Name: מיפוי העברת אנרגיית תהודה של Förster: מתודולוגיה חדשה להבהרת תכונות מבניות גלובליות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: למד מתודולוגיית מיפוי FRET לזיהוי אתרי קישור ליגנדים ושינויים קונפורמציוניים בחלבונים. השיטה מאפשרת מעקב אחר תנועות דינמיות במערכות ביומולקולריות בתמיסה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק R15GM135904 של המכונים הלאומיים לבריאות (הוענק ל- IM) ומענק המכונים הלאומיים לבריאות GM110552 (הוענק ל- DBO).

למחברים אין מה לחשוף.

באמצעות שימוש במתודולוגיית המיפוי של FRET, זיהינו את אתר קשירת רצף האותות בחלבון SecA. חשוב לציין שנוכחותו של מבנה גבישי תלת-ממדי של המתחם הקלה מאוד על המחקר שלנו. כוחה של מתודולוגיית מיפוי זו טמון ביכולת להשתמש במבנה קיים כדי לזהות מיקומים לתיוג. לא ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לקבוע מבנה תלת-ממדי; עם זאת, קביעת אלמנטים מבניים56, חידוד מבנה קיים49, קביעת מיקום אתר מחייב 2,32, או הבהרת תנועה דינמית<sup class="xref...

