Name: שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: למדו שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות באמצעות מיקרוסקופיית אור. טכניקה זו מאפשרת הדמיית מבנים פטרייתיים וליקויים בפולימרי דופן התא של הפתוגן ללא ציוד יקר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד"ר הדסון ו. פ. דה קרבאליו על התמיכה בפיתוח עבודה זו. המחברים מודים גם למעבדה למיקרוסקופיית אלקטרונים ''פרופ' אליוט וואטאנאבה קיטג'ימה'' על אספקת המתקן למיקרוסקופיית אור. המחברים מודים לד"ר פלביה רודריגז אלבס פטריסיו על אספקת החומר הצמחי עם נגעים.

1. הכנת תמיסת האגירה והריאגנטים
<ol><li>הכן 2 M cacodylate buffer על ידי הוספת 4.28 גרם של נתרן cacodylate ל 100 מ"ל של מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל 7.25 עם 0.2 N HCl.</li>
	<li>הכן 100 מ"ל של תמיסת התיקון של קרנובסקי על ידי ערבוב של 10 מ"ל של 25% גלוטארלדהיד מימי, 10 מ"ל של 10% פורמלדהיד מימי, 25 מ"ל של 2 M cacodylate buffer, ו 0.5 מ"ל של 0.5 M CaCl226. להמציא את הנפח ל 100 מ"ל עם מים מזוקקים. הערה: ניתן לשמור את הפתרון במקרר למשך 6 חודשים. אזהרה: תמיסת האגירה של קקודילאט רעילה; לכן, טפל בתמיסה המקבעת במכסה אדים או בשטח פתוח. הימנעו משאיפת אדי התמיסה וללבוש כפפות בזמן הטיפול.</li>
	<li>הכן תמיסת הזנה מימית של Hoagland על ידי ערבוב הדברים הבאים: 3 mM Ca(NO3)2.4H 2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H 2O, 9.07 mM MNSO4, 0.765 mM ZnSO4.7H 2O, 46.4 mM H3BO3, 0.09 mM Na2MoO4. H2O, 0.01 mM CuSO4, ו-36 mM FeSO4.7H 2O כ-iron-EDTA (חומצה טטראצטית אתילנדיאמין)27.</li>
</ol>2. דגימות צמחים וחיסון פטריות
הערה: לניסויים בעלים המושפעים מחלודה של קפה, חמישה שתילים בני חודשיים של קפה ערביקה cv. Catuaí גודלו ונשמרו בחממה במרכז לאנרגיה גרעינית בחקלאות (CENA) של אוניברסיטת סאו פאולו, פירצ'יקאבה, מדינת סאו פאולו, ברזיל.
<ol><li>לגדל צמחי קפה בעציצים מפלסטיק של 500 מ"ל מלאים בתמיסת מזון מימית של Hoagland (pH של כ-5.5) למשך 4 חודשים בתא גדילה שנשמר בטמפרטורה של 27 ± 3 מעלות צלזיוס עם פוטופריוד של 12 שעות שנוצר על ידי מנורות LED בשטף הפוטונים של 250 מיקרומול פוטונים s-1 m-2. החלף את תמיסת החומרים המזינים Hoagland מדי שבוע במשך 4 חודשים.</li>
	<li>חסן ארבעה עלים מורחבים מחמישה צמחים על המשטחים האבקסיאליים שלהם עם 1 x 103 H. vastatrix uredospores בעקבות השיטה המתוארת בהתייחסות28. לאחר החיסון, יש לשמור את הצמחים במשך 48 שעות בחושך על ידי כיסוים בשקית ניילון שחורה. לקצור את הנגעים 30 יום לאחר החיסון.</li>
	<li>קציר נגעים אופייניים הנגרמים על ידי Cercospora coffeicola מ Coffea ערביקה cv. צמחי Obatã הממוקמים (קואורדינטות: -22.906506126269942, -47.015075902025266) במכון הביולוגי, קמפינאס, מדינת סאו פאולו, ברזיל. לפני עיבוד הדגימה, לנתח את הנגעים בסטריאומיקרוסקופ כדי לאמת את נוכחותו של קפה C. coffeicola conidia. לאחר מכן, הר כמה שקופיות עם conidia כדי לאשר את המחלה etiology22.</li>
</ol>3. קציר דגימות, קיבוע והתייבשות
<ol><li>באמצעות אזמל ופינצטה, לקטוף דגימת עלים של כ-10 מ"מ2 באזור האמצעי של הנגע (כתמים צהובים; איור 1) ולטבול אותו ב-30 מ"ל של תמיסה מקבעת קרנובסקי (איור 1 ואיור 2A). שלב הקיבוע יכול להתרחש במקרר במשך 48 שעות.</li>
	<li>במשך ארבע פעמים לפחות, העבירו את דגימת העלה לוואקום נמוך (500-600 mBar) באמצעות משאבת שמן למשך 15 דקות כל אחת כדי להגביר את החדירות של התמיסה המקבעת ברקמת העלה. בצע שלב זה באמצעות סיבוב מדגם (איור 1).</li>
