי לאסוף כבדי עובר, הקריבו את העובר: השתמשו בסכין גילוח כדי לערוף את העובר במהירות. הערה: ב- E17.5, יש להרדים את כל העוברים ברחם בנפרד, גם אם הם אינם משמשים במחקר.</li>
		<li>הצמידו את העובר לייצוב, והותירו את הבטן חשופה.</li>
		<li>באמצעות מספריים לנתיחה, מבצעים חתך קטן במקום בו מחובר חבל הטבור, מכניסים קצה אחד של מספריים הדיסקציה לתוך החתך, ומבצעים חתך מישורי חציוני לכיוון מישור הקורונה כ-1/4 אינץ'. לאחר מכן, בצע חיתוכי מישור רוחביים כדי לחשוף את הכבד העוברי.</li>
		<li>השתמש מלקחיים כדי להסיר את הכבד העוברי.</li>
		<li>רשום את המשקלים של כל כבדי העובר.</li>
		<li>מניחים את כל כבדי העובר בצינורות של 2 מ"ל ומקפיאים אותם בחנקן נוזלי. הערה: לחלופין, ניתן להשתמש רק בחלק מכבד העובר למדידת 58Fe אם יש צורך בניתוחים נוספים. שימוש בצינורות 2.0 מ"ל מאפשר הומוגניזציה טובה יותר של רקמות מאשר צינורות 1.5 מ"ל.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחסן את הרקמות ללא הגבלת זמן ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>4. רקמות תהליך לניתוח ברזל כמותי על ידי ICP-MS
<ol><li>מעבדים את השליה ואת כבדי העובר לכמות של ברזל nonheme.
	<ol><li>הפשרת חצאי שליה וכבד עוברי שלם, ושקילת חצאי שליה (ראה שלב 3.6.12 לרישום משקל כבד עוברי).</li>
		<li>הוסף 400 μL של תמיסת משקעי חלבון (0.53 N HCl, 5.3% TCA).</li>
		<li>הומוגניזציה של הרקמה באמצעות הומוגנייזר חשמלי.</li>
		<li>דגירה של הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.</li>
		<li>מצננים את הדגימות במים בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.</li>
		<li>פתח את הכובעים כדי לשחרר לחץ, ולאחר מכן סגור שוב את הצינורות.</li>
		<li>צנטריפוגה ב-17,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפסולת רקמות.</li>
		<li>העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור חדש המסומן.</li>
		<li>שלח דוגמאות לניתוח ICP-MS.</li>
	</ol></li>
	<li>מעבדים את השליה ואת כבדי העובר לכמות של ברזל הם. הערה: לאחר מיצוי של ברזל nonheme בשלב 1, הברזל שנותר בגלולה הוא בעיקר heme.<ol><li>רשום את המשקל של כל כדור משלב 4.1.7.</li>
		<li>לעכל את הכדורים ב-10 מ"ל של 70% HNO3 מרוכזים בתוספת 1 מ"ל של 30% H 2 O2 הערה: התייעץ עם הליבה או המרכז של ICP-MS כדי למטב את עוצמת הקול של HNO3 עבור מחקרים ספציפיים; הנפח יהיה תלוי בחלקו במשקל המדגם.</li>
		<li>מחממים את הדגימות ל-200 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
		<li>שלח את הדגימות לניתוח ICP-MS. הערה: אם אין צורך בהבחנה בין מקורות ברזל heme ו- nonheme ונמדד רק ברזל כולל, ניתן לעכל רקמה שלמה ב- HNO3 כצעד ראשון.</li>
	</ol></li>
</ol>5. ניתוח נתונים
הערה: הנתונים מ-ICP-MS סופקו כריכוזים של 56 Fe ו-58Fe ב-ng/mL או mg, ppb (טבלה 1). 56 Fe הוא איזוטופ הברזל הנפוץ ביותר בטבע, ומדידתו משקפת הצטברות ברזל בשליה/עובר לאורך כל ההריון, בעוד שמדידת 58Fe משקפת ברזל שהועבר במהלך 6 שעות לאחר ההזרקה.
<ol><li>הפחת את השפע הטבעי של 58 Fe (0.28% מסך Fe) מהערכים הנמדדים של 58Fe.</li>
	<li>חישוב סה"כ nonheme 58Fe.<ol><li>חשב את סך כל הברזל הלא-המי בכבד העובר (ng) על-ידי הכפלת ריכוז הברזל (ng/mL) המחושב בשלב 5.1 בנפח (mL) במהלך העיבוד הראשוני בשלב 4.1.2 כדי להעריך את סך הכל 58Fe.</li>
		<li>חשב את כמות הברזל בכל השליה על ידי לקיחת המשקל הכולל של השליה הנמדדת בשלב 3.6.6 וחלוקתה במשקל השליה המעובדת בשלב 4.1.1. הכפל ערך זה בסך כל הברזל nonheme (ng) המחושב בשלב 5.2.1 כדי לקבל את התוכן הכולל nonheme 58Fe של השליה.</li>
	</ol></li>
	<li>חישוב סה"כ heme 58Fe.<ol><li>יש לחשב את סך ה-heme 58Fe על ידי הכפלת ריכוז הברזל (ng/mg) המחושב בשלב 5.1 במשקל הכדור (במ"ג) הנמדד בשלב 4.2.1.</li>
		<li>לאחר מכן, חלקו את המשקל הכולל של השליה שנמדד בשלב 3.5.1 במשקל כדור השליה שנמדד בשלב 4.2.1. הכפל ערך זה בסך כל ברזל heme (ng) המחושב בשלב 5.3.1 כדי לקבל תוכן heme 58Fe הכולל של השליה.</li>
	</ol></li>
	<li>סכמו את הערכים המחושבים nonheme ו- heme 58Fe כדי לקבוע את תכולת הברזל הכוללת עבור כל רקמה.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63378/63378fig01.jpg"> איור 1: סיכום חזותי של שלבים בפרוטוקול . (A) הכנת 58Fe-transferrin. (ב) ניהול In vivo של 58Fe-transferrin. (ג) איסוף ואחסון רקמות. (D) עיבוד השליה וכבד העובר לכמות של מיני מתכות על ידי ICP-MS. קיצורים: Fe = ברזל; NTA = חומצה ניטרילוטריאצטית; Tf = טרנספרין; PPS = תמיסת משקעי חלבון; Sup = סופרנטנט; TCA = חומצה טריכלורואצטית; ICP-MS = ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63378/63378fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<ol><li>Ganz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Systemic iron homeostasis.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).</li>
<li>Aschemeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+ferroportin+defines+the+binding+site+and+an+alternative+mechanism+of+action+of+hepcidin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin.</a> Blood. 131 (8), 899-910 (2018).</li>
<li>Sangkhae, V., Nemeth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+iron+homeostatic+hormone+hepcidin%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin.</a> Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).</li>
<li>Sangkhae, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+maternal+iron+status+on+placental+and+fetal+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).</li>
<li>Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+absorption+during+normal+human+pregnancy%3A+a+study+using+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes.</a> British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).</li>
<li>Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+erythrocyte+incorporation+of+absorbed+non-haem+iron+in+pregnant+women%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women.</a> British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).</li>
<li>O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+iron+status+influences+iron+transfer+to+the+fetus+during+the+third+trimester+of+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).</li>
<li>Young, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+hepcidin+is+associated+with+placental+transfer+of+iron+derived+from+dietary+heme+and+nonheme+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources.</a> Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).</li>
<li>Delaney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+absorption+during+pregnancy+is+underestimated+when+iron+utilization+by+the+placenta+and+fetus+is+ignored%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).</li>