עבור חלבונים, הבהרת הדינמיקה יחד עם ידע מבני תלת-ממדי (תלת-ממדי) מובילה להבנה משופרת של יחסי מבנה-תפקוד של מערכות ביו-מולקולריות. שיטות מבניות, כגון קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית, לוכדות מבנה סטטי ולעתים קרובות דורשות קביעת מבנים מרובים כדי להבהיר היבטים של קשירת ביו-מולקולציה ודינמיקה1. מאמר זה דן בשיטה מבוססת פתרון למיפוי אלמנטים מבניים גלובליים, כגון אתרי קשירה או אינטראקציות איגוד, שעשויים להיות ארעיים יותר ופחות קלים ללכידה בשיטות סטטיות. מערכות מועמדות חזקות למתודולוגיה זו הן כאלה שבהן מבנה תלת-ממדי נקבע בעבר על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, ספקטרוסקופיה של NMR או שיטות מבניות אחרות. במקרה זה, אנו מנצלים את המבנה הגבישי של קרני הרנטגן של קומפלקס SecA-SecYEG, שחקן מרכזי במסלול ההפרשה הכללי של חלבונים, כדי למפות את מיקומו של אתר קשירת פפטידי אותות באמצעות העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) לפני הובלת הפרפרוטאין על פני הממברנה2. מניפולציה של המערכת הביולוגית באמצעות שינויים גנטיים יחד עם הידע שלנו על המבנה התלת-ממדי אפשרו את קביעת הקונפורמציה של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם מיד לפני ההחדרה לערוץ 3.
FRET כולל העברה נטולת קרינה של אנרגיה ממולקולה אחת (תורם) לאחרת (מקבל) באופן תלוי מרחק שנמצא דרך חלל 4,5. היעילות של העברה זו מנוטרת באמצעות ירידה בתורם או עלייה בעוצמת הפלואורסצנציה של המקבלים. ניתן לתאר את היעילות של העברת אנרגיה כ
E = R06/(R06 + R6)
שבו ערך R0 הוא המרחק שבו ההעברה יעילה ב-50%6. הטכניקה תוארה בעבר כשליט מולקולרי והיא יעילה בקביעת מרחקים בטווח של 2.5-12 ננומטר, בהתאם לזהותם של צבעי התורם-מקבל 4,7,8,9. עוצמות הפלואורסצנציה של התורם ואורך החיים עם או בלי מקבל מאפשרים קביעת יעילות ההעברה וכתוצאה מכך, מרחקים 5,8. בשל זמינות הטכנולוגיה, רגישות השיטה וקלות השימוש, FRET מצאה יישום רחב גם בתחומים כגון ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת ומיקרוסקופיה קונפוקלית6. הופעתם של חלבונים פלואורסצנטיים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק הפכה את התצפית על דינמיקה תוך-תאית והדמיה של תאים חיים לקלה יחסיתל-10,11. יישומי FRET רבים כגון אלה נדונים בפירוט בנושא וירטואלי זה.
במחקר זה, אנו מתמקדים במיוחד בשימוש במדידות FRET כדי להניב ערכי מרחק כדי לקבוע פרטים מבניים. בעבר, נעשה שימוש יעיל במדידות FRET כדי לקבוע את הקונפורמציה של מולקולות דנ"א כאשר הן קשורות לחלבון 12,13,14, לדינמיקה הפנימית של חלבונים ולאינטראקציות קושרות חלבונים 15,16,17. היתרונות של שיטה זו טמונים ביכולת לקבוע אלמנטים מבניים גמישים ודינמיים בתמיסה עם כמויות נמוכות יחסית של חומר. באופן משמעותי, שיטה זו יעילה במיוחד כאשר משתמשים בה בשילוב עם מידע מבני קיים ואינה יכולה לשמש כאמצעי לקביעת מבנה תלת-ממדי. השיטה מספקת את התובנה הטובה ביותר ואת העידון של המבנה אם העבודה מתבססת על מידע מבני קיים שלעתים קרובות בשילוב עם סימולציה חישובית18,19. כאן מתואר השימוש במרחקים המתקבלים ממדידות FRET במצב יציב ובזמן לפתרון זמן כדי למפות אתר מחייב, שמיקומו לא היה ידוע, על מבנה קריסטלוגרפי קיים של קומפלקס SecA-SecYEG, חלבונים עיקריים במסלול ההפרשה הכללי3.
מסלול ההפרשה הכללי, מערכת שמורה מאוד, מפרוקריוטים דרך אאוקריוטים ועד ארכיאה, מתווך את העברת החלבונים לרוחב או לתוך הממברנה למיקומה התפקודי של התא. עבור חיידקים גראם-שליליים, כגון E. coli, האורגניזם ששימש במחקר שלנו, חלבונים מוחדרים לתוך הממברנה הפנימית או עוברים טרנסלוקציה על פני הממברנה הפנימית לפריפלסמה. קומפלקס תעלות ה-SecY החיידקי (המכונה טרנסלוקון) מתאם עם חלבונים אחרים כדי לבצע טרנסלוקציה של החלבון המסונתז החדש, המופנה למיקומו הנכון בתא באמצעות רצף אותות הממוקם בדרך כלל ב-N-terminus20,21. עבור חלבונים הקשורים לפריפלזמה, החלבון ATPase SecA מתחבר למנהרת היציאה של הריבוזום, ועם הפריפרוטאין לאחר שכ-100 שאריות תורגמו22. יחד עם חלבון המלווה של SecB, הוא שומר על הפרפרוטאין במצב של התגלגלות. SecA נקשר לטרנסלוקון SecYEG, ובאמצעות מחזורים רבים של הידרוליזה של ATP, מאפשר הובלת חלבונים על פני הממברנה23,24.
SecA הוא חלבון רב-תחומי שקיים בצורות ציטוזוליות וממברנה הקשורות לממברנה. החלבון ההומודימרי בציטוזול, SecA מורכב מתחום קשירת פרפרוטאין או קישור צולב25, שני תחומים קושרי נוקלאוטידים, תחום כנף סלילית, תחום פיגומים סליליים ושתי אצבעות סליל (THF)26,27,28,29 (איור 1). במחקרים קריסטלוגרפיים קודמים של קומפלקס SecA-SecYEG, מיקומו של ה-THF הציע כי הוא היה מעורב באופן פעיל בטרנסלוקציה של חלבונים וניסויים צולבים שלאחר מכן עם פפטיד האותות ביססו עוד יותר את המשמעות של אזור זה בטרנסלוקציה של חלבונים30,31. מחקרים קודמים, שהשתמשו במתודולוגיית המיפוי FRET, הראו כי פפטידי אותות אקסוגניים נקשרים לאזור זה של SecA 2,32. כדי להבין באופן מלא את הקונפורמציה והמיקום של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרה-פרוטאין לפני ההחדרה לתעלת SecYEG, נוצרה כימרה חלבונית שבה רצף האותות והשאריות של האזור הבוגר המוקדם חוברו ל-SecA באמצעות מקשר Ser-Gly (איור 1). באמצעות מבנה בר-קיימא ביולוגית זה, הוכח עוד יותר כי רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרפרוטאין נקשרים ל-THF באופן מקביל2. לאחר מכן, מתודולוגיית מיפוי FRET שימשה כדי להבהיר את הקונפורמציה והמיקום של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם בנוכחות SecYEG כמתואר להלן3.
הידע על המבנה התלת-ממדי של מתחם SecA-SecYEG 33,34,35 והמיקום האפשרי של אתר הכריכה אפשרו לנו למקם באופן שיפוטי תוויות תורמים-מקבלים במיקומים שבהם ההצטלבות של מרחקי FRET בודדים מזהה את מיקום אתר הכריכה. מדידות מיפוי FRET אלה גילו כי רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרפרוטאין יוצרים סיכת שיער עם הקצה הממוקם בפתחו של ערוץ SecYEG, מה שמדגים כי מבנה סיכות השיער מעוצב לפני החדרת התעלה.