	<li>לאחר הקיבוע, שטפו את דגימת העלים שלוש פעמים ב-0.5 M של חיץ קקודילט (pH 7.2) מדולל במים מזוקקים במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן העבירו אותה לסדרה אתנולית מדורגת (30%, 50%, 70%, 90%, 90% (2x) ו-100% (2x)) למשך 15 דקות בכל ריכוז אתנול (איור 1 ואיור 2B).</li>
</ol>4. הליך הטמעת היסטוריסין
<ol><li>העבר בהדרגה את הדגימות לגליקול מתקרילט (GMA) בשלושה שלבים, בהתאם להוראות היצרן. ראשית, הפוך את פתרון A על ידי ערבוב אבקת GMA (1 גרם) עם 100 מ"ל של שרף בסיסי (ערכת historesin; טבלת חומרים) תחת תסיסה מגנטית, ולאחר מכן בצע את השלבים הבאים.<ol>
<li>לטבול את הדגימות 1:2 פתרון A: 100% אתנול במשך 3 שעות.</li>
		<li>טבלו את הדגימות בפתרון 1:1 A: 100% אתנול למשך 3 שעות.</li>
		<li>לטבול את הדגימות בשרף בסיסי טהור למשך 2-4 ימים. במהלך שלב זה, העמידו את הדגימות בפני ואקום נמוך לפחות ארבע פעמים ביום למשך 15 דקות ולאחר מכן סיבוב.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. פילמור
הערה: תהליך הפילמור דורש תבניות פלסטיק של 1.2 מ"ל, שרף בסיסי והקשחה (ראו טבלת חומרים לפרטי הערכה המסחרית).
<ol><li>ערבבו 15 מ"ל של פתרון A (שלב 4.1) עם 1 מ"ל של הקשחה בכוס עם סיבוב למשך 2 דקות כדי לייצר את פתרון הפילמור (פתרון B).</li>
	<li>שים 1.2 מ"ל של תמיסת הפילמור (פתרון B) בתבניות פלסטיק. באמצעות פיק עץ, העבירו את דגימות העלים הנגעים משרף בסיסי טהור לתמיסה B (איור 2C). הימנע משימוש בפינצטה מכיוון שהם עלולים לגרום לריסוק רקמות.</li>
	<li>הקפידו לכוון במהירות דגימות עלים בניצב לתבניות הפלסטיק, שכן פתרון B הופך במהירות לצמיג תוך 5 דקות. ניתן למקם יותר מדגימת עלה נגע אחת בתבנית אחת. הערה: מומלץ לתרגל את השלב הנ"ל מספר פעמים לפני הגשת בקשה לדוגמאות רבות. כאשר יש דגימות רבות, זמן הפילמור שונה בין התבניות והכיוון הניצב של דגימות העלים עשוי להיות קשה להשגה.</li>
	<li>כאשר הכיוון הניצב של דגימות העלים מושג, המתן 30 דקות, ולאחר מכן העבר את תבנית הפלסטיק לתא פלסטיק או זכוכית המכיל ג'ל סיליקה כדי למנוע לחות. המתן 2-3 שעות לפילול.</li>
	<li>לאחר שהשרף ודגימת העלים עוברים פולימר לאחר התקופה של 2-3 שעות, נתקו את הגוש שנוצר מתבנית הפלסטיק על ידי שיוף בסיס הבלוק עם קובץ שיוף. לאחר מכן, הדביקו את הבלוק לחתיכת עץ (איור 2D).</li>
</ol>6. חתך
<ol><li>באמצעות מיקרוטום סיבובי המצויד בלהבי פלדה בקוטר 8 ס"מ (איור 2E), חתכו את הבלוק למקטעים בעובי 5 מיקרומטר. הניחו את החלקים על מגלשות זכוכית מכוסות במים מזוקקים. העבר את המגלשות עם החלקים הצפים מעל המים לצלחת חמה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי לייבש ולקדם את ההדבקה של החלקים למגלשות הזכוכית.</li>
	<li>לאחר הייבוש (איור 2F), סמן את שקופיות הזכוכית בשם ההפניה לבלוק ובמספר השקופית.</li>
</ol>7. תהליך צביעה כפול
<ol><li>כסו את החלקים עם 2 מ"ל של 5% כותנה כחולה בלקטופנול (40% גליצרול, 20% פנול ו-20% חומצה לקטית במים) וחממו אותם על צלחת חמה ב-45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (איור 3A).</li>
	<li>הסירו את הצבע העודף על ידי שטיפת המגלשה שלוש פעמים בכוס מלאה במים מזוקקים (איור 3B-D).</li>
	<li>כתם עם 2 מ"ל של 0.01% רותניום אדום במים למשך דקה אחת (איור 3E).</li>
	<li>הסירו את הצבע העודף על ידי שטיפת המגלשה שלוש פעמים בכוס מלאה במים מזוקקים (איור 3F,G).</li>
	<li>שים טיפה של מים מזוקקים על החלקים וכסה את החלקים עם כיסוי 24 מ"מ x 60 מ"מ לביצוע ניתוח מיקרוסקופיה קלה.</li>
</ol>

