Name: הסרת אתר התחלה תרגומי פנימי מ- mRNA תוך שמירה על הביטוי של חלבון באורך מלא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: למדו פרוטוקול לזיהוי גנוטיפים בעכברים עם מוטציית נקודה M213L בגן Gja1 באמצעות PCR ואנזימי הגבלה. שיטה זו מאפשרת ייצור Connexin43 באורך מלא תוך מניעת תרגום איזופורם GJA1-20k.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט נתמך על ידי מכונים לאומיים של מענקי בריאות (R01HL152691, R01HL138577, ו R01HL159983) ל RMS.

כל פרוטוקולי הטיפול והלימוד בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש במרכז הרפואי סידרס-סיני ובאוניברסיטת יוטה. עכברות C57BL/6J שהתקבלו ממקורות מסחריים בגיל 8-9 שבועות (ראו טבלת חומרים) שימשו לניסויים.
1. הכנה למיקוד גנים
<ol><li>בחר את רצף יעד המדריך סביב אתר המוטציה הממוקד קידוד M213 באמצעות אלגוריתם האינטרנט CRISPOR 4,9,10 (ראה טבלת חומרים). הערה: נבחר רצף מדריך בן 20 בסיסים (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), בגדיל הנגדי מרצף הקידוד של GJA1, עם ציון MIT11 מתוך 62 שבו אתר המחשוף הפוטנציאלי ממוקם לאחר 16 בסיסים במורד הזרם של הקודון שיש לעבור מוטציה (ATG) (איור 1; רצף crRNA כולו מוצג בטבלה 1).</li>
	<li>לסנתז את crRNA ו tracrRNA אינטראקציה עם Cas9 כמדריך RNA12. הערה: למרות שציון MIT של RNA המדריך הוא 62, יש רק מוטציה פוטנציאלית אחת מחוץ למטרה עם ארבעה אי-התאמות במרחק של יותר מ-12 בסיסים מה-PAM. לכן, מדריך זה RNA נחשב בטוח.</li>
	<li>עיצוב אוליגו תורם משלים לרצף המדריך כדי להציג תחליף חומצת אמינו אחת (ATG ל- TTA; M213L) עם 60 ו-48 בסיסים זרועות הומולוגיות בצדדים 5'-ו-3', בהתאמה. הערה: אוליגו תורם זה כולל מוטציה נקודתית לשיבוש של PAM (AGG ל- ACG) על ידי החדרת מוטציה שקטה (TCC ל- TCG; S217S) כדי להימנע מעריכה מחדש לאחר תיקון הומולוגיה (HDR)13 בהוראת CRISPR להכנסת המוטציות המיועדות (איור 1 וטבלה 1).</li>
	<li>השתמש NaCl (200 mM ריכוז סופי) כדי לזרז 10 מיקרוגרם של אוליגוס כדי למזער את נשיאת מלח לתוך מאגר microinjection pronuclear (10 מ"מ של טריס-HCl, pH 7.5; 0.1 מ"מ של EDTA, ו 100 מ"מ של NaCl ללא זרע וזרע14). הערה: אין לשטוף את גלולה ה- DNA עם 70% אתנול כמו גלולה ניתן להמיס לתוך הפתרון.</li>
	<li>יש לערבב 50 ננוגרם/μL של אוליגו תורם, 60 ננוגרם/μL של תערובת crRNA/tracrRNA (יחס טוחנת של 1:1) (משלב 1.2) ו-50 ננוגרם/μL של חלבון eSpCas9 (ראו טבלת חומרים) להכנת תערובת CRISPR בנפח הסופי 20 μL (טבלה 2). להקטין את הריכוז של אוליגו התורם אם רעילות גבוהה הוא ציין (למשל, 25 ng/μL).</li>
</ol>2. אינדוקציה של superovulation, קצירת ביצים, מיקרו-חדיר פרונוקלארי של תערובת CRISPR, והקרנת בלסטוציסט
הערה: הליך זה פועל בהתאם לפרוטוקול כללי14 שפורסם בעבר.
<ol><li>הזרקו 5 IU של PMSG (גונדוטרופין בסרום של סוסה בהריון) (ראה טבלת חומרים) ב 100 μL של מים סטריליים ל 5-10 עכברים בגיל 8 שבועות על ידי גישה תוך-אפריטונית בסביבות 3:00 p.m. (יום 1).</li>
	<li>הזרקת 5 IU של hCG (גונדוטרופין כוריוני אנושי) (ראה טבלת חומרים) ב 100 μL של מים סטריליים לתורמי הביציות על ידי גישה תוך-פריטטונית 46-48 שעות לאחר הזרקת PMSG (יום 3). להגדיר 1:1 רבייה עם זכרי הרבעה.</li>
	<li>קציר ביצים מופרות במדיום M2 עם היאלורונידז, לשטוף שלוש פעמים ב 100 μL של M2 בינוני סביב 10:00 a.m., ולאחר מכן לשמור mWM15 או KSOM16 בינוני (יום 4) (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>הציגו את תערובת CRISPR (שלב 1.3) לעוברים בשלב של תא אחד שנקטפו מהעכברים על ידי מיקרו-ג'קציה פרונוקלארית14 ב-100 μL של M2 המכוסה בשמן פרפין בצלחת פלסטיק במיקרוסקופ הפוך עם אופטיקה משפרת ניגודיות בשעות אחר הצהריים המוקדמות עד שעות אחר הצהריים המאוחרות (וידאו 1). הערה: microinjection pronuclear של תערובת CRISPR בוצע על עוברי שלב תא אחד ב 14-16 שעות פוסט-קויטום (p.c.). העוברים המוזרקים היו מתורבתים בחממה של 5% CO2 במשך כמה שעות והועברו בניתוח במהירות של 18-20 שעות p.c. לעכברי ICR נמען שהיה להם תקע הזדווגות באותו בוקר.</li>
	<li>העבר 20-30 עוברים דו-תאיים לכל נמען כדי לייצר בעלי חיים רקומביננטיים. הערה: בצע את הפרוטוקול הכללי14 או תרבות העוברים האלה במדיום mWM או KSOM במשך 4 ימים כדי לאמת את היעילות ולבחון רעילות. רעילות של תערובת CRISPR מקובלת כאשר לפחות שליש מהעוברים המוזרקים מגיעים מוקדם לשלב הבלסטוציסט המורחב במלואו עם רקומביננטים מרובים ביניהם. יחד עם זאת, יותר מ -90% מהעוברים הלא מנוהלים מגיעים לאותו שלב בלסטוציסט בתרבות מקבילה. בצע את השלב 2.6-2.9 עבור הקרנת blastcyst אשר אינו חיוני אבל ניתן לעשות אם עדיף לכמת את שיעור ההצלחה של HDR.</li>