<table><tbody><tr><td>490 ננומטר LED</td><td>לייזר Horiba</td><td>1684-LED</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco</td><td>DF0812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>A10254</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10904</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10906</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra&shy; 4 מסנן צנטריפוגלי (50kDa MWCO)</td><td>Sigma</td><td>UFC805008</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylmaltoside (DDM)</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>E. coli פפטיד אות פוספטאז אלקליין SP22</td><td>ביומולקולות המערב התיכון</td><td>N/A</td><td>פריט מותאם אישית מסונתז</td></tr><tr><td>פפטיד אות מורחב SP41</td><td>ביומולקולות המערב התיכון</td><td>N/A</td><td>פריט מותאם אישית מסונתז</td></tr><tr><td>FluorEssence</td><td>Horiba</td><td>גרסה 2.4</td><td>תוכנית רכישה ספקטרלית עבור ספקטרופלואורומטר פלואורומקס4 ספקטרופלואורומטר</td></tr><tr><td>פלואורומקס 4</td><td>Horiba</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlobalsWE</td><td>מעבדה לדינמיקה פלואורסצנטית, אוניברסיטת קליפורניה, תוכנית</td><td>ניתוח ספקטרלי אירווין</td><td></td> לדעיכות שנפתרו בזמן</tr><tr><td>H&shy; 4 וביישן; אזידו וביישן; ביישן; OH</td><td>BACHEM</td><td>4020250.0001</td><td></td></tr><tr><td>LB (מילר) מרק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP9723</td><td></td></tr><tr><td>Ludox HS-40 סיליקה קולואידית (40% משקל השעיה ב-H2O)</td>יש צורך בדילול <td>420816 של סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>כדי ליצור פתרון פיזור נכון</td></tr><tr><td>PTI Felix GX</td><td>Horiba</td><td>גרסה 4.1.0.4096</td><td>תוכנית רכישה ספקטרלית עבור PTI Time Master Instrument</td></tr><tr><td>PTI Time Master מכשיר</td><td>Horiba</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pymol תוכנית גרפיקה מולקולרית</td><td>Schrodinger</td><td>גרסה 2.4</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>Thermo Scientific</td><td>NESLAB RTE 10</td><td></td></tr></tbody></table>

מיפוי העברת אנרגיית תהודה של förster: מתודולוגיה חדשה להבהרת תכונות מבניות גלובליות