<ol><li>deBary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+development+of+some+parasitic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Natural+Sciences.+Botany+and+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Research on the development of some parasitic fungi.</a> Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5(1863).</li>
<li>Mangin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+Peronospores%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Natural+History+Society+of+Autun%22%5BJournal%5D)">Research on the Peronospores.</a> Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).</li>
<li>Underwood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+cell+wall%3A+a+dynamic+barrier+against+pathogen+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).</li>
<li>Hückelhoven, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall-associated+mechanisms+of+disease+resistance+and+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility.</a> Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).</li>
<li>Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Callose-mediated+resistance+to+pathogenic+intruders+in+plant+defense-related+papillae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).</li>
<li>Chowdhury, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+accumulation+of+callose%2C+arabinoxylan+and+cellulose+in+nonpenetrated+versus+penetrated+papillae+on+leaves+of+barley+infected+with+Blumeria+graminis+f.+sp.+Hordei%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei.</a> New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).</li>
<li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).</li>
<li>Caffall, K. H., Mohnen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function%2C+and+biosynthesis+of+plant+cell+wall+pectic+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).</li>
<li>Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarpita%2C+NC+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Plants.%2C+2nd+Edition%22">Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition</a>. , Wiley Blackwell. New York. 45(2015).</li>
<li>Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+esterification+of+pectin+plays+a+role+during+plant-pathogen+interactions+and+affects+plant+resistance+to+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases.</a> Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).</li>
<li>Lionetti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectoplate%3A+the+simultaneous+phenotyping+of+pectin+methylesterases%2C+pectinases%2C+and+oligogalacturonides+in+plants+during+biotic+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses.</a> Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).</li>
<li>Lionetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+pectin+methylesterase+inhibitors+protect+cell+wall+integrity+for+Arabidopsis+immunity+to+Botrytis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis.</a> Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).</li>
<li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haustorium+sheath+formation+in+cowpea+leaves+immune+to+rust+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection.</a> Phytopathology. 61, 383-388 (1971).</li>
<li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee+resistance+to+the+main+diseases%3A+leaf+rust+and+coffee+berry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease.</a> Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).</li>
<li>An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+effects+on+root+cell+wall+composition+and+ion+contents+in+two+soybean+cultivars+under+salinity+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress.</a> Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).</li>
<li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugarcane+smut%3A+shedding+light+on+the+development+of+the+whip-shaped+sorus%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus.</a> Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).</li>
<li>Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytes+versus+biotrophic+and+necrotrophic+pathogens-are+fungal+lifestyles+evolutionarily+stable+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Diversity%22%5BJournal%5D)">Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits.</a> Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).</li>
<li>Avelino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coffee+rust+crises+in+Colombia+and+Central+America+%282008-2013%29%3A+impacts%2C+plausible+causes+and+proposed+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Security%22%5BJournal%5D)">The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions.</a> Food Security. 7, 303-321 (2015).</li>
<li>Zambolim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+management+of+coffee+leaf+rust+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Current status and management of coffee leaf rust in Brazil.</a> Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).</li>
<li>Swiderska-Burek, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytopathogenic+Cercosporoidfungi-from+taxonomy+to+modern+biochemistry+and+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555(2020).</li>
<li>Andrade, C. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+process+and+defense+response+of+two+distinct+symptoms+of+Cercospora+leaf+spot+in+coffee+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytoparasitica%22%5BJournal%5D)">Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves.</a> Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).</li>
<li>Zambolim, L. Coffee tree diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZambolim%2C+L+%22Handbook+of+Phytopathology%3A+Diseases+of+cultivated+plants.+5th+ed%22">Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed</a>. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810(2016).</li>
<li>Castaño, A. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee+rust%5BTitle%5D)+AND+%22Informative+report+Cenicaf%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Coffee rust.</a> Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).</li>
<li>Echandi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee+rust%2C+caused+by+the+fungus+Cercospora+coffeicola%5BTitle%5D)+AND+%22Turrialba%22%5BJournal%5D)">Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola.</a> Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).</li>
<li>Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+process+of+Cercospora+coffeicola+on+coffee+leaf%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf.</a> Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).</li>
<li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil%5BTitle%5D)+AND+%22College+of+Agriculture%2C+Agricultural+Experiment+Station%22%5BJournal%5D)">The water-culture method for growing plants without soil.</a> College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347(1950).</li>
<li>Eskes, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Coffee+rust%3A+epidemiology%2C+resistance+and+management%22%5BJournal%5D)">Resistance.</a> Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171(1989).</li>
<li>Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+aspects+of+the+plant-rust+fungus+interface+during+the+compatible+interaction+Coffea+arabica+%28cv.+Caturra%29-Hemileia+vastatrix+%28race+III%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III).</a> International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).</li>
<li>Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+of+infection+and+colonization+of+Pseudocercospora+kaki+in+persimmon+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves.</a> Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).</li>
<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Principles+and+Techniques+of+Electron+Microscopy%3A+Biological+Applications%2C+Vol.+1%22">Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1</a>. , International Publishing. Berkeley Heights. 564(1981).</li>
<li>Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaiva%2C+EAS+%22Light+microscopy%3A+methods+and+protocols%22">Light microscopy: methods and protocols</a>. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).</li>
<li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+staining+technique+for+fungal-infected+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">New staining technique for fungal-infected plant tissues.</a> Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).</li>
<li>Schuller, A., Ludwig-Müller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+methods+to+detect+the+clubroot+pathogen+Plasmodiophora+brassicae+during+its+complex+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle.</a> Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).</li>
<li>Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+evidence+of+concomitant+sexual+and+asexual+reproduction+of+Elsino%C3%AB+ampelina+in+grapevine+under+subtropical+climate%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517(2020).</li>
<li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarques%2C+JPR+%22Manual+of+Techniques+Applied+to+Plant+Histopathology%22">Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology</a>. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140(2021).</li>
<li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).</li>
<li>Chesters, C. G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+methods+of+using+cotton+blue+as+a+mycological+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Three methods of using cotton blue as a mycological stain.</a> Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).</li>
<li>Macedo, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+of+Techniques+in+Plant+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22Feira+de+Santana%3A+State+University+of+Feira+de+Santana%22%5BJournal%5D)">Manual of Techniques in Plant Histology.</a> Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68(1997).</li>
<li>Lecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+lactophenol+cotton+blue+slide+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts.</a> Community Eye Health Journal. 12 (30), 24(1999).</li>
<li>Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+in+wool+dyeing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Society+of+Dyers+and+Colourists%22%5BJournal%5D)">Lactic acid in wool dyeing.</a> Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103(1895).</li>
<li>Chamberlain, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChamberlain%2C+CJ+%22Methods+in+Plant+Histology%22">Methods in Plant Histology</a>. , The University of Chicago Press. Chicago. 349(1932).</li>
<li>Sterling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal-structure+of+ruthenium+red+and+stereochemistry+of+its+pectin+stain%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain.</a> American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).</li>
<li>Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruthenium+red+and+violet.+1.+Chemistry%2C+purification%2C+methods+of+use+for+electron+microscopy+and+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action.</a> The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).</li>
<li>Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuckeridge%2C+MS+%22Plant+Physiology%22">Plant Physiology</a>. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