	<li>בנפרד להרים מוקדם עד מורחב מלא blastocysts עם 2 μL של מדיום תרבות באמצעות קצה פיפטה בסדר מחובר עם micropipetter לתוך צינורות PCR יחיד (יום 8; וידאו 2).</li>
	<li>Lyse blastocysts ב 8 μL של תערובת עיכול (זהה לשלב 3.2; ראה טבלת חומרים) ולעבד ב 75 °C (75 °F) במשך 10 דקות, 95 °C (95 °F) במשך 5 דקות, ולאחר מכן להתקרר עד 4 °C (60 °F) לאחסון. השתמש 2 μL של lysate כתבנית עבור PCR בתערובת כוללת של 15 μL PCR (שלב 3).</li>
	<li>בדוק את היעילות של HDR על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose17 של דגימות PCR בעקבות עיכול הגבלה עם NlaIII (שלב 3-5).</li>
	<li>אשר את הסטטוס של רקומבינציה ממוקדת על ידי ריצוף 668 bp amplicon17 במייסדים וצאצאים הבאים כדי לאשר את שלמות המוטציה.</li>
</ol>3. מיצוי דנ"א
הערה: עכברים ביום שלאחר הלידה 10 שימשו לניסוי זה עקב מוות פתאומי של עכבר נוקאאוט GJA1-20k סביב 2-4 שבועות לאחר הלידה4. ניתן גם להחיל פרוטוקול כללי יותר בעקבות דוח18 שפורסם בעבר.
<ol><li>חותכים 1-3 מ"מ של הבוהן או קצה הזנב עם מספריים נקיות ולהעביר אותו לצינור PCR 8 פסים 0.2 מ"ל. כדי למנוע זיהום בין דגימות הבוהן או הזנב, השתמש במספריים מנוקים מראש או להב אחד לכל עכבר או לנקות לפני כל מדגם באמצעות 70% אתנול או 10% אקונומיקה. אם הזנב מדמם לאחר הדגימה, להחיל לחץ קצר עם גזה כדי לעצור את הדימום. לאחסן את דגימות הזנב ב -20 °C (50 °F) עד החילוץ עד כשבוע.</li>
	<li>הוסף פתרון תמיסת תמוגה רקמה (ראה טבלת חומרים) ב 100 μL / צינור ולערבב היטב, ואחריו ספין למטה עם מיני צנטריפוגה שולחן (2,200 x גרם עבור 10 s בטמפרטורת החדר). ודא שדגימות הזנב שקועות בפתרון.</li>
	<li>הגדר את הצינורות על מחזור תרמי שנקבע על ידי התוכנית הבאה; 75 °C (10 °F) במשך 10 דקות (תמוגה רקמות), 95 °C (95 °F) במשך 5 דקות (איון) ו 4 °C (מחזיק). לאחסן את lysate הרקמה ב 4 °C (65 °F) עד שבוע אם PCRs לא ניתן לבצע באופן מיידי.</li>
</ol>4. הגברת DNA על ידי PCR
<ol><li>הכן פתרון PCR המכיל 5 μL של H2O ללא נוקלאז, 0.75 μL של 10 מיקרומטר קדימה ואחורה פריימרים, ו 7.5 μL של תערובת מאסטר PCR (ראה טבלת חומרים) לכל מדגם לתוך צינור PCR חדש (ראה טבלה 1 עבור רצפי פריימר). אם יש כמה דוגמאות, קנה מידה תוכן aliquot 14 μL לכל צינור.</li>
	<li>הוסף 1 μL של lysate הרקמה לפתרון PCR מוכן בשלב 3.1. תיזהר לא לגעת בזנב.</li>
	<li>מערבבים היטב ומסתובבים עם מיני צנטריפוגה על השולחן (2,200 x גרם ל-10 שניות בטמפרטורת החדר).</li>
	<li>הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי שנקבע על ידי התוכנית המפורטת להלן. אחסן את מוצרי PCR בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך 1-2 חודשים או ~ שנה אחת ב- -20 °C (60 °F). הערה: 95 °C (שלב 3 דקות, שלב 1, Denaturation ראשוני), 95 °C (שלב 15 s (שלב 2, Denaturation), 60 °C (60 °F עבור 15 s (שלב 2, חישול), 72 °C עבור 45 s (שלב 2, הרחבה), חזור על שלב 2 במשך 35 מחזורים, 72 °C (7 °C במשך 10 דקות (שלב 3, הרחבה סופית) ו 4 °C (שלב 4, החזקה).</li>
</ol>5. דגירה עם אנזים הגבלה
<ol><li>הכן את פתרון האנזים המכיל 7 μL של H2O ללא נוקלאז, 2 μL של חיץ CutSmart 10x, ו 1 μL של אנזים הגבלת NlaIII (ראה טבלת חומרים). אם יש כמה דוגמאות, להכפיל כל תוכן כדי להפוך את התערובת aliquot 10 μL לכל שפופרת.</li>
	<li>הוסף 10 μL של מוצר PCR המתקבל בשלב 3 לתמיסת האנזים לכל צינור.</li>
	<li>מערבבים היטב ומסתובבים עם מיני צנטריפוגה על השולחן (2,200 x גרם ל-10 שניות בטמפרטורת החדר).</li>
	<li>הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי או בלוק חום שנקבע על ידי התוכנית המפורטת להלן. לאחסן את המוצר לאחר הדגירה ב 4 °C (4 °F) במשך 1-2 חודשים או ~ 1 שנה ב -20 °C (60 °F). הערה: 37 °C (16 °F) עבור 16 שעות (לפחות 2 שעות; זמן דגירה קצר עלול לגרום מחשוף לא מספיק) ו 4 °C (4 °F) עבור החזקה.</li>
</ol>6. זיהוי רצועת DNA
<ol><li>הכן ג'ל 1.5% agarose המכיל כתם ג'ל DNA עבור אלקטרופורזה.<ol>
<li>מוסיפים 0.75 גרם agarose ב 50 מ"ל של חיץ TAE 1x ואחריו לערבב ולחמם במיקרוגל עד agarose מתמוסס לחלוטין. לאחר הקירור, מוסיפים 5 μL של כתם DNA ומערבבים בעדינות.</li>
		<li>יוצקים לתבנית הג'ל (25 מ"ל לתבנית) ומניחים לג'ל להתמצק. כדי להשיג רזולוציה והפרדה טובה יותר, להגדיל את ריכוז agarose ל 2.5%-4% לפי הצורך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>טען 10 μL של מוצר PCR מעוכל לבאר. יש לערבב מאגר טעינה 6x, במידת הצורך.</li>
	<li>הפעל את הג'ל עם 100 V במשך 35 דקות. הערה: ייתכן שפרמטרים אלה יזדקקו למיטוב.</li>
	<li>תמונה תחת אור UV (אורך גל של 302 ננומטר).</li>
</ol>

