מערכת מיקרופיזיולוגית של הכבד האנושי להערכת רעילות כבד הנגרמת על ידי תרופות במבחנה

הפרוטוקול מתאר כיצד להעריך פגיעה בכבד הנגרמת על ידי תרופות במבחנה באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית שיכולה לשמור על רקמות מיקרו של כבד מתפקדות מאוד ופעילות מטבולית למשך עד ארבעה שבועות. גישה זו היא מודל של תרביות תאים ספציפיות לבני אדם כדי לזהות במדויק חבות פגיעה בכבד הנגרמת על-ידי תרופות עבור תרכובות חדשות, שהיא מנבאת יותר מאשר תרביות דו-ממדיות פשוטות יותר או אפילו תרביות תלת-ממד מורכבות יותר. טכניקה זו יכולה לשמש כחלק מסוללה של בדיקות בטיחות פרה-קליניות כדי לקבוע אם תרכובת בטוחה להתחיל בפיתוח קליני.

ניתן לבדוק מגוון רחב של אופנים. התחל להקים את המערכת המיקרופיזיולוגית של הכבד על ידי חיבור הבקר לבית תחנת העגינה באינקובטור של תרביות תאים. הקפידו להוסיף חומר ייבוש טרי לצנצנת הייבוש הממוקמת בגב הבקר.

לאחר הפעלת הבקר על ידי לחיצה על מתג נדנדת הסירה, המתן חמש דקות עד שהמערכת תתייצב ותגיע ללחץ. מוציאים כל צלחת מהאריזה. לאחר מכן, הגדילו כל באר על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של מדיום DMEM מתקדם שחומם מראש לצד המאגר.

הנח את הנהג על תחנת העגינה באינקובטור. בסיום, בחר את תוכנית הפריים במסך הבקר עד שהנוזל יגיע דרך תומכי המסנן. כדי לכסות את ערוץ פני השטח, למלא את כל הבארות עם 1.1 מיליליטר של זריעת מדיום DMEM מתקדם.

לאחר הצבת הנהגים עם צלחות בחממה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, לחבר את תחנת העגינה, ולהפעיל את תוכנית הדגירה. הפשרת בקבוקונים של PHHs ו- HJCs על ידי החזקת הבקבוקונים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד שנותר רק רסיס קטן של קרח. לאחר ההפשרה, פיפטה עדינה של שני בקבוקונים לכל היותר של PHHs ישירות לתוך צינור של מדיום התאוששות הפטוציטים שחומם מראש בהקפאה, מדיה CHRM.

לאחר מכן השתמש מיליליטר אחד של CHRM כדי לשטוף את התאים הנותרים מן cryotube. מזרימים את ה-HKCs בעדינות מהקריו-טיוב ל-10 מיליליטר של זרע קר כקרח וזורעים מדיום DMEM מתקדם בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. מאוחר יותר, צנטריפוגה של שני סוגי התאים בנפרד בטמפרטורת החדר של פי 100 G למשך 10 דקות.

לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשעה מחדש את ה- PHHs בזריעה חמה של מדיום DMEM מתקדם ו- HKCs במדיום DMEM מתקדם לזריעה קרה כקרח באמצעות מיליליטר אחד לכל בקבוקון של התאים שנוספו לצינור. השעו מחדש את התאים בפעולת נדנדה עדינה, ולאחר מכן הניחו על קרח. כאשר מושעה, לספור את התאים ולרשום את הכדאיות.

כדאיות התא חייבת להיות מעל 85% לאחר מכן, נתק את הנהג מתחנת העגינה והנח את הנהג בארון הבטיחות המיקרוביולוגי או MBSC. לאחר מכן שאפו את המדיה מעל הפיגום לנקודת העצירה, הערוץ והמאגר, והותירו נפח מת של 0.2 מיליליטר בבאר התרבית, והגיעו ממש מעל הפיגום. הוסף 400 מיקרוליטרים של זריעת מדיום DMEM מתקדם לתא הבאר לפני החזרת הנהג לתחנת העגינה באינקובטור, והפעלת תוכנית שינוי המדיה במשך שלוש דקות.

לאחר שלוש דקות, נתק את מנהל ההתקן מתחנת העגינה והנח את מנהל ההתקן בחזרה ב- MBSC. שאפו את המדיה מהפיגום הנ"ל עד לנקודת העצירה ובקצה המאגר של כל באר, ולאחר מכן תלו מחדש את ה- PHHs על ידי נדנדה עדינה של הצינור, והוספת הנפח הנדרש של מתלה התא לכל באר תרבית. בזהירות pipette את מתלה התא, להבטיח פיזור שווה של התאים על פני פיגום צלחת.

בזהירות להשעות מחדש HKCs, ולהוסיף את מתלי התאים לכל תרבית היטב. לאחר שכל הבארות מכילות את שני סוגי התאים, הניחו את המערכת המיקרופיזיולוגית או את מנהל ההתקן MPS על תחנת העגינה באינקובטור מבלי להתחבר פיזית לעמוד במשך שעה אחת. לאחר שחלפה שעה, חבר את הנהג לתחנת העגינה והפעל את תוכנית הזרעים.