העבודה הנוכחית מציגה בדיקה היסטוכימית חלופית עם כתמים כפולים כדי לחקור את הרכב הפקטין של דפנות התאים, המתמצת את האוסטוריה במערכת פאתוסיסטית ביוטרופית. המטרה היא גם להדגים את היעילות של השיטה לאיתור פטרייה נקרוטרופית ושינויים בדופן התא המושרים על ידה. כאן, פקטין של דפנות תא פרנכימה קפה יכול לתמצת הן את הצוואר והן את האוסטוריום של פטריית החלודה Hemileia vastatrix. סילבה ואחרים תיארו גם את האנקפסולציה על ידי תאית וקלוז במערכת הקפה-H. vastatrix pathosystem 14,29<sup class=...

מנגנוני ההגנה על דופן התא בצמחים חיוניים לריסון זיהום פטרייתי. מחקרים דיווחו על שינויים בעובי ובהרכב דופן התא מאז המאהה-19, 1,2. שינויים אלה יכולים להיות מושרים על ידי פתוגן פטרייתי המעורר את היווצרותה של פפילה, אשר מונעת מפטריות להיכנס לתא או יכול לשמש כדי לתמצת את hyphae כדי לבודד את התא המארח protoplast מן haustoria פטרייתי. ייצור מחסום דופן תא דינמי (כלומר, פפילה והאוסטוריום עטוף במלואו) חשוב כדי לקדם את עמידות הצמח3. מחקרים היסטופתולוגיים על מחלות הקשורות לפטריות חקרו את התרחשותם של מנגנונים אלה ותיארו את הפולימרים של דופן התא, תאית, המיצלולוז (ארבינוקסילנים) ויבלות כמנגנוני התנגדות להתקפה פטרייתית 4,5,6,7.
דופן התא היא המחסום הראשון מפני התקפה מיקרואורגניזמית, הפוגעת באינטראקציה בין צמחים לפטריות. פוליסכרידים פקטיים מרכיבים את דופן התא ומהווים כ-30% מהרכב דופן התא בתאים ראשוניים של צמחי אאודיקוט שבהם הומוגלקטורונאנים הם הפולימר הנפוץ ביותר (בערך 60%)8. הגולגי מפריש תרכובות פקטין מורכבות המרכיבות את שרשראות החומצה הגלקטורונית, אשר עשויות או לא יכולות להיות מתילציה 8,9. מאז 2012, הספרות הצביעה על כך שמידת הפקטין מתיל אסטריפיקציה היא קריטית לקביעת התאימות במהלך ההדבקה על ידי אנזימים פקטיים מיקרוביאליים 10,11,12. לפיכך, פרוטוקולים נדרשים כדי לאמת את נוכחותם והפצתם של תרכובות פקטיות במערכות פאתוסיסטמיות פטרייתיות צמחיות.
טכניקות שונות שימשו כדי לזהות את האנקפסולציה של papillae או haustoria. שיטות הייחוס בהן נעשה שימוש הן מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) של רקמות קבועות ומיקרוסקופיה קלה של רקמות חיות וקבועות. בנוגע ל-TEM, מספר מחקרים הדגימו את התפקיד המבני של ניצני דופן התא בהתנגדות פטרייתית 13,14,15,16, וכי השימוש בלקטינים ונוגדנים הוא שיטה מורכבת לאיתור פולימרים של פחמימות 16. עם זאת, מחקרים מראים כי מיקרוסקופיית אור היא גישה חשובה וכי הכלים ההיסטוכימיים והאימונוהיסטוכימיים מאפשרים הבנה טובה יותר של הרכב מעטפת הפפילה וההאוזטוריום 6,7.