<li>Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+more+stable+understanding+of+pregnancy+micronutrient+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).</li>
<li>Fisher, A. L., Nemeth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+homeostasis+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Iron homeostasis during pregnancy.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).</li>
<li>van Santen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iron+regulatory+hormone+hepcidin+is+decreased+in+pregnancy%3A+a+prospective+longitudinal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).</li>
<li>Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+expression+of+intestinal+iron+transport+and+hepatic+regulatory+molecules+explain+the+enhanced+iron+absorption+associated+with+pregnancy+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat.</a> Gut. 53 (5), 655-660 (2004).</li>
<li>Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+metabolism+in+the+pregnant+rabbit%3B+iron+transport+across+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta.</a> American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).</li>
<li>Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal-fetal+exchange+of+59+Fe%3A+radiation+dosimetry+and+biokinetics+in+human+and+sheep+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies.</a> Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).</li>
<li>Contractor, S. F., Eaton, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transferrin+in+iron+transport+between+maternal+and+fetal+circulations+of+a+perfused+lobule+of+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta.</a> Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).</li>
<li>Baker, E., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transferrin+in+placental+iron+transfer+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Quartly+Jounrnal+of+Experimental+Physiolology+and+Cognate+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit.</a> Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).</li>
<li>Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mouse+models+of+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Knockout mouse models of iron homeostasis.</a> Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).</li>
<li>Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemochorial+placentation%3A+development%2C+function%2C+and+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Hemochorial placentation: development, function, and adaptations.</a> Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).</li>
<li>Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+placental+nutrient+transport--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Regulation of placental nutrient transport--a review.</a> Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).</li>
<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+of+glucose+transporter+GLUT1+in+the+rat+placental+barrier%3A+possible+role+of+GLUT1+and+the+gap+junction+in+the+transport+of+glucose+across+the+placental+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier.</a> Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).</li>
<li>Shin, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+of+GLUT1+and+connexin+26+in+the+rat+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta.</a> Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).</li>
<li>Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localisation+of+proteins+of+iron+metabolism+in+the+human+placenta+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver.</a> British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).</li>
<li>Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+apotransferrin+to+K562+cells%3A+explanation+of+the+transferrin+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).</li>
<li>Tsunoo, H., Sussman, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transferrin+binding+and+specificity+of+the+placental+transferrin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).</li>
<li>Sangkhae, V., Nemeth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+iron+transport%3A+The+mechanism+and+regulatory+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits.</a> Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).</li>
<li>McCarthy, R. C., Kosman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+analysis+of+iron+accumulation+by+endothelial+cells+of+the+BBB%5BTitle%5D)+AND+%22Biometals%22%5BJournal%5D)">Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB.</a> Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).</li>
<li>Donovan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iron+exporter+ferroportin%2FSlc40a1+is+essential+for+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis.</a> Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).</li>
<li>Stefanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+hepcidin+and+its+agonist+mediate+resistance+to+selected+infections+by+clearing+non-transferrin-bound+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron.</a> Blood. 130 (3), 245-257 (2017).</li>
<li>Ramos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+distinct+pathways+of+hepcidin+regulation+by+acute+and+chronic+iron+loading+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice.</a> Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).</li>
<li>Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+function+in+mice+during+normal+pregnancy+and+in+the+absence+of+endothelial+NO+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase.</a> Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).</li>
<li>Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+transfer+and+body+distribution+of+nickel+chloride+in+pregnant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).</li>
<li>Gunshin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slc11a2+is+required+for+intestinal+iron+absorption+and+erythropoiesis+but+dispensable+in+placenta+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).</li>
</ol>

