פריסת מדעני קהילה לביצוע דגימה גנטית לא פולשנית של אוכלוסיות פרפרים נדירות

פרוטוקול זה משתמש בגישה חדשנית של דגימת כוריון מפרפר בוקע לצורך ניתוח גנטי. זה עשוי להיות שימושי במיוחד כאשר טכניקות אחרות לדגימת רקמות אינן מעשיות, אינן זמינות או אינן מותרות. לפרוטוקול זה יש עלות כוללת נמוכה יחסית באמצעות אספקה קלה להשגה ומכוון לשאריות חומר אורגני המבטל את הצורך ללכוד או לתפעל באופן זמני ועלול לפגוע באורגניזמים חיים כדי לרכוש דגימות גנטיות.

הפרוטוקול הכולל הוא פשוט וקל ללמידה, אך דורש מיומנות ותשומת לב קפדנית לפרטים, במיוחד כדי לאתר, לזהות ולהסיר בהצלחה דגימות יעד קטנות מאוד כדי למנוע זיהום צולב בין אירועי איסוף דגימות. התחל בסקירה מדוקדקת ואיסוף של הרשימה המלאה של הציוד הקשור לאיסוף הדרוש. אם איסוף הדגימות מתרחש במספר מיקומים או על-ידי מספר אנשים או צוותים, אסוף וארגן את כל האספקה הדרושה ליחידות נפרדות הניתנות לפריסה.

הובלת אספקה למדעני הקהילה או לאנשי צוות אחרים האחראים על איסוף בשטח. אם כוח האדם אינו מקומי, ארוז בזהירות אספקה לתוך קופסת משלוח נפרדת מקרטון עם תווית משלוח מלאה ושלח אותם. עם קבלת ציוד האיסוף כולל תיבת האיסוף, יש לעיין בקפידה ברשימת האספקה הלמינציה ולערוך מלאי מלא.

הודע למנהל הפרוייקט אם חסרה אספקה כלשהי. מילוי מראש של צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר עם 180 מיקרוליטר של חיץ ליזה. החל תווית מזהה ייחודית מודפסת מראש על כל צינור מיקרוצנטריפוגה והנח את כל הצינורות בתיבת האחסון של צינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 64 בארות.

הדקו היטב את המכסה לאחר הטעינה. ודא שכל הציוד הדיגיטלי טעון במלואו וכל הסוללות הרזרביות ארוזות באריזה. מלאו חלקית צידנית קטנה בקרח לאחסון שדה ולהובלה מקומית של הדגימות שנאספו.

ארוז את כל חומרי האיסוף לתוך תיבת האיסוף או מיכל עמיד בפני מזג אוויר חזק דומה להובלה בטוחה ואחסון מאוחד. סקור את פרוטוקול איסוף הדגימות הגנטיות הלא הרסניות ופרט לפני היציאה לשטח. עם ההגעה לאתר השדה, השתמש בעיפרון או בעט כל מזג אוויר כדי לרשום את השעה ביום, התאריך, שם הנכס הכולל, השם או התיאור של מיקום אתר שדה ספציפי, קריאת GPS אם זמינה, ואת השם המלא והתפקידים של כל האנשים המופיעים במחברת השדה עמיד בפני מזג האוויר.

איתור בית גידול מתאים לנוכחות של צמח מארח זחלי לפרפר המטרה הספציפי למין. באמצעות טלפון חכם או מצלמה, צלם תמונות מפורטות של כל אתרי השטח, מיקומי איסוף דוגמאות, צמחים מארחים ומידע רלוונטי אחר. השתמש בסמארטפונים או במצלמות אחרות המתעדות קואורדינטות GPS.

ערכו חיפוש מקיף בכל חלקי הצמחים המארחים של הזחל, כגון עלים, ניצני פרחים, פרחים, או פרי מתפתח הידוע כפרי שנבחר על ידי נקבות פרפרים בוגרות עבור ביצים שבקעו. עבור רוב Lycaenidae, חפשו ביצים לבנות שבקעו עם חור מובהק במרכז הדומה לסופגנייה שממנה הגיח הזחל המיוחל. חפשו ביצים לא מבוקעות שצבען כהה יותר, לרוב ירוקות או כחלחלות, והן יהיו שלמות לחלוטין ללא חור באמצע.