<ol><li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li>
<li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905(2017).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li>
<li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gels+to+chips%3A+%26%2334%3Bminisequencing%26%2334%3B+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">From gels to chips: &#34;minisequencing&#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li>
<li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+%28Medicago+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li>
<li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+%28db%2Fdb+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , (2014).</li>
<li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+sodium+lactate+in+Whitten%27s+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li>
<li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li>
<li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MRS+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)</a>. , (2012).</li>
<li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments.+95%22%5BJournal%5D)">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879(2015).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503(2018).</li>
<li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keep+off-target+effects+in+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081(2018).</li>
<li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li>
<li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis%2C+metabolic+quiescence%2C+and+cardioprotection+against+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900(2018).</li>
<li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207(2021).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מודל עכבר שעבר שינוי גנים הוא גישה נפוצה להבנת תפקוד הגנים. עם זאת, מאז GJA1-20k בתרגום פנימי איזופורם מתורגם מאותו Gja1 mRNA כמו Cx43 באורך מלא, אסטרטגיה יצירתית הומצאה כדי לשמור על ביטוי Cx43 באורך מלא עדיין לדכא ביטוי GJA1-20k. הגישה מבוססת על מוטציה של קודון ההתחלה הפנימי של GJA1-20k. עם מוטציה של נקודה אחת, M213 הוחלף ל- L ב- Gja1 mRNA, שהצליח לדכא את ביטוי GJA1-20k אך שמר על ביטוי Cx43באורך מלא 4.
עם זאת, המוטציה נקודתית של אתר התחלה של תרגום פני...