EN היא מייסדת-שותפה מדעית של Intrinsic LifeSciences ו-Silarus Pharma ויועצת ל-Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics ו-Disc Medicine. VS מצהיר שאין התנגשויות.

ברזל חשוב לתהליכים ביולוגיים רבים, ותנועתו והפצתו בגוף הן דינמיות ומווסתות מאוד. איזוטופים יציבים מברזל מספקים חלופה עקבית ונוחה לאיזוטופים רדיואקטיביים להערכת הדינמיקה של הומאוסטזיס ברזל. שלב קריטי בפרוטוקול הוא מעקב אחר כל המשקלים והנפחים של הרקמות. ברזל הוא יסוד ולכן לא ניתן לסנתז אותו או לפרק אותו. לכן, אם כל המשקולות והנפחים נרשמים בקפידה, ניתן להסביר את כל הברזל בתוך המערכת על ידי חישוב. כפי שתואר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להבחין בין מקורות ברזל heme ו nonheme. עם זאת, אם הבחנה זו בין צורות ברזל אינה הכרחית ורק סך ...

ברזל חיוני לתהליכים מטבוליים שונים, כולל גדילה והתפתחות, ייצור אנרגיה והובלת חמצן1. תחזוקה של הומאוסטזיס ברזל הוא תהליך דינמי ומתואם. ברזל נספג מהמזון בתריסריון ומועבר ברחבי הגוף במחזור הדם הקשור להעברת חלבון הובלת הברזל (Tf). הוא מנוצל על ידי כל תא לתהליכים אנזימטיים, משולב בהמוגלובין באריתרוציטים מתהווים, וממוחזר מאריתרוציטים מיושנים על ידי מקרופאגים. ברזל מאוחסן בכבד כאשר עודף ואבד מהגוף באמצעות דימום או sloughing התא. כמות הברזל במחזור היא תוצאה של האיזון בין הצריכה לבין אספקת הברזל, האחרון להיות מוסדר היטב על ידי הורמון הכבד hepcidin (HAMP), הרגולטור המרכזי של ברזל הומאוסטזיס1. הפצידין מתפקד כדי להגביל את הזמינות הביולוגית של ברזל בדם על ידי חסימה או גרימת יוביקוויטין והשפלת יצואנית הברזל פרופורטין (FPN)2. הפחתה ב-FPN התפקודי מובילה לירידה בספיגת ברזל בתזונה, לפירוק ברזל בכבד ולירידה במיחזור ברזל ממקרופאגים1.
הפצידין מווסת על ידי מצב ברזל, דלקת, דחף אריתרופויטי והריון (נבדק ב -3). בהתחשב בכך שהומאוסטזיס ברזל הוא דינמי מאוד, חשוב להבין ולמדוד את סך מאגר הברזל ואת התפלגות הברזל ותחלופתו. מחקרים בבעלי חיים הסתמכו באופן מסורתי על איזוטופים של ברזל רדיואקטיבי, גישה רגישה מאוד אך מעיקה למדידת הדינמיקה של ברזל. עם זאת, במחקרים עדכניים יותר, כולל המחקר המוצג כאן4, איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי ויציב (58Fe) משמשים למדידת הובלת ברזל במהלך ההריון 5,6,7,8,9. איזוטופים יציבים הם כלים חשובים לחקר חילוף החומרים של חומרים מזינים (נבדקו ב-10). השימוש באיזוטופים יציבים של ברזל במחקרים בבני אדם הראה כי 1) ספיגת הברזל עולה לקראת סוף ההיריון5,6, ii) העברת ברזל תזונתי לעובר תלויה במצב הברזל האימהי7, 3) ברזל heme שנבלע אימהי משולב בקלות רבה יותר על ידי העובר מאשר ברזל nonheme 8, ו- 4) העברת ברזל לעובר מתואמת שלילית עם רמות hepcidin אימהי 8, 9. ניסויים אלה מדדו איזוטופים של ברזל בסרה או שילובם ב-RBCs; עם זאת, מדידה של ברזל המשולב ב-RBCs בלבד עלולה לזלזל בספיגת ברזלאמיתית 9. במחקר הנוכחי, הן heme והן ברזל nonheme נמדדים ברקמות.