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) היא שיטה מבוססת פלואורסצנטיות מבוססת המשמשת למדידה מוצלחת של מרחקים בתוך ובין ביו-מולקולות במבחנה , כמו גם בתוך תאים. ב-FRET, היעילות של העברת אנרגיה, הנמדדת על ידי שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה או באורך החיים, מתייחסת למרחק בין שתי מולקולות או תוויות פלואורסצנטיות. קביעת דינמיקה ושינויים קונפורמיים מהמרחקים הם רק כמה דוגמאות ליישומים של שיטה זו למערכות ביולוגיות. בתנאים מסוימים, מתודולוגיה זו יכולה להוסיף ולשפר מבנים גבישיים קיימים של קרני רנטגן על ידי מתן מידע לגבי דינמיקה, גמישות והתאמה למשטחי קישור. אנו מתארים את השימוש ב-FRET ובקביעות מרחק נלוות כדי להבהיר תכונות מבניות, באמצעות זיהוי אתר איגוד או אוריינטציות של תת-יחידות דימר. באמצעות בחירה מושכלת של אתרי תיוג, ולעתים קרובות שימוש באסטרטגיות תיוג מרובות, יישמנו בהצלחה שיטות מיפוי אלה כדי לקבוע תכונות מבניות גלובליות בקומפלקס חלבון-DNA ובמערכת טרנסלוקציה של חלבונים SecA-SecYEG. במערכת SecA-SecYEG, השתמשנו בשיטות מיפוי FRET כדי לזהות את אתר קישור הפרה-פרוטאין ולקבוע את ההתאמה המקומית של אזור רצף האותות המאוגדים. מחקר זה מתאר את השלבים לביצוע מחקרי מיפוי FRET, כולל זיהוי אתרי תיוג מתאימים, דיון בתוויות אפשריות, כולל שאריות של חומצות אמינו שאינן מקומיות, הליכי תיוג, כיצד לבצע מדידות ופירוש הנתונים.

מחקר זה התמקד בקביעת המיקום של אתר קשירת הפרהפרוטאין ב- SecA לפני הכנסת הפרפרוטאין לערוץ SecYEG. כדי למפות את אתר הקשירה, ניסויי FRET בוצעו בין אזורים שונים של הפרפרוטאין ושלושה מיקומים נפרדים בחלבוני SecA ו-SecYEG (איור 1A-D). מהמרחקים שהתקבלו והמבנים התלת-ממדיים של SecA, SecYEG והפרפרוטאין, נחזה המיקום של אתר הקישור של פרפרוטאין. במקום להשתמש בשלוש ישויות נפרדות (SecA, SecYEG ופרפרוטאין) כדי לבצע מדידות אלה, רצף האותות של PhoA חובר ל-SecA באמצעות שינוי גנט...

המחקר מפרט את המתודולוגיה של מיפוי FRET כולל בחירת אתרי תיוג, בחירת צבעים, רכישה וניתוח נתונים. מתודולוגיה זו יעילה בקביעת אתרי קשירה, שינויים קונפורמיים ותנועות דינמיות במערכות חלבונים, והיא שימושית ביותר אם היא מבוצעת בשילוב עם מידע מבני תלת-ממדי קיים.

מיפוי העברת אנרגיית תהודה של Förster: מתודולוגיה חדשה להבהרת תכונות מבניות גלובליות