פטריות פתוגניות מראות שני סוגים עיקריים של אורחות חיים: ביוטרופיים ונקרוטרופיים. פטריות ביוטרופיות תלויות בתאים חיים לצורך תזונתן ואילו פטריות נקרוטרופיות הורגות את התאים המארחים, ואז חיות ברקמות המתות17. באמריקה הלטינית, חלודה של עלי קפה, הנגרמת על ידי הפטרייה Hemileia vastatrix, היא מחלה חשובה בגידולי קפה18,19. Hemileia vastatrix מציגה התנהגות ביוטרופית, ובין השינויים המבניים שנצפו במיני קפה עמידים או בתרבויות, דווח על תגובת רגישות יתר, תצהיר של קאלוז, תאית וליגנין על דפנות התא, כמו גם היפרטרופיה של תאים14. למיטב ידיעת המחברים, הספרות אינה מדווחת על מידע על חשיבותו של פקטין בעמידות לחלודה בקפה. מצד שני, פטריות נקרוטרופיות הגורמות לצרקוספוריוזיס מכוונות לפקטין באמצעות קבוצה של אנזימים הקשורים לפירוק דופן התא, כגון פקטינזות ופוליגלקטורונאז20. סרקוספוריוזיס בקפה, הנגרמת על ידי הפטרייה Cercospora coffeicola הוא גם איום גדול על גידולי קפה21,22. פטרייה זו גורמת לנגעים נמקיים הן בעלים והן בפירות יער. לאחר החדירה, C. coffeicola מיישב רקמות צמחים דרך מסלולים תוך תאיים ובין תאיים 23,24,25.
הפרוטוקול הנוכחי חוקר את הימצאותם של מבנים פטרייתיים ופקטין על דפנות התא. פרוטוקול זה שימושי כדי לזהות את התגובה הצמחית הקשורה לפקטין (מוכתם בצבע אדום רותניום, שהוא ספציפי לקבוצות חומציות של חומצות פוליאוריוניות של פקטין), המושרה על ידי המארח באינטראקציה ביוטרופית עם פטרייה. זה גם עוזר לאמת את ההשפעה של פטריות necrotrophic על התדרדרות של דפנות התאים pectic. התוצאות הנוכחיות מצביעות על כך ששיטת ההכתמה הכפולה יעילה להבחנה בין מבנים ולשלב הרבייה של פטריות.

<table><tbody><tr><td>להבים DB80 HS</td><td>Leica</td><td>14035838383</td><td>חיתוך</td></tr><tr><td>מאגר קקודילאט</td><td>EMS</td><td># 11652</td><td>קיבוע</td></tr><tr><td>כותנה כחול לקטופנול</td><td>Metaqu&iacute; נציץ</td><td>70SOLSIG024629</td><td>מכתים</td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>EMS</td> <td>#15712</td><td>קיבוע</td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד</td><td>EMS</td> <td>#16216</td><td>קיבוע</td></tr><tr><td>Historesin Kit</td><td>Technovit /EMS #</td><td>14653</td><td>Historesin להטמעת</td></tr><tr><td>פלטה חמה</td><td>Dubesser</td><td>SSCD25X30-110V</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה</td> מכתים <td>Zeiss</td><td>#490040-0030-000</td><td>לכידת תמונות</td></tr><tr><td>Microtome (Leica RM 2540)</td><td>Leica</td><td>149BIO000C1 חיתוך 14050238005</td><td></td></tr><tr><td>מגש דפוס פלסטיק</td><td>EMS</td><td>10176-30</td><td>מכתים</td></tr><tr><td>רותניום אדום</td><td>LABHouse</td><td>#006004</td> תוכנת <td>צביעה</td></tr><tr><td>Axion Vision</td><td>Zeiss</td><td>#410130-0909-000</td><td>לכידת תמונה</td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>Prismatec</td><td>131 TIPO 2 V.C.</td><td>קיבוע</td></tr></tbody></table>

שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

תאי הצמח משתמשים במנגנונים מבניים שונים, מכוננים או בלתי ניתנים להשראה, כדי להגן על עצמם מפני זיהום פטרייתי. אנקפסולציה היא מנגנון אינדוקטיבי יעיל לבודד את האוסטוריה הפטרייתית מהפרוטופלסט של תאי הצמח. לעומת זאת, פקטין, אחד המרכיבים הפולימריים של דופן התא, הוא מטרה של מספר אנזימים פקטוליטיים באינטראקציות נקרוטרופיות. כאן מוצג פרוטוקול לאיתור פקטין ופטריות באמצעות מיקרוסקופיה אופטית. נחקרים האנקפסולציה העשירה בפקטין בתאי עלי הקפה הנגועים בפטריית החלודה Hemileia vastatrix ובשינוי דופן תא המזופיל המושרה על ידי Cercospora coffeicola . דגימות העלים הנגעים תוקנו בתמיסת קרנובסקי, התייבשו והוטמעו בגליקון מתקרילט למשך 2-4 ימים. כל השלבים בוצעו על ידי שאיבת ואקום כדי להסיר אוויר בחללים הבין-תאיים ולשפר את תהליך ההטבעה. הבלוקים המשובצים חולקו למקטעים בעובי 5-7 מיקרומטר, שהופקדו על מגלשת זכוכית מכוסה במים ולאחר מכן חוממו בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, המגלשות הוכתמו פעמיים עם 5% כותנה כחולה בלקטופנול כדי לזהות את הפטרייה ו-0.05% רותניום אדום במים כדי לזהות פקטין (קבוצות חומציות של חומצות פוליאוריות של פקטין). האוסטוריה פטרייתית של Hemileia vastatrix נמצאה עטופה בפקטין. בקפה סרקוספוריוזיס, תאי מזופיל הפגינו התמוססות של דפנות התא, ונצפו הרפיות וקונידיופורים בין-תאיים. השיטה המוצגת כאן יעילה לזיהוי תגובה הקשורה לפקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות.

צביעת הלקטופנול הכחולה מכותנה על החלק המשובץ ב-GMA חשפה את נוכחותם של מספר מבנים פטרייתיים בין תאי מזופיל קפה ובתוךיהם באינטראקציות פטרייתיות ביוטרופיות ונקרוטרופיות.
במערכת הפתוסית הביוטרופית, כאשר היא מוכתמת בשיטת ההכתמה הכפולה, Hemileia vastatrix hyphae המכילה את דפנות התא ואת תכולת הפרוטופלסט הצפופה מופיעה בכחול כהה הן בפרנכימה ספוגית והן בפרנכימה פליסיידית (איור 4A,B). גם תא האם של האוסטוריום (Hmc) וההאוזטוריה מפגינים צבע כחול כהה חז...

פרוטוקול זה מתאר שיטה מיקרוסקופית לזיהוי פקטין באינטראקציה בין פטריית קפה.