קונקסין 43 (Cx43) באורך מלא ואיזופורם טרמינל N-terminus, GJA1-20k, מקודד על ידי אותו GJA1 mRNA אך משתמשים בקודוני התחלה שונים1 כדי ליזום תרגום. תרגום Cx43 מתרחש בקודון ההתחלה הראשון של AUG, בעוד שתרגום GJA1-20k יוזם ב- AUG בשאריות 213. בעבר נמצא כי GJA1-20k יש תפקידים חיוניים עבור סחר Cx43 באורך מלא, ייצוב actin, ורגולציה של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית במבחנה 1,2,3.
כדי להבין את התפקיד של GJA1-20k ב vivo, GJA1-20k "לדפוק החוצה" מודל העכבר נוצר ששומר על היכולת ליצור Cx43 באורך מלא. הגישה הייתה להשתמש במערכת CRISPR-Cas9 כדי להחליף את השאריות הבודדות ב-213 ממתיונין (ז) ללאוצין (L) (Gja1M213L/M213L)4. מוטציה פנימית M ל- L מקטינה באופן דרמטי את הסבירות לתרגום פנימי המתרחש אך שומרת על התרגום והתפקוד של חלבון באורך מלא4. מכיוון שלסוג הפראי (WT) ולאלל שעבר מוטציה יש גדלים זהים ומוצרי mRNA כמעט זהים, קיים קושי ניכר באישור גנוטיפ בעכברים. ריצוף דנ"א יכול לזהות את המוטציה, אך הוא יקר מדי וגוזל זמן רב מדי לשימוש שגרתי. באופן כללי, הוקמו מספר שיטות גנוטיפינג מהיר יותר, כגון תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR), מיני-קשירה-קשירה, ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה, ומערכת מוטציה עקשן הגברה טטרה-פריימר PCR (נשק-PCR)5,6,7,8. עם זאת, שיטות חלופיות אלה דורשות שלבים מרובים, משאבים ייחודיים ו/או מספר ערכות פריימר ספציפיות אשר יכולות לגרום למוצרי PCR שאינם ספציפיים.
פרוטוקול זה מציג גישה מפורטת של פילוח ועריכה של גנים על ידי CRISPR-Cas9 כדי ליצור מוטציה אחת בחומצת אמינו, וגנוטיפינג מהיר מוצג כדי לאשר את המוטציה. זיהוי גנוטיפ כרוך בשימוש יצירתי באנזימי הגבלה המשתמשים רק בערכה אחת של פריימרים כדי לזהות את גן היעד. הקוראים מופנים Reference4 כדי לבחון את ההשפעה האלקטרופיזיולוגית העמוקה של מוות לבבי פתאומי הנגרמת על ידי שאריות אחת Gja1M213L / M213L מוטציה החלפת אשר עדיין מייצר חלבון באורך מלא עדיין לא מצליח לייצר איזופורם חיתוך קטן יותר מתורגם פנימית. פרוטוקול זה יסייע להפוך מודלים עכברים אחרים להשתמש מוטציה נקודתית כדי להקטין את התרגום הפנימי של איזופורם של עניין תוך שמירה על הביטוי של חלבון אנדוגני באורך מלא.