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

פיתחנו מתודולוגיית מיפוי FRET המאפשרת זיהוי ואפיון של אתרי קשירת ליגנד, אוריינטציה של תת-יחידות, שינויים קונפורמיים הקשורים לקשירת ליגנד ותנועות דינמיות של חלבונים. יתרון של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אותה בתמיסה והמולקולות יכולות לנוע בחופשיות. המרחקים הנמדדים בטכניקה זו מתאימים למערכות ביולוגיות.FRET ישים באופן נרחב למערכות רבות. מיפוי משפר את הניטור של שינויים מבניים ודינמיים בכל מערכת ביומולקולרית, והוא יעיל במיוחד אם קיים מידע מבני תלת מימדי. לאחר טיהור החלבון, החלק הקשה ביותר הוא תיוג ביעילות גבוהה, והסרת הצבע החופשי.עבור הניסויים, זה עוזר לקבל כמה שפחות צבע חופשי. כדי להתחיל, בחר אתרי תיוג בטווח של 25 עד 75 אנגסטרום מאתר הקשירה הענישתי, ובאזורים סטטיים יחסית של החלבון. המרחק יקבע את זוג צבעי ה-FRET הספציפי שישמש.אתר את אתרי הסימון באזורי חלבונים הנבדלים יחסית זה מזה. אז האתרים מתארים את הקודקודים של משולש, כאשר אתר הקשירה הענישתי ממוקם במרכז. כדי למדוד את ערכי ה-R0, בהתאם לגודל ולנפח הרצויים, הכינו שתי דגימות חלבון באותו ריכוז של סך החלבון.אחד עם החלבון המסומן בצבע התורם בלבד, ואחד עם החלבון המסומן בצבע המקבל בלבד. הפעל את הפלואורומטר ופתח את תוכנית הרכישה והניתוח הספקטרלית בתוכנת FluorEssence, אם אתה משתמש בספקטרופלואורומטר. לחץ על M האדום כדי לחבר את המחשב למכשיר ובחר ספקטרום פליטה.הזן פרמטרי סריקה באמצעות פריט תפריט הניסויים של האיסוף, כגון אורך גל של עירור, הטווח לסריקת פליטה, טמפרטורה ומדגם משנים את מיקומך. לחץ על RTC ועל הגדרות מכשיר אופטימליות כמתואר בכתב היד, על ידי ניטור פליטת הפלואורסצנציה בשיא באמצעות אורך גל עירור שנקבע במקסימום הקליטה של הצבע. הניחו את דגימת החלבון המסומנת על ידי התורם במחזיק הדגימה, ולחצו על Run כדי ליצור סריקת פליטה של החלבון המסומן בצבע התורם בלבד, על ידי הזזת הדגימה למקסימום ספיגת הצבעים, וסריקה מעל שיא הפליטה.קבעו קו בסיס לסריקה על ידי הארכת הסריקה ב-25 עד 50 ננומטר מעבר לסוף הפסגה. מדוד את התפוקה הקוונטית של החלבון התורם היחיד על ידי ביצוע ספיגות ומדידות פלואורסצנטיות על דגימות בריכוזים שונים, כמתואר בכתב היד של הטקסט. הכינו חלבון תורם בלבד, חלבון מקבל בלבד ודגימות חלבון המקבל-תורם, באותו ריכוז.קבל את התורם רק סריקה כדי ליצור ספקטרום פליטה פלואורסצנטית. להלהיב את התמיסה במקסימום ספיגת הצבעים של התורם, ולסרוק את שיאי הפליטה של התורם והמקבל. החלף את הדגימה בחלבון המקבל בלבד, או שנה את הדגימה שנה את מיקומך לקובט המכיל את החלבון המקבל בלבד.קבל סריקת פליטה של החלבון המסומן בצבע המקבל בלבד. לעורר את הדגימה באורך הגל של עירור התורם. החלף את הדגימה לדגימת החלבון המקבלת-תורם או שנה את הדגימה שנה את מיקומך ל-cuvette המכיל את החלבון המסומן על ידי התורם-מקבל.קבל סריקת פליטה של דגימת החלבון המקבלת-תורם באמצעות אותן הגדרות. עבור כל הספקטרום, תקן את הפלואורסצנציה ברקע על-ידי הפחתת ספירות הרקע שנמדדו בסוף הסריקה. השתמש בתוכנית צפייה גרפית תלת-ממדית כגון PyMOL כדי למפות את המרחקים למבנה, על-ידי הזנה ישירה של הפקודות מסקריפט ה- Script לחלון הפקודה עם מידע המרחק המתאים.צור מעטפת עבור כל מרחק שנמדד והשגיאה המשויכת. מפה את המיקום דרך ההצטלבות של הקונכיות השונות. אתר קשירת פפטיד האותות מופה באמצעות שלושה מיקומים שונים ב-SecA וב-SecYEG, וארבעה מיקומים שונים על פפטיד האות.ניסויי FRET בין אזורים שונים של הקדם-חלבון ושלושה מיקומים שונים בחלבוני SecA ו-SecYEG ממפים את האתר והכיוון של טרום-קשירת החלבון. אתר הקשירה הענישתי של פפטיד האות זוהה בעבר כאצבע בעלת שני הסלילים, וזנב ה-SecA C-terminal הציע כיוון מקביל לאצבע בעלת שני הסלילים. ספקטרום FRET במצב יציב בין SecA37, לבין PhoA2, ו- PhoA22, הושגו.ירידה בעוצמת התורם הצביעה על כך שאנרגיה גדולה יותר הועברה מ-PhoA22. יחסית לאתר PhoA2, שנמצא רחוק יותר מ- SecA37. ספקטרום דעיכה פלואורסצנטית שנפתר בזמן הראה כי לקומפלקס התורם-מקבל יש דעיכה הומוגנית קצרה יותר התואמת להעברת אנרגיה הקשורה למרחק אחד.פגזי מרחק FRET שנבנו בין שאריות SecA PhoA2, לבין האתרים המשולשים, הראו כי כל פגז מצטלב עם האצבע בעלת שני הסלילים, אתר הקשירה המשוער, המוצג בירוק. השטח המצטלב קטן יותר מכל מעטפת FRET וכולל תרומה גדולה מהפיגום הסלילי. פגזי מרחק FRET שנקבעו בין שאריות PhoA2 לבין האתרים המסומנים, מתארים שטח קטן יותר הממוקם קרוב יותר לקצה האצבע בעלת שני הסלילים ולפה של תעלת SecYEG.אזור מצטלב זה ממוקם בקצה הנגדי של אצבע שני הסלילים מ- PhoA2. דברים חשובים שיש לקחת בחשבון כוללים בחירה נכונה של אתרי הסימון כדי לשלש את תחום העניין, למדוד את התשואות הקוונטיות עבור כל אתר ולהסיר את כל הצבעים החופשיים. שיטה זו מתיישרת עם מידע מבני המתקבל בשיטות כמו NMR או קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן.כאשר מכניסים את תוצאות ה- FRET להקשר מבני זה יכול לשפר את המידע הקיים.