במהלך ההריון, ברזל נדרש כדי לתמוך בהרחבת נפח תאי הדם האדומים האימהיים ולהעברה על פני השליה כדי לתמוך בגדילה ובהתפתחות של העובר11. הקדשת ברזל עוברית תלויה לחלוטין בהובלת ברזל על פני השליה. במהלך הריון12 אנושי ומכרסם 4,13, רמות ההפצידין יורדות באופן דרמטי, מה שמגדיל את זמינות ברזל הפלזמה להעברה לעובר.
היסודות של הובלת ברזל שליה אופיינו בתחילה בשנות החמישים וה -70 באמצעות עקבות רדיואקטיביים (59Fe ו 55Fe). מחקרים אלה קבעו כי שינוע הברזל על פני השליה הואחד-כיווני 14,15 וכי טרנספרין דיפרי הוא מקור עיקרי לברזל עבור השליה והעובר16,17. ההבנה הנוכחית של הובלת ברזל שליה שלמה יותר, אם כי כמה מובילי ברזל מרכזיים ומנגנוני ויסות עדיין לא ידועים. מודלים של עכברים היו חיוניים להבנת ויסות ברזל ותעבורה18 מכיוון שהמובילים והמנגנונים המרכזיים דומים להפליא. הן השליה האנושית והן השליה העכברית הן המוכוריאליות, כלומר, הדם האימהי נמצא במגע ישיר עם כוריון העובר19. עם זאת, ישנם כמה הבדלים מבניים בולטים.
ה- syncytiotrophoblast היא שכבת תאי השליה המפרידה בין מחזור הדם האימהי והעוברי ומעבירה באופן פעיל ברזל וחומרים מזינים אחרים20. בבני אדם, הסינקטיוטרופובלסט הוא שכבה אחת של תאים מתמזגים. לעומת זאת, שליית העכבר מורכבת משתי שכבות סינכטיוטרופובלסט21, Syn-I ו- Syn-II. עם זאת, צמתי מרווחים בממשק של Syn-I ו- Syn-II מאפשרים דיפוזיה של חומרים מזינים בין שכבות22,23. לפיכך, שכבות אלה מתפקדות כשכבה סינסיטיאלית אחת הדומה לסינכטיוטרופובלסט האנושי. קווי דמיון והבדלים נוספים בין שליה אנושית לעכבר נבדקים על ידי Rossant ו- Cross21. הובלת ברזל שליה מופעלת על ידי קשירת ברזל-Tf מדם אימהי לקולטן טרנספרין (TfR1) הממוקם בצד האפיקלי של הסינכטיוטרופובלסט24. אינטראקציה זו גורמת להפנמה של ברזל-Tf/TfR1 באמצעות אנדוציטוזה בתיווך קלתרין25. לאחר מכן הברזל משתחרר מ-Tf באנדוזום26 החומצי, מצטמצם לברזל ברזלי על ידי פרירדוקטאז שלא נקבע, ומיוצא מהאנדוזום לציטופלסמה על ידי טרנספורטר שטרם נקבע. כיצד ברזל מלווה בתוך syncytiotrophoblast גם נשאר לתאר. ברזל מועבר בסופו של דבר לצד העוברי על ידי יצואן הברזל, FPN, הממוקם על פני השטח הבסיסיים או העובריים של הסינסיטיוטרופובלסט (נבדק ב-27).
כדי להבין כיצד ויסות פיזיולוגי ופתולוגי של TfR1, FPN והפצידין משפיע על הובלת ברזל שליה, נעשה שימוש באיזוטופים של ברזל יציב כדי לבצע הובלת ברזל כמותית ממחזור הדם האימהי אל השליה והעובר in vivo4. מאמר זה מציג את השיטות להכנה ולמתן איזוטופי של ברזל-טרנספרין לעכברות הרות, עיבוד רקמות עבור ICP-MS וחישוב ריכוזי הברזל ברקמות. ניתן להתאים את השימוש באיזוטופים יציבים של ברזל in vivo כדי לחקור ויסות ופיזור ברזל במודלים שונים של בעלי חיים כדי לחקור ויסות ברזל פיזיולוגי ופתולוגי.