<table><tbody><tr><td>0.2 מ"ל צינור PCR 8 רצועות</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>1148A28</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>למאגר מיקרוקור פרו-גרעיני</td></tr><tr><td>10x CutSmart buffer</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B7204S</td><td>מאגר עיכול עבור NlaIII</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td>עבור מאגר מיקרוקור פרו-גרעיני</td></tr><tr><td>50x TAE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>24710-030</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>דגם # 9902</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>664</td><td>זן עכבר</td></tr><tr><td>Chemidoc MP מערכת הדמיה</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>לצילום תמונת ג'ל על ידי חלבון</td></tr> <tr><td></td><td>eSpCas9 אור UV 302 ננומטרMilliporeSigma</td><td>ESPCAS9PRO-50UG</td><td></td></tr><tr><td>צבע ג'ל סגול (6x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td>מאגר טעינה לאלקטרופורזה</td></tr><tr><td>כפפות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG (גונדוטרופין כוריוני אנושי)</td><td>MilliporeSigma</td><td>23-073-425G</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3884-100MG</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת</td> <td>מעבדת תמונותBio-rad</td><td></td><td>לניתוח תמונת ג'ל</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו הפוך whit plasDIC</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert A1</td><td></td></tr><tr><td>KAPA ערכות גנוטיפ של עכבר</td><td>Roche Diagnostics</td><td>KK7352</td><td>לליזה של רקמות או תאים, מיצוי DNA ותערובת מאסטר</td></tr><tr><td>PCR KSOM</td><td>LifeGlobal</td><td>ZEKS-050</td><td>מדיום תרבית עובר</td></tr><tr><td>מעבדה קוארט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M2 מדיום</td><td>MilliporeSigma</td><td>MR015D</td><td></td></tr><tr><td>NlaIII</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0125S</td><td>לעיכול מוצר PCR</td></tr><tr><td>אמביון</td><td>מים ללא נוקלאז</td><td>AM9937</td><td>לדילול ריאגנטים</td></tr><tr><td>שמן פרפין</td><td>Nacalai USA</td><td>2613785</td><td></td></tr><tr><td>Plugged 20 &mu; L קצה פיפטה עדין</td><td>FisherScientific</td><td>02-707-171</td><td>לאיסוף בלסטוציטים</td></tr><tr><td>PMSG (סוסה בהריון' s סרום gonadotropin)</td><td>ProSpec-Tany</td><td>HOR-272</td><td></td></tr><tr><td>נתרן</td><td>כלורי Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td>עבור מאגר מיקרוקור פרו-גרעיני</td></tr><tr><td>SYBR בטוח DNA כתם ג'ל</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>לאיתור רצועות בג'ל</td></tr><tr><td>tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002000-120</td><td>מדריך RNA</td></tr></tbody></table>