frster-resonance-energy-transfer-mapping-new-methodology-to-elucidate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

שילוב של שלוש קצר פעמו לייזר באורך גל יחיד משמש ליצור פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS) ומכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS). ההבדל בין אותות אלה מספק רגישות משופרת אחרת קשה לזהות אותות ראמאן קוהרנטית, המאפשר הדמיה של scatterers ראמאן חלש.

דיפרנציאל הדמיה של מבנים ביולוגיים עם פיזור כפליים-התהודה אנטי סטוקס קוהירנט ראמאן (CARS)

אנו מתארים כאן שיטת ההעברה השתפרה הארת תהודת אנרגיה (LRET) שבו אנחנו מציגים את אתר מחשוף פרוטאז בין אתרי fluorophore תורם acceptor. שינוי זה מאפשר לנו להשיג אותות LRET ספציפיים הנובעים מחלבונים קרום של עניין, המאפשרים המחקר של חלבונים בממברנה ללא טיהור חלבון.

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

אנו מציגים את הליך ההתקנה והניסוי להשגת נתוני smFRET מרשתות תורמים-מקבלות גדולות עם מיקרוסקופ TIRF. הניתוח שלב אחר שלב של מדידות אלו עם תוכנת ההסקה הבייסיאנית Fast-NPS מניב מידע מבני ברזולוציה גבוהה באמצעות יישום מודלים מותאמים של צבע.

מידע מבני מ-מולקולה בודדת סריג ניסויים באמצעות מערכת ננו-המיצוב המהירה

פרוטוקול דיוק גבוהה ניסויים FRET ברמת מולקולה אחת מוצגת כאן. בנוסף, מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי לזהות שלושה מצבי קונפורמציה בתחום ליגנד מחייב של קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDA). קביעת מרחקים מדויקים היא הצעד הראשון לקראת בניית מודלים מבניים המבוססים על ניסויים סריג.

