הסרת אתר התחלה תרגומי פנימי מ- mRNA תוך שמירה על הביטוי של חלבון באורך מלא
16 במרץ 2022
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מוטציה אחת M213L ב- Gja1 השומרת על דור Connexin43 באורך מלא אך מונעת תרגום של איזופורם קטן יותר של GJA1-20k שתורגם באופן פנימי.
הקושי בהחלפת שאריות בודדות הוא לגנוטיזציה יעילה של בעלי חיים למרות ההבדל בשאריות בודדות. שימוש מיוחד באנזים הגבלה מוסיף רק שלב אחד, מהיר ובעלות נמוכה לגנוטיפינג טיפוסי המבוסס על PCR. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל מודל עכבר אחר עם נקודת מוטציה אם רצף היעד מזוהה על ידי אנזים הגבלה, וזה בדרך כלל המקרה.
חותכים 1 עד 3 מילימטרים של קצה הזנב עם מספריים נקיים ולהעביר אותו לצינור PCR שמונה רצועות 0.2 מיליליטר. לאחר שהכיל את דגימת הזנב כמתואר בכתב היד, לאחסן אותו ב T-מינוס 20 מעלות צלזיוס עד החילוץ, עד כשבוע. הוסף 100 מיקרוליטרים של תמיסת תמיסת רקמות לכל צינור וערבוב היטב, ואחריו ספין למטה באמצעות minicentrifuge שולחן ב 2, 200 פעמים G במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר.
ודא שדגימות הזנב שקועות בפתרון. הגדר את הצינורות על מחזור תרמי להגדיר על ידי תכנות הפרמטרים עבור תמוגה רקמות, השבתה, והחזקה. לאחסן את lysate הרקמה בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע אם PCR לא ניתן לבצע באופן מיידי.
הכינו פתרון PCR המכיל חמישה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז, 0.75 מיקרוליטרים של פריימרים קדמיים והפוך של 10 מיקרומולרים, ו-7.5 מיקרוליטרים של תערובת ראשית PCR לדגימה לצינור PCR חדש. הוסף מיקרוליטר אחד של ליסאט הרקמה שהוכן בעבר לתמיסת ה- PCR. ערבבו היטב את תמיסת ה-PCR והסתובבו עם מיני-צנטריפוגה עם שולחן ב-2, 200 פעמים G למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר.
הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי מתוכנת. לאחר השלמת התגובה, לאחסן את מוצרי PCR בארבע מעלות צלזיוס במשך חודש עד חודשיים או כשנה אחת במינוס 20 מעלות צלזיוס. הכינו את תמיסת האנזים המכילה שבעה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז, שני מיקרוליטרים של מאגר CutSmart בעוצמה של פי 10, ומיקרוליטר אחד של אנזים הגבלת NlaIII.
אם יש כמה דוגמאות, להכפיל כל תוכן כדי להפוך את התערובת aliquot 10 microliters לכל צינור. הוסף 10 מיקרוליטרים של מוצר PCR שהושג בעבר לתמיסת האנזים לכל צינור. מערבבים היטב ומסתובבים עם המיני-צנטריפוגה של השולחן כפי שהוכח בעבר.
הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי מתוכנת או בלוק חום. יש לאחסן את המוצר לאחר הדגירה בתנאי קור. הוסף 0.75 גרם של agarose ב 50 מיליליטר של חיץ TAE חד-כוח.
מערבבים ומחממים את האגרוז במיקרוגל עד שהוא מתמוסס לחלוטין. לאחר קירורו, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של כתם DNA וערבבו בעדינות. יוצקים 25 מיליליטר של ג'ל agarose לתוך תבנית הג'ל ולאפשר את הג'ל להתמצק.
טען 10 מיקרוליטרים של מוצר PCR מעוכל לבאר. הפעל את הג'ל עם 100 וולט במשך 35 דקות. דמיינו את ג'ל האגרוז תחת אור אולטרה סגול.
האלקטרופורזה האגרוזית שבוצעה באמצעות מוצר ה- PCR המעוכל הביאה למספר להקות בגדלים שונים בכל גנוטיפ, עם שתי להקות בסוג פראי, שלוש בהטרוזיגוס ואחת בהומוזיגוס, בהתאמה. הזרקת בדיקה עם ניתוח בלסטוציסט הביאה לשיעור הצלחה של 76.9% בהזרקת 50 ננוגרם למיקרוליטר של אוליגוס התורם, ושיעור הצלחה של 25% בהזרקת 25 ננוגרם למיקרוליטר של אותו אוליגוס תורם, בהתאמה. לבסוף, הזרקת 50 ננוגרם לכל מיקרוליטר של אוליגוס התורם עם משקעים אתנול השיג בעלי חיים מייסדים עם 50% הצלחה.
טיהור תורמי אוליגו על ידי משקעים אתנול הוריד את הרעילות תוך שמירה על יעילות עריכת גנום גבוהה. טיפול זהיר והוספת כמות נמוכה של ריאגנטים חשוב מאוד. ודא שהם מתווספים כראוי ומעורבים היטב.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתווה שיטה לביצוע גנוטיפיקציה של בעלי חיים עם מוטציה בודדת M213L בגן Gja1, המובילה לייצור של Connexin43 באורכו המלא תוך מניעת תרגום של האיסופורמה הקטנה יותר GJA1-20k. השיטה מדגישה את היעילות והכדאיות הכלכלית של שימוש באנזימי הגבלה בשילוב עם גנוטיפיקציה מבוססת PCR.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- גנטיקה
- ביולוגיה מולקולרית
- מודלים בבעלי חיים
רקע
- חשיבות זיהוי מוטציות גנטיות
- אתגרים של החלפות שארית בודדת
- יישום של אנזימי הגבלה בגנוטיפיקה
שיטות שבהן נעשה שימוש
- גנוטיפינג מבוסס PCR
- מודלים של עכברים עם מוטציות נקודתיות
- אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז לאנליזה של DNA
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של גנוטיפים בעלי תבניות פסים מובחנות
- שיעורי הצלחה גבוהים ביצירת בעלי חיים מייסדים (founder animals)
- תיקוף של היעילות של השיטות המתוארות לניתוח גנטי
מסקנות
- המחקר מדגים פרוטוקול יעיל לביצוע גנוטיפ של מוטציות במודלים של עכברים.