הסרת אתר התחלה תרגומי פנימי מ- mrna תוך שמירה על הביטוי של חלבון באורך מלא

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

מערכת עריכת הגנים CRISPR-Cas9, המבוססת על מנגנוני תיקון גנום, מאפשרת ליצור מודלים של עכברים שעברו שינוי גנטי במהירות ובקלות רבה יותר ביחס לשילוב ההומולוגי המסורתי. מערכת CRISPR-Cas9 אטרקטיבית במיוחד כאשר נדרשת מוטציה של נקודה אחת. חלבון צומת הפערים, Connexin 43 (Cx43), מקודד על ידי הגן Gja1, שיש לו אקסון קידוד יחיד ולא ניתן לחבר אותו. עם זאת, Gja1 מייצר לא רק חלבון Cx43 באורך מלא אלא עד שישה איזופורמים חתוכים N-טרמינוס על ידי תהליך המכונה תרגום פנימי, תוצאה של חניכת תרגום ריבוזומלי באתרי התחלה פנימיים AUG (מתיונין). GJA1-20k הוא האיזופורם החתוך הנפוץ ביותר שנוצר של Cx43 שיזם בקודון AUG במיקום 213 של Gja1 mRNA. מכיוון שאריות 213 מתרחשת בסוף תחום transmembrane האחרון של Cx43, GJA1-20k הוא למעשה זנב 20 kDa C-terminus של Cx43 כחלבון עצמאי. חוקרים קודמים זיהו, בתאים, כי תפקיד קריטי של GJA1-20k הוא להקל על סחר של hemichannels צומת פער Cx43 באורך מלא לקרום הפלזמה. כדי לבחון תופעה זו ב- vivo, נוצר עכבר מוטנטי עם מוטציה נקודתית Gja1 המחליף את ה- ATG (מתיונין) בשאריות 213 עם TTA (לאוצין, מוטציה M213L). התוצאה של M213L היא כי Gja1 mRNA ו Cx43 באורך מלא עדיין נוצרים, עדיין התרגום של Gja1-20k מופחת באופן משמעותי. דו"ח זה מתמקד בבחירת אתר אנזימי ההגבלה לפתח מודל עכבר מוטציה אחת של חומצת אמינו (Gja1M213L/M213L). פרוטוקול זה מתאר עכברים מהונדסים גנטית על ידי מערכת CRISPR-Cas9 וגנוטיפינג מהיר על ידי שילוב של PCR וטיפולי אנזימי הגבלה.

מערכת עריכת הגנים CRISPR/Cas9 מייצרת מוטציה ATG ל- TTA ומוטציה שקטה של TCC ל- TCG ב-56,264,279 עד 56,264,281 וב-56,264,291 עד 56,264,293 בכרומוזום עכבר 10, או ב-869 עד 871 ו-881 עד 883 ב-Gja1 mRNA, בהתאמה. מוטציה זו גורמת למוטציה של מתיונין 213 עד לאוצין (M213L) בחלבון GJA1 והמוטציה TTC ל- TTG משבשת רצף PAM סמוך כדי להימנע ממהדורת גנים לא רצויה (איור 1). פרטי המוטציה מתוארים בדו"ח קודם4.
כדי לנתח גנוטיפים נכונים, מוצרי ה-PCR צריכים להתעכל ע...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מוטציה אחת M213L ב- Gja1 השומרת על דור Connexin43 באורך מלא אך מונעת תרגום של איזופורם קטן יותר של GJA1-20k שתורגם באופן פנימי.