<table><tbody><tr><td>58Fe-ברזל מתכת</td><td>Trace Sciences International</td><td>Fe-58</td><td></td></tr><tr><td>Amicon מסנן צנטריפוגלי אולטרה-15, צינורות צנטריפוגה 30 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>, 15 מ"ל</td> צינורות צנטריפוגה <td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>, 50 מ"ל</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה, Sorvall Legend Micro 17 מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>75002432</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה, Sorvall Legend RT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגבים עדינים למשימות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>דיאטה: חסר ברזל (4 חל"מ ברזל)</td><td>Envigo Teklad</td><td>TD.80396</td><td></td></tr><tr><td>דיאטה: צ'או סטנדרטי (ברזל 185 חל"מ)</td><td>PicoLab</td><td>5053</td><td></td></tr><tr><td>חיתוך מספריים עם קצה חיתוך 30 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25870-002</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים באורך 4-1/2 אינץ'</td><td>McKesson</td><td>157-469</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר, Bio-Gen PRO200</td><td>PROScientific</td><td>01-01200</td><td></td></tr><tr><td>אפו-טרנספרין אנושי (apo-Tf)</td><td>Celliance</td><td>4452-01</td><td>כבר לא זמין, חלופה: Millipore 616419</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HClפישר</td> <td>סיינטיפיק</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן (H<תת>2O2), תמיסה של 35 wt.% במים</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-88216-36</td><td></td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין, BD Lo-Dose U-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizor</td><td>Summit פתרונות הרדמה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בלוק חום מתכת</td> צינור צנטריפוגה <td>מיקרו פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עם מכסה בורג שטוח</td><td>VWR</td><td>16466-064</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל שמירה נמוכה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל שמירה נמוכה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>יחידת מסנן מזרק Millex-GP, 0.22 ומיקרו; m, polyethersulfone, 33 מ"מ,</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ניטרילוטריאצטית (NTA)</td> <td>Sigma</td><td>72560-100G</td><td></td></tr><tr><td>מחט 25 גרם x 5/8 אינץ' שימוש כללי היפודרמי</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td></td></tr><tr><td>רצועות pH, פלסטיק pH5.0-9.0</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-519</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח 0.22 מ"מ</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>משקל (גרם)</td><td>מטלר טולדו</td><td>PB1502-S</td><td></td></tr><tr><td>סולם (מ"ג)</td><td>Mettler Toledo</td><td>Balance XS204</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>מזרק סטרילי, קצה החלקה (1 מ"ל)</td><td>Fisher Scientific</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריכלורואצטית (TCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A322-500</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageLab</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הובלת ברזל כמותית על פני שליבת העכבר in vivo באמצעות איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי

Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes

ברזל חיוני לבריאות האם והעובר במהלך ההריון, כאשר כ-1 גרם ברזל דרושים בבני אדם כדי לקיים הריון בריא. הקדשת ברזל עוברית תלויה לחלוטין בהעברת ברזל על פני השליה, והפרעות בהעברה זו עלולות להוביל לתוצאות הריון שליליות. בעכברים, מדידת שטפי הברזל על פני השליה הסתמכה באופן מסורתי על איזוטופים של ברזל רדיואקטיבי, גישה רגישה מאוד אך מעיקה. איזוטופים יציבים מברזל (57 Fe ו-58Fe) מציעים חלופה לא-רדיואקטיבית לשימוש במחקרי הריון אנושי.
בתנאים פיזיולוגיים, ברזל הקשור לטרנספרין הוא הצורה השלטת של ברזל שנלקחה על ידי השליה. לפיכך, 58Fe-transferrin הוכן והוזרק לווריד בסכרים בהריון כדי להעריך ישירות את הובלת ברזל השליה ולעקוף את ספיגת הברזל במעיים האימהיים כמשתנה מבלבל. ברזל איזוטופי היה כמותי ברקמות עובריות של השליה והעכברים על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-MS). ניתן להשתמש בשיטות אלה גם במערכות אחרות של מודלים של בעלי חיים של פיזיולוגיה או מחלות כדי לכמת את דינמיקת הברזל in vivo .