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר לזהות את האינטראקציה בין הצמח לפטריה. בנוסף לצביעת הפקטין, הוא גם מדגים פגמים בפולימר דופן תא הפתוגן ומאפשר זיהוי של מבני פטריות. טכניקה פשוטה ולא מסובכת זו יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ אור והיא אינה דורשת ציוד יקר כגון מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.בנוסף, זוהי טכניקה מהירה המקבלת הבחנה מצוינת של מבני צמחים למחקרים היסטופתולוגיים. הטכניקה מזהה את האינטראקציה בין צמח לפטריה. לפיכך, הוא משתף פעולה כדי לאבחן את המחלות הנגרמות על ידי פטריות ביוטרופיות ונקרוטרופיות כגון חלודה קפה וסרקוספוריוזיס.כדי להתחיל, לקצור כ 10 מילימטר מרובע עלה דגימה באזור האמצעי של הנגע באמצעות אזמל פינצטה, ולטבול אותו 30 מיליליטר של תמיסה מקבעת Karnovsky. הכפיפו את דגימת העלה לוואקום נמוך של 500 עד 600 מילבר למשך 15 דקות באמצעות משאבת שמן, לפחות פי ארבעה כדי להגדיל את החדירות של התמיסה המקבעת ברקמת העלה. לאחר הקיבוע, שטפו את דגימת העלים שלוש פעמים ב-0.5 מ' חיץ קקודילט מדולל במים מזוקקים במשך חמש דקות כל אחת, ולאחר מכן העבירו אותה לסדרה אתנולית מדורגת למשך 15 דקות בכל ריכוז אתנול.כדי להעביר בהדרגה את הדגימות לגליקול מתקרילט, צרו את תמיסה A על ידי ערבוב גרם אחד של אבקת גליקול מתקרילט עם 100 מיליליטרים של שרף בסיסי תחת תסיסה מגנטית. לאחר מכן, טבלו את הדגימות ביחס אחד עד שניים של פתרון A ו-100% אתנול למשך שלוש שעות. טבלו את הדגימות ביחס אחד לאחד עבור פתרון A:100%אתנול למשך שלוש שעות, ולאחר מכן שקעו בשרף בסיסי טהור למשך יומיים עד ארבעה ימים.הכפיפו את הדגימה לשואב ואקום נמוך לפחות ארבע פעמים ביום למשך 15 דקות, ולאחר מכן סיבוב. יש לערבב 15 מיליליטרים של תמיסה A עם מיליליטר אחד של המתקשה בכוס עם סיבוב במשך שתי דקות כדי לייצר את פתרון הפילמור B.Put 1.2 מיליליטרים של פתרון פילמור זה B בתבניות פלסטיק. באמצעות פיק עץ, העבירו את דגימות העלים הנגעים משרף בסיסי טהור לפתרון B והימנעו משימוש בפינצטה מכיוון שהן עלולות לגרום לריסוק רקמות.הקפידו לכוון במהירות דגימות עלים בניצב לתבניות הפלסטיק מכיוון שפתרון B הופך במהירות לצמיג. כאשר הכיוון הניצב של דגימות העלים מושג, יש להמתין 30 דקות ולאחר מכן להעביר את תבנית הפלסטיק לתא פלסטיק או זכוכית המכיל ג'ל סיליקה כדי למנוע לחות. לאחר שהשרף ודגימת העלים עוברים פולימר לאחר שעתיים עד שלוש שעות, נתקו את הגוש שנוצר מתבנית הפלסטיק על ידי שיוף בסיס הבלוק בקובץ שיוף.לאחר מכן, הדביקו את הבלוק לחתיכת עץ. חותכים את הבלוק לחמישה חלקים בעובי מיקרומטר באמצעות מיקרוטום מסתובב המצויד בלהבי פלדה בקוטר שמונה סנטימטרים. הניחו את החלקים על מגלשות זכוכית מכוסות במים מזוקקים.לאחר מכן, העבירו את המגלשות לצלחת חמה כדי להתייבש בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס וקדמו את ההדבקה של החלקים לשקופיות הזכוכית. לאחר הייבוש, סמן את שקופיות הזכוכית בשם הפניה לבלוק ובמספר השקופית. מכסים את החלקים בשני מיליליטרים של 5% כותנה כחולה בלקטופנול ומחממים אותם על צלחת חמה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.מסירים את הצבע העודף על ידי שטיפת המגלשה שלוש פעמים בכוס מלאה במים מזוקקים. הכתימו אותו בשני מיליליטרים של 0.01%רותניום אדום במים למשך דקה אחת. מסירים את הצבע העודף על ידי שטיפת המגלשה שלוש פעמים בכוס מלאה במים מזוקקים.הניחו טיפת מים מזוקקים על החלקים וכיסו את החלקים בהחלקת כיסוי לביצוע ניתוח מיקרוסקופיה קלה. בשיטת ההכתמה הכפולה, Hemileia vastatrix hyphae המכילה את דפנות התאים ואת תכולת הפרוטופלסטים הצפופים נראתה כחולה כהה הן בפרנכימה ספוגית והן בפרנכימה פליסיידית. תא האם של האוסטוריום וההאוזטוריה הפגינו גם הם בצבע כחול כהה.הכתם הנגדי באדום רותניום הגדיר בבירור את ההתפלגות הפטרייתית בחללים הבין-תאיים. במהלך האינטראקציה, תא האם של Hemileia vastatrix haustorium שבר את דופן התא המארח ופיתח צוואר האוסטוריאלי מוקף בתרכובות פקטיות. אנקפסולציה עשירה בפקטין בצבע ורוד-אדום של הצוואר ההוסטוריאלי אינה יכולה למנוע היווצרות האוסטוריאלית.במקרים מסוימים, האנקפסולציה העשירה בפקטין עטפה את האוסטוריום באופן חלקי. ובמקרים מסוימים, האוסטוריום עטוף במלואו. דופן התא העשירה בפקטין שומרת על שלמות גבול הנגע, שם הפטרייה אינה נוכחת.שיטת ההכתמה הכפולה הדגימה את נוכחותם של תפרים בין-תאיים. באזורי אינטראקציה, נראה כי דפנות תאי פקטין איבדו את שלמותם עקב פירוק. מבני רבייה כגון קונידיה נמצאו באפידרמיס הא-אקסיאלי.Cercospora coffeicola hyphae נמצאו בתא התת-סטומי כמבנים מסתלסלים, ונראה כי הפרנכימה הפליסיידית באזור הנגע עוברת ליזיס של דופן התא. הימנע משימוש בפינצטה מכיוון שהם עלולים לגרום לריסוק רקמות. מחקרים היסטופתולוגיים נוספים על חלודה, אנתרקנוז, סרקוספוריוזיס, סמוטציות ואינטראקציות ביוטרופיות, המיביוטרופיות ונקרוטרופיות אחרות בין צמחים לפטריות צריכים להתבצע כדי לחקור את השימוש הפוטנציאלי בטכניקה זו במערכות פאתוסיסטיות שונות.

double-staining-method-to-detect-pectin-in-plant-fungus-interaction

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים שיטת צביעה כפולה באמצעות אדום רותניום וכחול כותנה לקטופנול כדי להמחיש פקטין וכיטין במהלך אינטראקציות צמחיות-פטרייתיות בצמח חלודת קפה. ההליך מסייע להבין את מנגנוני ההגנה של צמחים במהלך זיהומים פטרייתיים.