הסרת אתר התחלה תרגומי פנימי מ- mRNA תוך שמירה על הביטוי של חלבון באורך מלא

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

הקושי בהחלפת שאריות בודדות הוא לגנוטיזציה יעילה של בעלי חיים למרות ההבדל בשאריות בודדות. שימוש מיוחד באנזים הגבלה מוסיף רק שלב אחד, מהיר ובעלות נמוכה לגנוטיפינג טיפוסי המבוסס על PCR. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל מודל עכבר אחר עם נקודת מוטציה אם רצף היעד מזוהה על ידי אנזים הגבלה, וזה בדרך כלל המקרה.חותכים 1 עד 3 מילימטרים של קצה הזנב עם מספריים נקיים ולהעביר אותו לצינור PCR שמונה רצועות 0.2 מיליליטר. לאחר שהכיל את דגימת הזנב כמתואר בכתב היד, לאחסן אותו ב T-מינוס 20 מעלות צלזיוס עד החילוץ, עד כשבוע. הוסף 100 מיקרוליטרים של תמיסת תמיסת רקמות לכל צינור וערבוב היטב, ואחריו ספין למטה באמצעות minicentrifuge שולחן ב 2, 200 פעמים G במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר.ודא שדגימות הזנב שקועות בפתרון. הגדר את הצינורות על מחזור תרמי להגדיר על ידי תכנות הפרמטרים עבור תמוגה רקמות, השבתה, והחזקה. לאחסן את lysate הרקמה בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע אם PCR לא ניתן לבצע באופן מיידי.הכינו פתרון PCR המכיל חמישה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז, 0.75 מיקרוליטרים של פריימרים קדמיים והפוך של 10 מיקרומולרים, ו-7.5 מיקרוליטרים של תערובת ראשית PCR לדגימה לצינור PCR חדש. הוסף מיקרוליטר אחד של ליסאט הרקמה שהוכן בעבר לתמיסת ה- PCR. ערבבו היטב את תמיסת ה-PCR והסתובבו עם מיני-צנטריפוגה עם שולחן ב-2, 200 פעמים G למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר.הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי מתוכנת. לאחר השלמת התגובה, לאחסן את מוצרי PCR בארבע מעלות צלזיוס במשך חודש עד חודשיים או כשנה אחת במינוס 20 מעלות צלזיוס. הכינו את תמיסת האנזים המכילה שבעה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז, שני מיקרוליטרים של מאגר CutSmart בעוצמה של פי 10, ומיקרוליטר אחד של אנזים הגבלת NlaIII.אם יש כמה דוגמאות, להכפיל כל תוכן כדי להפוך את התערובת aliquot 10 microliters לכל צינור. הוסף 10 מיקרוליטרים של מוצר PCR שהושג בעבר לתמיסת האנזים לכל צינור. מערבבים היטב ומסתובבים עם המיני-צנטריפוגה של השולחן כפי שהוכח בעבר.הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי מתוכנת או בלוק חום. יש לאחסן את המוצר לאחר הדגירה בתנאי קור. הוסף 0.75 גרם של agarose ב 50 מיליליטר של חיץ TAE חד-כוח.מערבבים ומחממים את האגרוז במיקרוגל עד שהוא מתמוסס לחלוטין. לאחר קירורו, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של כתם DNA וערבבו בעדינות. יוצקים 25 מיליליטר של ג'ל agarose לתוך תבנית הג'ל ולאפשר את הג'ל להתמצק.טען 10 מיקרוליטרים של מוצר PCR מעוכל לבאר. הפעל את הג'ל עם 100 וולט במשך 35 דקות. דמיינו את ג'ל האגרוז תחת אור אולטרה סגול.האלקטרופורזה האגרוזית שבוצעה באמצעות מוצר ה- PCR המעוכל הביאה למספר להקות בגדלים שונים בכל גנוטיפ, עם שתי להקות בסוג פראי, שלוש בהטרוזיגוס ואחת בהומוזיגוס, בהתאמה. הזרקת בדיקה עם ניתוח בלסטוציסט הביאה לשיעור הצלחה של 76.9% בהזרקת 50 ננוגרם למיקרוליטר של אוליגוס התורם, ושיעור הצלחה של 25% בהזרקת 25 ננוגרם למיקרוליטר של אותו אוליגוס תורם, בהתאמה. לבסוף, הזרקת 50 ננוגרם לכל מיקרוליטר של אוליגוס התורם עם משקעים אתנול השיג בעלי חיים מייסדים עם 50% הצלחה.טיהור תורמי אוליגו על ידי משקעים אתנול הוריד את הרעילות תוך שמירה על יעילות עריכת גנום גבוהה. טיפול זהיר והוספת כמות נמוכה של ריאגנטים חשוב מאוד. ודא שהם מתווספים כראוי ומעורבים היטב.