מחקר מוקדם יותר שהשתמש באיזוטופים יציבים של ברזל למדידת הובלת ברזל הראה כי מחסור אימהי בברזל הביא לירידה בוויסות של יצואנית ברזל השליה, FPN4. FPN היא יצואנית הברזל היחידה הידועה ליונקים, והיעדר FPN במהלך הפיתוח גורם למוות עוברי לפני E9.529. כדי לקבוע אם הירידה שנצפתה בביטוי FPN תורגמה פונקציונלית לירידה בהובלת ברזל השליה, 58Fe-Tf הוזרק תוך ורידי לסכרים בהריון, וברזל בשליה ובעובר כומת בנוכחות מחסור בברזל אימהי.
כדי להבין כיצד הובלת ברזל...

מאמר זה מדגים כיצד להכין ולנהל ברזל איזוטופי לא-רדיואקטיבי הקשור לטרנספרין למחקרים על הובלת ברזל בהריון עכבר. כמו כן מתוארת הגישה לכימות ברזל איזוטופי בתאי fetoplacental.

הובלת ברזל כמותית על פני שליבת העכבר In Vivo באמצעות איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי

Iron is essential for maternal and fetal health during pregnancy, with approximately 1 g of iron needed in humans to sustain a healthy pregnancy. Fetal ...

