הובלת ברזל כמותית על פני שליבת העכבר In Vivo באמצעות איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא מאפשר לחוקרים לעקוב אחר התפלגות הברזל in vivo ולכמותה, ללא צורך ברדיואקטיביות. מאחר שניתן לזהות מספר איזוטופים יציבים של ברזל בו-זמנית באותה דגימה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להבין את הספיגה, הוויסות וההפצה של ברזל ממקורות שונים. כדי להתחיל, להוסיף 12 חומצה הידרוכלורית רגילה ברזל-58 בבקבוקון זכוכית שסופק על ידי הספק, ולהחליף את המכסה באופן רופף.

כדי להמיס את הברזל, לחמם את התמיסה ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. אם עדיין לא מומס, השאירו את התמיסה למשך הלילה בטמפרטורת החדר במכסה האדים כדי להתמוסס. לאחר מכן, כדי ליצור את תמיסת הברזל הכלוריד, יש לחמצן את שאריות הכלוריד הברזלי על ידי חימום התמיסה ל-60 מעלות צלזיוס עם המכסה כדי להקל על החמצון.

הוסף מיקרוליטר אחד של 35% מי חמצן לכל 50 מיקרוליטר של התמיסה כדי להקל עוד יותר על החמצון. השאירו את תמיסת הכלוריד הברזלית במכסה המנוע בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס כשהמכסה כבוי כדי לאדות את הדגימה. לאחר מכן לבנות מחדש את כלוריד ברזל ל 100 מילימולים עם מים אולטרה-טהורים.

חשב את כמות המים הנדרשת בהתבסס על משקל המתכת הראשוני. לאחר מכן, להכין מיליליטר אחד של nitrilotriacetate ferric על ידי דגירה של תמיסת ברזל כלוריד מוכן עם nitrilotriacetate ביחס טוחן אחד עד חמישה בנוכחות 20 מילימולר נתרן ביקרבונט במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן ממיסים 500 מיליגרם של apotransferrin בארבעה מיליליטר של מאגר העברה וטעינה, ומוסיפים ארבעה מיליליטר של תמיסת apotransferrin זו לתמיסת nitrilotriacetate ferric מוכן בצינור 15 מיליליטר.

כדי לאפשר העמסה מקסימלית של ברזל ניטרילוטריאצטט על אפוטרנספרין, בדוק שהתמיסה נמצאת ב- pH 7.5 והתאם את ה- pH במידת הצורך עם סודיום ביקרבונט, או חומצה הידרוכלורית. לדגור על התערובת במשך שעתיים וחצי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את עודף הניטרילוטריצטט הפריקי הלא מאוגד ושחרר ניטרילוטריאצטט על ידי העברת תמיסת הברזל-58 טרנספרין לעמודת חיתוך משקל מולקולרית וצנטריפוגה של הטור.

לאחר צנטריפוגה, לשטוף את הטור פעמיים על ידי הוספת 10 מיליליטר של חיץ העמסת transferrin וצנטריפוגה את העמודה. ואז לשטוף את הטור עם 10 מיליליטר של מלוחים צנטריפוגה שוב. לבסוף, יש לעקר את תמיסת הברזל-58 טרנספרין באמצעות מסנן מזרק בגודל 0.22 מיקרון, ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה לשימוש.

הכינו תמיסת טרנספרין של 35 מיליגרם למיליליטר ברזל-58 במי מלח. לאחר מכן הניחו עכבר בהריון מורדם על כרית חימום, והזריקו לאט ובזהירות את תמיסת הטרנספרין ברזל-58 לתוך הסינוס הרטרו-אורביטלי. שש שעות לאחר ההזרקה, מרדימים את העכבר, ומסירים בזהירות את הרחם באמצעות מלקחיים סטריליים ומספריים לנתיחה.

כורתים יחידת שליה עוברית המורכבת מעובר יחיד ושליה בשק מי השפיר מוקף בחלק מהרחם. לאחר מכן, לחתוך בזהירות דרך הרחם ואת שק מי השפיר מבלי להפריע לעובר ולשליה. לאחר מכן לקלף בחזרה את שק מי השפיר ולהסיר את העובר ואת השליה.

לאחר חיתוך חבל הטבור, כתם את העובר והשליה על ניגוב משימה נקי כדי להסיר את עודף מי השפיר, ולרשום את המשקל של השליה כולה. חותכים כל שליה לשניים בעזרת סכין גילוח. מניחים כל חצי בצינור של שני מיליליטר, ומקפיאים בחנקן נוזלי.

כדי לאסוף את כבדי העובר, הקריבו את העובר, והצמידו את העובר לייצוב והשאירו את הבטן חשופה. באמצעות מספריים דיסקציה לעשות חתך קטן שבו חבל הטבור היה מחובר. מכניסים קצה אחד של מספריים הדיסקציה לתוך החתך ומבצעים חיתוך מישור חציוני של 1/4 אינץ' לכיוון המישור הקורונלי.

לאחר מכן בצע חתכי מישור רוחבי כדי לחשוף את הכבד העוברי. באמצעות מלקחיים, להסיר את הכבד העוברי, ולרשום את המשקל של כל כבד העובר. מניחים את כל כבד העובר בצינור של שני מיליליטר ומקפיאים אותו בחנקן נוזלי.

לאחסן את הרקמות ללא הגבלת זמן במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לכמת את הברזל שאינו הם בשליה ובכבדי העובר, הפשירו את חצאי השליה ואת הכבדים העובריים השלמים. ואז לשקול את חצאי השליה.

הוסיפו 400 מיקרוליטרים של תמיסת משקעי חלבון לדגימות הרקמה והומוגניים של הרקמה באמצעות הומוגנייזר חשמלי. לדגור את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. ואז לקרר אותם בטמפרטורת החדר מים במשך שתי דקות.

פתח את המכסים כדי לשחרר לחץ. ואז לסגור את הצינורות שוב. לאחר צנטריפוגה של הדגימה כדי לגלגל את פסולת הרקמות, העבר בזהירות את הסופר-נטנט לצינור חדש המסומן לניתוח ICP-MS.

ליד לכמת את ברזל heme, לרשום את המשקל של גלולה שהושגה לאחר צנטריפוגה. לאחר מכן לעכל את הכדורים ב 10 מיליליטר של חומצה חנקתית מרוכזת 70%, בתוספת מיליליטר אחד של 30% מי חמצן. מחממים את הדגימות ל-200 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני שליחתן לניתוח ICP-MS.

מדידת ICP-MS אפשרה זיהוי של שני איזוטופים שונים של ברזל. איזוטופ הברזל הנפוץ ביותר, ברזל-56, משקף שינויים כרוניים ביונים ברקמות. איזוטופ אחר, ברזל-58, משקף שינויים חריפים בהתפלגות הברזל המוזרק.

מדידת ברזל-56 אישרה כי כבדים של עוברים מהריונות עם מחסור בברזל היו בעלי מאגרי ברזל נמוכים בהשוואה לאלו שהיו בהריונות גדושים בברזל. מדידת ברזל-58 אישרה כי בהריונות עם מחסור בברזל, פחות ברזל הועבר לכבד העובר במשך שש שעות מאשר בהריונות גדושים בברזל. בעת ביצוע ההליך, זכור לרשום את משקל הרקמות.

משקלים אלה נחוצים לחישוב ריכוזי הברזל. מכיוון שברזל-58 אינו דורש אמצעי זהירות וסילוק מיוחדים, ניתן להשתמש ברקמות לא מעובדות לניתוחים אחרים, כולל, אך לא רק, כתם מערבי, או qPCR.