ברגע שנמצאה ביצה שבקעה, יש ללבוש כפפות ניטריל. באמצעות מלקחיים סטריליים ומחודדים, תפסו ומשכו בעדינות את הביצה שנבקעה מהצמח המארח והכניסו אותה ישירות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה מסומן שמולא מראש בחיץ תזה. באופן דומה, ניתן להשתמש בדגימות רקמה אחרות ולעבדן.

ודא שכל החומר שנאסף שקוע במלואו במאגר הליזיס בתוך כל צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הקש על החלק התחתון של הצינור על משטח קשיח כדי להטביע מחדש דגימות במידת הצורך. בעת איסוף דגימה חדשה, יש להשליך כפפות ניטריל משומשות ולהחליף אותן בזוג נקי.

לאחר כל איסוף ביצים, נקו בזהירות את קצות המלקחיים על ידי טבילה או שימוש בהם בבקבוקון של 95% אתנול מבקבוק לחיץ או באמצעות מגבוני אלכוהול. אספו לפחות חמש דגימות לכל מדבקת צמח מארח לכל אתר, כאשר כל דגימה מכילה אחת עד 20 ביצים, בשאיפה ליותר מ-50 ביצים בסך הכל במיקום אם זמין. אספו 1-20 ביצים שבקעו ממספר צמחים באותו מדבקה של המארח לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה אחד וסגרו היטב את המכסה.

עבור מיני פרפרים המשתמשים במינים גדולים יותר של עושבוני או עצי פונדקאי, אספו ביצים מרובות ממקומות שונים על אותו צמח אם הכתמים המארחים מוגבלים. במחברת השדה העמידה בפני מזג האוויר, רשום את תווית המזהה הייחודית שהוקצתה יחד עם סוג הדגימה, המספר המשוער של הביצים שבקעו ופרטי האיסוף. החזירו את שפופרת המיקרוצנטריפוגה הסגורה עם דגימת פסולת הביצים לתיבת האחסון של מיקרוצנטריפוגה בגודל 64 בארות.

יש לתחזק את קופסת האחסון בצידנית עם קרח בזמן השהייה בשטח. מקם את כל חומרי האיסוף האחרים בתיבת האיסוף לאחסון ושינוע בטוחים ומאוחדים בין אתרים. מתוך 160 דגימות אלה, דנ"א הופק בהצלחה מ-88 בריכוז ממוצע של 1.67 ננוגרם למיקרוליטר ותפוקת הדנ"א הגבוהה ביותר הייתה 26.8 ננוגרם למיקרוליטר.

ריכוזי דנ"א לפי סוג רקמה אישרו כי בדגימות שהכילו פסולת ביצה אחת היה רק מקרה ביצה אחד ובדגימות שהכילו מקרי ביצים מרובים היו לפחות שני מקרים עם מספר המקרים שנע בין שניים ל-20, ממוצע ל-5.3 לדגימה. חומרים לאיסוף של עד 563 דגימות נשלחו לשמונה מדעני שימור וקהילה מתשע מדינות ברחבי טווח המינים במזרח אמריקה הצפונית. החומרים נשלחו במשך שלושה חודשים במהלך 2021 לפני שעות השיא המקומיות של הטיסות.

בסך הכל התקבלו 160 דגימות רקמת קשתית השתן של קלפליס. חיוני למזער את הזיהום הצולב בין הדגימות, לוודא שהדגימה שנאספה שקועה במלואה במאגר התזה, ולתעד במדויק את תווית הזיהוי הייחודית ואת נתוני האיסוף עבור כל דגימה. פרוטוקול זה איפשר פריסה נרחבת ושימוש על ידי מדעני הקהילה כדי לדגום באופן לא הרסני אוכלוסיות קיימות של פרפר נדיר כדי לסייע בביצוע ניתוח מבנה גנטי רחב טווח.