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא מאפשר לחוקרים לעקוב אחר התפלגות הברזל in vivo ולכמותה, ללא צורך ברדיואקטיביות. מאחר שניתן לזהות מספר איזוטופים יציבים של ברזל בו-זמנית באותה דגימה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להבין את הספיגה, הוויסות וההפצה של ברזל ממקורות שונים. כדי להתחיל, להוסיף 12 חומצה הידרוכלורית רגילה ברזל-58 בבקבוקון זכוכית שסופק על ידי הספק, ולהחליף את המכסה באופן רופף.כדי להמיס את הברזל, לחמם את התמיסה ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. אם עדיין לא מומס, השאירו את התמיסה למשך הלילה בטמפרטורת החדר במכסה האדים כדי להתמוסס. לאחר מכן, כדי ליצור את תמיסת הברזל הכלוריד, יש לחמצן את שאריות הכלוריד הברזלי על ידי חימום התמיסה ל-60 מעלות צלזיוס עם המכסה כדי להקל על החמצון.הוסף מיקרוליטר אחד של 35% מי חמצן לכל 50 מיקרוליטר של התמיסה כדי להקל עוד יותר על החמצון. השאירו את תמיסת הכלוריד הברזלית במכסה המנוע בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס כשהמכסה כבוי כדי לאדות את הדגימה. לאחר מכן לבנות מחדש את כלוריד ברזל ל 100 מילימולים עם מים אולטרה-טהורים.חשב את כמות המים הנדרשת בהתבסס על משקל המתכת הראשוני. לאחר מכן, להכין מיליליטר אחד של nitrilotriacetate ferric על ידי דגירה של תמיסת ברזל כלוריד מוכן עם nitrilotriacetate ביחס טוחן אחד עד חמישה בנוכחות 20 מילימולר נתרן ביקרבונט במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן ממיסים 500 מיליגרם של apotransferrin בארבעה מיליליטר של מאגר העברה וטעינה, ומוסיפים ארבעה מיליליטר של תמיסת apotransferrin זו לתמיסת nitrilotriacetate ferric מוכן בצינור 15 מיליליטר.כדי לאפשר העמסה מקסימלית של ברזל ניטרילוטריאצטט על אפוטרנספרין, בדוק שהתמיסה נמצאת ב- pH 7.5 והתאם את ה- pH במידת הצורך עם סודיום ביקרבונט, או חומצה הידרוכלורית. לדגור על התערובת במשך שעתיים וחצי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את עודף הניטרילוטריצטט הפריקי הלא מאוגד ושחרר ניטרילוטריאצטט על ידי העברת תמיסת הברזל-58 טרנספרין לעמודת חיתוך משקל מולקולרית וצנטריפוגה של הטור.לאחר צנטריפוגה, לשטוף את הטור פעמיים על ידי הוספת 10 מיליליטר של חיץ העמסת transferrin וצנטריפוגה את העמודה. ואז לשטוף את הטור עם 10 מיליליטר של מלוחים צנטריפוגה שוב. לבסוף, יש לעקר את תמיסת הברזל-58 טרנספרין באמצעות מסנן מזרק בגודל 0.22 מיקרון, ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה לשימוש.הכינו תמיסת טרנספרין של 35 מיליגרם למיליליטר ברזל-58 במי מלח. לאחר מכן הניחו עכבר בהריון מורדם על כרית חימום, והזריקו לאט ובזהירות את תמיסת הטרנספרין ברזל-58 לתוך הסינוס הרטרו-אורביטלי. שש שעות לאחר ההזרקה, מרדימים את העכבר, ומסירים בזהירות את הרחם באמצעות מלקחיים סטריליים ומספריים לנתיחה.כורתים יחידת שליה עוברית המורכבת מעובר יחיד ושליה בשק מי השפיר מוקף בחלק מהרחם. לאחר מכן, לחתוך בזהירות דרך הרחם ואת שק מי השפיר מבלי להפריע לעובר ולשליה. לאחר מכן לקלף בחזרה את שק מי השפיר ולהסיר את העובר ואת השליה.לאחר חיתוך חבל הטבור, כתם את העובר והשליה על ניגוב משימה נקי כדי להסיר את עודף מי השפיר, ולרשום את המשקל של השליה כולה. חותכים כל שליה לשניים בעזרת סכין גילוח. מניחים כל חצי בצינור של שני מיליליטר, ומקפיאים בחנקן נוזלי.כדי לאסוף את כבדי העובר, הקריבו את העובר, והצמידו את העובר לייצוב והשאירו את הבטן חשופה. באמצעות מספריים דיסקציה לעשות חתך קטן שבו חבל הטבור היה מחובר. מכניסים קצה אחד של מספריים הדיסקציה לתוך החתך ומבצעים חיתוך מישור חציוני של 1/4 אינץ' לכיוון המישור הקורונלי.לאחר מכן בצע חתכי מישור רוחבי כדי לחשוף את הכבד העוברי. באמצעות מלקחיים, להסיר את הכבד העוברי, ולרשום את המשקל של כל כבד העובר. מניחים את כל כבד העובר בצינור של שני מיליליטר ומקפיאים אותו בחנקן נוזלי.לאחסן את הרקמות ללא הגבלת זמן במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לכמת את הברזל שאינו הם בשליה ובכבדי העובר, הפשירו את חצאי השליה ואת הכבדים העובריים השלמים. ואז לשקול את חצאי השליה.הוסיפו 400 מיקרוליטרים של תמיסת משקעי חלבון לדגימות הרקמה והומוגניים של הרקמה באמצעות הומוגנייזר חשמלי. לדגור את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. ואז לקרר אותם בטמפרטורת החדר מים במשך שתי דקות.פתח את המכסים כדי לשחרר לחץ. ואז לסגור את הצינורות שוב. לאחר צנטריפוגה של הדגימה כדי לגלגל את פסולת הרקמות, העבר בזהירות את הסופר-נטנט לצינור חדש המסומן לניתוח ICP-MS.ליד לכמת את ברזל heme, לרשום את המשקל של גלולה שהושגה לאחר צנטריפוגה. לאחר מכן לעכל את הכדורים ב 10 מיליליטר של חומצה חנקתית מרוכזת 70%, בתוספת מיליליטר אחד של 30% מי חמצן. מחממים את הדגימות ל-200 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני שליחתן לניתוח ICP-MS.מדידת ICP-MS אפשרה זיהוי של שני איזוטופים שונים של ברזל. איזוטופ הברזל הנפוץ ביותר, ברזל-56, משקף שינויים כרוניים ביונים ברקמות. איזוטופ אחר, ברזל-58, משקף שינויים חריפים בהתפלגות הברזל המוזרק.מדידת ברזל-56 אישרה כי כבדים של עוברים מהריונות עם מחסור בברזל היו בעלי מאגרי ברזל נמוכים בהשוואה לאלו שהיו בהריונות גדושים בברזל. מדידת ברזל-58 אישרה כי בהריונות עם מחסור בברזל, פחות ברזל הועבר לכבד העובר במשך שש שעות מאשר בהריונות גדושים בברזל. בעת ביצוע ההליך, זכור לרשום את משקל הרקמות.משקלים אלה נחוצים לחישוב ריכוזי הברזל. מכיוון שברזל-58 אינו דורש אמצעי זהירות וסילוק מיוחדים, ניתן להשתמש ברקמות לא מעובדות לניתוחים אחרים, כולל, אך לא רק, כתם מערבי, או qPCR.

quantitating-iron-transport-across-mouse-placenta-vivo-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פתחנו גישה ניתוחית חדשנית לממשל intratracheal של סוכני יו לעובר העכבר. מסלול המשלוח הוא יעיל יותר במיקוד ריאות העכבר העובריות מהזרקה תוך מי השפירה בשימוש נפוץ. הליך זה עד כה לא תואר במודל של עכברים.