שיטת צביעה כפולה: טכניקה להמחשת אינטראקציות צמחים-פטריות באמצעות אדום רותניום וכותנה כחולה לקטופנול

סרטון זה מתאר שיטה לגידול וניתוח איכותי של ביופילמים חיידקיים על קורים פטרייתיים באמצעות מיקרוסקופיה. ביופילמים חיידקיים נוצרים לעתים קרובות על משטחים פטרייתיים וכוללים תהליכי אינטראקציה חיידקיים-פטרייתיים רבים, כגון שיתוף פעולה מטבולי, תחרות או טריפה.

שיטה להכנת דגימות כדי לדמיין חיידקים יוצרי ביופילם על קורים פטרייתיים

סרטון זה מדגים טכניקת צביעה חיסונית ללוקליזציה של חלבוני אראבינוגלקטן (AGPs) ופקטין ברקמות צמחים. חלקי רקמת צמח קבועים ומשובצים שרף מוכתמים בנוגדנים ראשוניים ומשניים פלואורסצנטיים ספציפיים ל-AGP ופקטין ובצבע פלואורסצנטי קושר תאית כדי לחשוף את הקולוקליזציה הספציפית לרקמה שלהם בדופן התא.

אימונולוקליזציה של חלבונים Arabinogalactan ו Pectins ברקמת הצמח

הרכב דופן התא של הצמח משתנה בין סוגי הרקמות ויכול לכלול ליגנין, תאית, המיצלולוז ופקטין. טכניקות צביעה שונות פותחו כדי להמחיש הבדלים ברמת סוג התא. מאמר זה הוא אוסף של טכניקות צביעת דופן תאים נפוצות.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

צבעי פלורסנט חיוניים הם כלים חיוניים לניתוח הדמיה של תא חי בביולוגיה מודרנית של תאים פטרייתיים. נייר זה מפרט את היישום של צבעי פלורסנט ידוע פחות ידועים עבור מעקב הדינמיקה קרום הפלזמה, אנדו-/אקסוציטוזה וקיר התא מורגנזה בפטריות filamentous.

יישום של ממברנה וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית עבור הדמיה בשידור חי התא של פטריות Filamentous

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד החומר הצמחי לאימונולוקליזציה של חלבונים ופקטינים ערבינוגלקטניים קבוע, מוטבע בשרף אקרילי הידרופילי, חתוכה ומורכבת על מגלשות זכוכית. אנו מראים אפיטופים הקשורים לקיר התא יזוהו עם נוגדנים ספציפיים.

אימונולוקליזציה פלואורסצנטית של חלבונים ערבינוגלקטניים ופקטינים בחומת התא של רקמות הצמח

הפרוטוקול כאן מתאר את השיטות להערכת דפוסי ההתיישבות המיקוריזאלית הארבוסקולרית והאסטרטגיה בשורשים לשני מינים: Zea mays ו-Festuca rubra. השימוש בשיטת MycoPatt מאפשר חישוב פרמטרים, המרה של מבנים מיקוריזאליים לנתונים דיגיטליים ומיפוי מיקומם האמיתי בשורשים.

מפות מיקוריזאליות ככלי לחקור דפוסי התיישבות ואסטרטגיות פטרייתיות בשורשים של Festuca rubra ו - Zea mays

פרוטוקול זה נועד לספק נהלים מפורטים לאיסוף, תיקון ותחזוקה של דגימות צמחים מיקוהטרוטרופיים, תוך יישום טכניקות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת והולכה, מיקרוסקופיית אור, קונפוקלית ופלואורסצנטית כדי לחקור התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים ובזרעים שנבטו בפטריות מיקוריזאליות.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

בשל האטימות של האדמה, לא ניתן לדמיין בקלות אינטראקציות בין המיקרובים המרכיבים אותה עם רזולוציה תאית. כאן מוצגים שני כלים מיקרופלואידיים, המציעים הזדמנויות חדשות לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות. המכשירים הם רב-תכליתיים ופשוטים לשימוש, ומאפשרים שליטה מרחבית-טמפורלית גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית.

כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

המאמר הנוכחי נועד לספק פרוטוקולים מפורטים ונאותים לבידוד פטריות אנדופיטיות הקשורות לצמחים, שימור ארוך טווח של מבודדים, אפיון מורפולוגי ומיצוי DNA כולל לצורך זיהוי מולקולרי וניתוחים מטאגנומיים לאחר מכן.

בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

דוח זה מתאר את השיטות הבסיסיות המשמשות לתרבית ולמניפולציה ניסויית של אצת הסטרפטופיטים החד-תאית, Penium margaritaceum. הוא גם מספק פרוטוקולים בסיסיים של הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה, כולל תיוג תאים חיים עם נוגדנים חד-שבטיים ובדיקות פלואורסצנטיות אחרות ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

פרוטוקולי סינון ניסיוניים, אימונוציטוכימיה וטכניקות הדמיה מבוססות מיקרוסקופיה עבור Penium margaritaceum

למדו שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות באמצעות מיקרוסקופיית אור. טכניקה זו מאפשרת הדמיית מבנים פטרייתיים וליקויים בפולימרי דופן התא של הפתוגן ללא ציוד יקר.

שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות

גלה סרטונים נוספים