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

מבנים של חלבון סופרא מולקולרית הרכבות ברזולוציה אטומית הם רלוונטיות גבוהה בשל התפקידים מכריע שלהם במגוון רחב של תופעות ביולוגיות. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה על הרכבות לא מסיסים, הבלתי גבישי החלבון macromolecular על-ידי קסם-זווית ספינינג ספקטרוסקופיה של מצב מוצק תהודה מגנטית גרעינית (MAS SSNMR).

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי להשיג מפות תלת-ממדיות כימי שילוב הדמיה אנרגיה מסונן וטומוגרפיה אלקטרון. התפלגות כימי של שני תומך זרז הנוצרת על-ידי רכיבי קשה להבחין על ידי טכניקות הדמיה אחרות היה למד. כל יישום מורכב מיפוי חופף יסודות כימיים - קצוות יינון ברווחים שווים בהתאמה.

קבלת מפות תלת-ממדיות כימי על ידי אנרגיה מסונן הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים טומוגרפיה

מוצג כאן הוא פרוטוקול לביצוע מולקולה בודדת Förster העברת אנרגיה ללמוד החלטה ג'ונסון. עירור שני הצבעים משמש לקביעת קבועי הדיסוציאציה. הזמן חד צבע לשגות smfret הוא לאחר מכן בזמן אמת מחשוף בחני להשיג את התפלגות זמן לשכון לפני הרזולוציה ג'ונסון.

מולקולה בודדת Förster שיטות העברת אנרגיה בזמן אמת על החלטה של צומת הולידיי-GEN1

מאמר זה מציג שיטה לניתוח spatiotemporal של נייד, מולקולה אחת Förster העברת אנרגיה תהודה (smFRET) מבוסס בדיקות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. ערכת הכלים החדשה שפותחה מאפשרת לקבוע עקבות זמן smFRET של בדיקות נעות, כולל היעילות הנכונה של FRET ואת העמדות המולקולריות, כפונקציות של זמן.

ניתוח ספטיוטמפורלי דו-ממדי אוטומטי של בדיקות FRET ניידות בעלות מולקולה אחת

הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) של פיזור קדם-תהודה אלקטרונית של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן היא פלטפורמה חדשה להדמיית חלבונים מבוססת אפיטופים מרובבים מאוד. כאן אנו מציגים מדריך מעשי הכולל הכנת נוגדנים, צביעת דגימת רקמות, הרכבת מיקרוסקופ SRS והדמיית רקמות epr-SRS.

הדמיית רקמות מרובבת מאוד עם צבעי ראמאן

אנו מציגים פרוטוקול לרכישת תמונות כימיות עם מיקרוסקופיית פיזור ראמאן (SRS) בפס רחב. בהתבסס על מיקרוסקופ SRS הפועל עם זיהוי דיפרנציאלי רב-ערוצי-נעילה, הפרוטוקול מתאר את הכנת הדגימה, התאמת מנגנון ה-SRS והכימומטריקה כדי לנטרל מרכיבים שונים של דגימות הטרוגניות מבחינה כימית.

הדמיה כימית מולטיפלקס מבוססת על מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה בפס רחב

הפרוטוקול מספק הוראות לשינוי RNA עם דימתיל סולפט לניסויים בפרופיל מוטציות. הוא כולל בדיקה במבחנה ו - in vivo עם שתי שיטות הכנה חלופיות לספרייה.

בדיקת מבנה RNA עם פרופיל מוטציה של דימתיל סולפט עם ריצוף במבחנה ובתאים

למד מתודולוגיית מיפוי FRET לזיהוי אתרי קישור ליגנדים ושינויים קונפורמציוניים בחלבונים. השיטה מאפשרת מעקב אחר תנועות דינמיות במערכות ביומולקולריות בתמיסה.

מיפוי העברת אנרגיית תהודה של Förster: מתודולוגיה חדשה להבהרת תכונות מבניות גלובליות

גלה סרטונים נוספים