כאשר התוכנית מושהית באופן אוטומטי בשתי דקות, הסר את מנהל ההתקן מהאינקובטור, והוסף באיטיות 1, 000 מיקרוליטר של מדיום DMEM מתקדם לערוץ כדי להשיג נפח כולל של 1.4 מיליליטר. מאוחר יותר, להעביר את הצלחות לחממה, ולהפעיל את שאר תוכנית הזרעים במשך שמונה שעות. ביום הרביעי, השהה את התוכנית בבקר, ונתק את הנהג ואת הצלחת מתחנת העגינה.

העבר אותם ל- MBSC. השתמש בפיפטה כדי לאסוף באופן ידני כמיליליטר אחד של מדיה מכל באר לניתוח סמנים ביולוגיים מסיסים מבלי להפריע לתרבית התאים על ידי נגיעה בפיגום. תייג את המדיה שנאספה כדגימות יום רביעי, והפעיל מבחני לקטט דהידרוגנאז ואוריאה כבדיקת בקרת איכות כדי להבטיח שהזריעה הצליחה.

לאחר מכן, מינון כל באר על פי תוכנית הצלחת על ידי ביצוע שינוי המדיה. לאחר השלמתו, החזירו את הנהג לתחנת העגינה בחממה, והפעילו את תוכנית הדגירה. ביום השישי, נתק את הנהג ואת הצלחת מתחנת העגינה, והעבר ל- MBSC.

השתמש בפיפטה כדי לאסוף כמיליליטר אחד של מדיה מכל באר, ותייג כ-48 שעות לאחר דגימות מנה ואחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס לבדיקות מאוחרות יותר. ביום השמיני, הסירו את הפיגומים מהצלחות באמצעות זוג פינצטות, והניחו את הפיגומים בצלחת של 24 בארות המכילות 500 מיקרוליטרים של DPBS ללא סידן ומגנזיום בכל באר מבלי להפריע לרקמת המיקרו. צלם את התמונות של כל פיגום תחת מיקרוסקופ אור הפוך בהגדלה של פי 10.

ביום הרביעי, לפני מינון התרופה, בוצעה בדיקת בקרת איכות של רקמות מיקרו בכבד שנוצרו עם שחרור LDH וסינתזת אוריאה. ביום השמיני, מדדי בריאות וכבד מרובים כגון אלבומין, אוריאה, CYP שלוש A ארבע, ATP הוערכו כדי לאשר רמות גבוהות של פונקציונליות הכבד ושכפול במיקרורקמות. מיקרוסקופיית פאזה ניגודית וכתמי IF במיקרו-רקמות הכבד חשפו את ההתפלגות השווה של HKCs במיקרו-רקמות PHH.

החשיפה החריפה של מיקרו-רקמות הכבד לטרוגליטזון גרמה לרעילות, אשר זוהתה על ידי אלנין אמינוטרנספראז או ALT, ושחרור LDH וירידה מהירה בייצור אלבומין ואוריאה. תכולת ה-ATP ופעילות CYP 3 A ארבע אישרו את הרעילות הנגרמת על ידי troglitazone, וערכי EC50 היו דומים מאוד לנקודות קצה אחרות. תמונות המיקרוסקופיה של שדה בהיר שצולמו לאחר תרבית של שמונה ימים ב-MPS חושפות מיקרו-טישו כבד בריא, שנזרע באופן אחיד בכל הפיגומים בבקרת הרכב.

מוות או השפלה של רקמות נצפו בשכפולים שטופלו בשליטה חיובית ובטרוגליטזון. בנוסף, נבדקה גם רעילות בכבד בעקבות חשיפה לפיוגליטזון. לא זוהה שחרור LDH או ALT, עם זאת, ירידה קלה בייצור אלבומין ואוריאה נצפתה לאחר 48 שעות.

ירידה קלה בתכולת ה-ATP נצפתה בריכוזי פיוגליטזון גבוהים. ערכי EC50 נוצרו מעקומות תגובת המינון. המיקרוסקופיה גילתה שינוי קל במיקרו-רקמה לאחר 96 שעות של חשיפה לפיוגליטזון בשני הריכוזים הגבוהים ביותר שנבדקו.

במחקר, השימוש בתאים בעלי איכות טובה וכדאיות מעל 85% חיוני ליצירת מיקרו-רקמות תלת-ממדיות מתפקדות ובריאות מאוד במערכת המיקרופיזיולוגית. לאחר הליך זה, אנו יכולים להעריך אינטראקציות אדנין ותרופות-תרופות ופגיעה בכבד הנגרמת על ידי תרופות במודלים של מחלות כגון דלתא הפטיטיס לא אלכוהולית או מודל מחלת כבד שומני שאינו אלכוהולי המשתמש בתרבית משולשת של תאים פרנכימליים בכבד ולא פרנכימליים.