גישה ניתוחית חדשנית למנהל Intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה מבוססת קולורימטריה לקביעת תכולת ברזל שאינה הם ברקמת כבד עכבר. Bathophenanthroline sulfonate משמש כמצע כרומוגני בנוכחות סוכן חיזור, אשר ממיר ברזל ברזל ברזל ברזל chelatable.

בדיקת Colorimetric מבוססת Bathophenanthroline Sulfonate: שיטה פשוטה ומהירה לכימות ברזל שאינו הם ברקמת כבד עכבר

קביעת תעריף הובלת xenobiotics ו ננו מעבר לשליה באמצעות<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; דגם זלוף שליה אנושי

אנו מציגים שיטה מפורטת ללמוד פיזיולוגיה שליה אנושית ב vivo בטווח. השיטה משלבת דגימת דם מן הכלים הנכנסים והיוצאים על צדדי האם והעובר של השליה עם מדידות אולטראסאונד של זרימת הדם בנפח ודגימת רקמת השליה.

4-כלי דגימה גישה ללימודים אינטגרטיביים של הפיזיולוגיה השליה האדם<em&gt; בויבו</em

נתאר מערכת אשר מנצל שלוש שיטות כדי להעריך את הבטיחות והיעילות של תרופות ממוקדות השליה: ויוו הדמיה כדי לפקח nanoparticle הצטברות, אולטרסאונד בתדירות גבוהה כדי לעקוב אחר ההתפתחות העוברית של היפרדות , ו- HPLC לכמת משלוח סמים לרקמות.

הערכה מקיפה של היעילות והבטיחות של משלוח סמים, ממוקדות השליה באמצעות שלוש שיטות משלימות

הנה הציג פרוטוקול של לשעבר vivo אימהי-העוברי וסקולזיה העובר כדי לאפשר את הניהול של מאמר מבחן לתוך ואסילטורה אימהית וכלה להעריך העברה שלמה של חלקיקים xenoביוטיים או סוכני תרופתי בנוסף שינויים ב פיזיולוגיה של...

לשעבר Vivo Perfusion של השליה מכרסם

כאן, פרוטוקול למדידת התוכן ברזל שאינו heme ברקמות בעלי חיים מסופק, באמצעות בדיקה צבעונית פשוטה ומבוססת היטב שניתן ליישם בקלות ברוב המעבדות.

מדידה של תוכן ברזל רקמות שאינן Heme באמצעות בדיקת צבע מבוססת Bathophenanthroline

הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 לזמינות ביולוגית של ברזל (Fe) מייצגת גישה חסכונית ורב-תכליתית להערכת הזמינות הביולוגית של Fe ממזונות, מוצרי מזון, תוספי מזון, ארוחות ואפילו משטרי תזונה. הוא מאומת ביסודיות למחקרים בבני אדם, ומייצג את מצב האמנות למחקרים על זמינות ביולוגית של Fe.

הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 למדידת זמינות ביולוגית של ברזל במזון

אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי לכימות זמני הרפיה T2* של גידולים באמצעות תוכנה חיצונית. תמונות הד הדרגתיות מרובות הד נרכשות ומוזנות לתוך התוכנה כדי ליצור מפות גידול T2* ולמדוד את זמני ההרפיה של הגידול T2*.

מדידת הגידול T2* זמני הרפיה לאחר מתן ננו-חלקיקים של תחמוצת ברזל

אנו מתארים בדיקה פלואורסצנטית שיכולה לאשר במהירות ובזול את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל. הבדיקה מודדת את יכולתן של תרכובות להתחרות בפעילות קשירת הברזל של הגשושית הפלואורסצנטית החלשה Calcein, וכתוצאה מכך עלייה ניתנת לכימות בפלואורסצנטיות כאשר מתרחשת כלציה.

שיטה פלואורסצנטית ניתנת לכימות וזולה ללא תאים כדי לאשר את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל 

פרוטוקול זה מציג שיטות להערכת התפלגות וכמות שקיעת הברזל ברקמות, במיוחד במוח. הפרוטוקול מפרט את הנהלים להכנת דגימה, צביעת Perls/DAB, לכידת תמונה וניתוח נתונים.

הערכת שקיעת ברזל במוחם של עכברי 5xFAD על ידי צביעת Perls/DAB

למד כיצד לכמת הובלת ברזל איזוטופית ללא רדיואקטיביות בעכברים בהריון באמצעות ICP-MS. שיטה זו מאפשרת מעקב בטוח אחר הפצת ברזל ברקמות עובריות ומושליות ללא סיכוני רדיואקטיביות.

הובלת ברזל כמותית על פני שליבת העכבר In Vivo באמצעות איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי

גלה סרטונים נוספים