- הוא תורם מתודולוגיות בעלות ערך למחקר גנטי בביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר גנוטיפיקציה מדויקת של מוטציות נקודתיות במודלים של עכברים, ובכך תומך במחקרי תיקוף של מטרות שבהם יש צורך לנתח ביטוי חלבוני ספציפי לאיזופורמה. על ידי סילוק איזופורמות קטועות המהוות גורם מבלבל, תוך שימור התפקוד של החלבון באורכו המלא, הפרוטוקול משפר את הפחתת הסיכונים המכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מגבירה את רמת הביטחון החזויה עבור היפותזות טיפוליות הנוגעות לביולוגיה של Connexin 43 ומסלולי צומת פער (gap junction) קשורים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד התרומה הפונקציונלית של Cx43 באורכו המלא מאיזופורמים קטועים בקצה ה-N.
- ערך תפעולי: מספק שיטת גנוטיפיקציה ניתנת להרחבה להבחנה בין אללים של סוג פרוע (wild-type), הטרוזיגוטים ומוטנטים הומוזיגוטים בקוהורטים גדולים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי הבהרה האם הפנוטיפים שנצפו נובעים מאובדן החלבון באורכו המלא או ממנגנונים ספציפיים לאיזופורם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר דגימות DNA עם תבניות של מקטעי הגבלה המתאימות לזרימות עבודה של סריקה בקיבולת גבוהה.
- פלט כמותי: מאפשר כימות ספציפי לאלל באמצעות אנליזה של פולימורפיזם באורך מקטעי הגבלה (RFLP) ב-PCR.
- שחזוריות: מתקננת את הגנוטיפגיה בין מעבדות באמצעות הוספה של אנזים יחיד בעלות נמוכה לפרוטוקולי PCR קיימים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מסייע למודלים פרה-קליניים שבהם תעבורה של Cx43 והרכבת צממדי gap junction מעורבים בהפרעות לבביות, עצביות או אונקולוגיות.
- המשכיות טרנסלציונלית: מקשר בין הגנוטיפ המולקולרי לתוצאה הפנוטיפית על ידי שימור ביטוי של Cx43 באורכו המלא תוך הפחתת GJA1-20k.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריוני go/no-go על ידי מתן אפשרות למתאם בין רמות ביטוי של איזופורמים לבין תוצאות תפקודיות in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מטרות בשלב מוקדם ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, במיוחד כאשר יש צורך להבחין בין תפקודי חלבון ספציפיים לאיזופורמה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי אפשור מודלים גנטיים המבדילים בין תפקוד חלבון באורכו המלא לבין פעילות של איזופורמ קטוע.
- סריקה: מספק DNA גנומי מוכן לבדיקה עבור יישומים המשכיים, כגון תיקוף CRISPR או ניהול מושבות רבייה.
- אנליזה: מספק דפוסי רצועות ברורים הניתנים לדירוג על ג'ל אגרוז, המאפשרים קביעה מהירה של הגנוטיפ ללא צורך בריצוף.
- מחקר תרגומי: מאפשר מחקרים פרה-קליניים שבהם לוקליזציה של Cx43 בממברנה ותקשורת בין-תאית הם נקודות קצה מכניסטיות מרכזיות.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לכל מוטציה נקודית שבה ניתן להחדיר או לשבש אתר הגבלה (restriction site), ובכך מציע פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לטיפוס גנוטי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף המטרה על ידי בידוד תרומות ספציפיות לאיזופורם.
- ערך תפעולי: מגדיל את התפוקה ומפחית את העלות לדגימה באמצעות שלב בודד של עיכול רסטריקציה לאחר PCR.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות באופטימיזציה של מובילים (lead optimization) על ידי הבהרת קשרים בין גנוטיפ לפנוטיפ.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכון של מועמדים המכוונים למסלולים תלויי Cx43.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביולוגיה מולקולרית בתכנון פריימרים ל-PCR ובבחירת אנזימי הגבלה.
- תלוי בגישה למחזורי תרמיים (thermal cycllers), למערכות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ולציוד דימוי UV.
- דורש סטנדרטיזציה של תנאי הליזיס של הרקמה ותנאי ה-PCR בין המשתמשים השונים כדי להבטיח תוצאות עקביות.
- הסתגלות למערכות מודל חלופיות תלויה בהקשר הרצף ובתאימות של אנזימי ההגבלה.
- מוגבל למוטציות המשנות או יוצרות אתר זיהוי לאנזים הגבלה; מוטציות שקטות עשויות לדרוש אסטרטגיות חלופיות.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
DNA Extraction
1:45
DNA Amplification by PCR
2:42
Incubation with Restriction Enzyme
3:34
Preparation of 1.5% Agarose Gel for Electrophoresis and DNA Band Detection
4:22
Results: Genotype Analysis and Recombination Efficiency
5:21
Conclusion