removal-an-internal-translational-start-site-from-mrna-while

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מכשול משמעותי מנתח ביוכימיים של הריבוזומים המכיל המתהווה peptidyl-tRNAs כבר נוכחות של הריבוזומים אחרים דגימות אותו, ריבוזומים לא מעורב בתרגום של רצף ה-mRNA ספציפי להיות מנותח. פיתחנו מתודולוגיה פשוטה כדי לטהר, בלעדי, את הריבוזומים המכיל את המתהווה peptidyl-tRNA של עניין.

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

טכניקה לזהות אתרים על הפסקה של תרגום ה-mRNA מתואר. הליך זה מבוסס על בידוד של פוליפפטידים המתהווה המצטברים על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה, ואחריו ניתוח בגודל של רשתות המתהווה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

המתואר כאן טכניקה כיום בשימוש שגרתי לבודד קשורות ביציבות הריבוזום מתחמי הרשת המתהווה (RNCs). שיטה זו מנצלת את הגילוי כי 17 חומצות אמינו ארוכה SecM "מעצר רצף" יכול לעצור את התארכות תרגום פרוקריוטים...

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין mRNAs endoplasmic reticulum הקשורים בתאי תרבית רקמת יונקים. טכניקה זו כרוכה permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה עם digitonin להסיר תוכן cytoplasmic אחרי...

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה משויך הקרום החיצוני מיטוכונדריה. אנו מתארים הליך חלוקה subcellular שמטרתה בידוד של שמרי המיטוכונדריה עם mRNAs הקשורים אליו והריבוזומים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים שגודל בתנאים מגוונים במטרה לחשוף את המנגנונים של לוקליזציה mRNA ותרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.

בידוד של mRNAs הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

Toeprinting נועד למדוד את היכולת של במבחנה עיבד RNA ל טופס תרגום חניכה מתחמי עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור toeprinting בתרבית של RNA והוא יכול לשמש כדי ללמוד תרגום תלויי-קאפ והן מונחות IRES.

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

מסירה ישירה של טרום התאספו Cas9/מדריך RNA ribonuאופאנפרוטאין מתחמי הוא אמצעי מהיר ויעיל לעריכת הגנום בתאי המטפאות. כאן, אנו מנצלים את הגישה הזאת כדי למחוק משתיק RUNX1 ביטרוניק ולבחון את התגובות הטרנדיות בתאי OCI-AML3 לוקמיה.

חקירת התפקיד הטרנססאני של משתיק הRUNX1 נית על ידי CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein בתאי לוקמיה מיאלואיד חריפה

הליך זה מתאר כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ואחריו transfection באמצעות Pulser ג'ין מערכת MXCell electroporation.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

Mutagenesis האתר בבימויו של פלסמידים כולה היא דרך פשוטה ליצור וריאציות שונות במקצת של הפלסמיד המקורי. כאן אנו מדגימים דרך יעילה קל עלות להציג החלפות בסיס לתוך ריאגנטים באמצעות פלסמיד רגיל.

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

למדו פרוטוקול לזיהוי גנוטיפים בעכברים עם מוטציית נקודה M213L בגן Gja1 באמצעות PCR ואנזימי הגבלה. שיטה זו מאפשרת ייצור Connexin43 באורך מלא תוך מניעת תרגום איזופורם GJA1-20k.

הסרת אתר התחלה תרגומי פנימי מ- mRNA תוך שמירה על הביטוי של חלבון באורך מלא

גלה סרטונים נוספים