Name: בידוד וסינון מהמגוון הביולוגי בקרקע עבור פטריות המעורבות בהתדרדרות של חומרים סרבנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: למדו לבודד פטריות מקרקע לצורך ביורימדיאציה של חומרים סרבנים כמו פטרוליום ושמנים. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי זני פטריות עם פוטנציאל פירוק גבוה לטיפול בזיהום סביבתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לסקואולה די אלטה פורמציונה דוטוראלה (SAFD) מאוניברסיטת פאביה ולפרופסור סולביג טוסי על מתן ההזדמנות לעבודה זו.

1. בחירת זנים פטרייתיים המסוגלים לפרק חומרים סרבנים מהאדמה
<ol><li>הכנת תמיסה אנטיביוטית.<ol>
<li>מכניסים לפניצילין (50 מ"ג/ל'), סטרפטומיצין (40 מ"ג/ל'), כלורטטרציקלין (40 מ"ג/ל'), ניאומיצין (100 מ"ג/ל') וכלוראמפניקול (100 מ"ג/ל') לתוך 250 מ"ל של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה.</li>
		<li>לפני הוספת כלורמפניקול לתמיסה האנטיביוטית, ממיסים אותו ל-3 מ"ל של ≥99% אתנול.</li>
		<li>מניחים את התמיסה האנטיביוטית על מערבל מגנטי (ללא חום) עם מוט ערבוב מגנטי בתוך התמיסה למשך 10 דקות. אחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מדיה צמיחה.<ol>
<li>שים 1 גרם של חומצה הומית מסחרית, 3.26 גרם של מרק בושנל-האס (BH), ו-15 גרם של אגר לתוך 1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה והכניס אותו באופן אוטומטי למשך 20 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס (אגר חומצה הומית).</li>
		<li>מכניסים את אגר החומצה ההומית לכלי פטרי מתחת לארון זרימה למינרי.</li>
		<li>שים 4 גרם של lignocellulose, 3.26 גרם של BH, ו 15 גרם של אגר לתוך 1 L של מים deionized ו autoclaveveed אותו במשך 20 דקות ב 121 °C (lignocellulose agar).</li>
		<li>צלחת את האגר lignocellulose לתוך צלחות פטרי תחת ארון זרימה למינרי.</li>
		<li>מתחת לארון זרימה למינרי, לאחר שהתקשורת התמצקה בצלחות פטרי, מעבירים 1 מ"ל של תמיסת האנטיביוטיקה על הצלחות המוכנות באמצעות מזרק סטרילי עם מסנן 0.2 מיקרומטר כדי לעקר אותו.</li>
		<li>מפזרים את התמיסה האנטיביוטית באופן שווה על משטחי הצלחת באמצעות מפזר תאים חד פעמי סטרילי בצורת L ומניחים לו להתייבש באוויר מתחת לארון הזרימה הלמינרי.</li>
		<li>שים 20 גרם של מרק תמצית מאלט ו -15 גרם של אגר לתוך 1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה ו autoclaveve אותו במשך 20 דקות ב 121 ° C (תמצית מאלט אגר - MEA).</li>
		<li>צלחת את ה- MEA לתוך צלחות פטרי מתחת לארון זרימה למינרי.</li>
	</ol></li>
	<li>דגימת קרקע ודילול קרקע.<ol>
<li>דוגם את האדמה המעניינת בעומק של 10 ס"מ, מסירים את הצמחים, העשב והעלים המתים מהשכבה העליונה, ומכניסים אותה לשקיות פוליאתילן סטריליות.</li>
		<li>לאחר ההגעה למעבדה, מסננים את הקרקע באמצעות רשת 2 מ"מ, תוך הסרת כל השורשים ופסולת הצמחים.</li>
		<li>אם לא ניתן להמשיך בניתוח במורד הזרם באופן מיידי, אחסן את דגימות הקרקע המסוננות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>בעבודה מתחת לארון זרימה למינרי, הכניסו 1 גרם מהאדמה המסוננת לצינור סטרילי של 15 מ"ל עם 10 מ"ל של מים עבריינים סטריליים (1 x 10-1 דילול). לנער את הצינור אופקית במשך 30 דקות.</li>
		<li>מתחת לארון זרימה למינרי, לפני שהמתלים מתיישבים, קחו 1 מ"ל של דילול 1 x 10-1 עם פיפטה סטרילית והעבירו אותה ל-9 מ"ל של מים ריקים שעברו דה-יוניזציה (1 x 10-2 דילול). מערבולת אותו ביסודיות.</li>
		<li>לפני שהמתלים מתיישבים, קחו 1 מ"ל של דילול 1 x 10-2 עם פיפטה סטרילית והעבירו אותה ל-9 מ"ל של מים ריקים שעברו דה-יוניזציה (1 x 10-3 דילול). מערבולת אותו ביסודיות.</li>
	</ol></li>
	<li>ציפוי דילולים בקרקע במדיה סלקטיבית.<ol>
<li>בעבודה מתחת לארון זרימה למינרי, לאסוף 100 μL של דילול 1 x 10-3 באמצעות micropipette עם נקודה סטרילית ולהעביר אותו על צלחת אגר פטרי humic. עשו זאת עבור לפחות 4 או 5 צלחות פטרי.</li>
		<li>מפזרים את הדילול באופן שווה על משטח צלחת פטרי באמצעות מפיץ תאים חד פעמי סטרילי בצורת L.</li>
		<li>תנו לו להתייבש באוויר במשך 10-15 דקות מתחת לארון הזרימה הלמינרי.</li>
		<li>חזור על שלבים 1.4.1.-1.4.3. באמצעות כלי פטרי ליגנוצלולוז.</li>
		<li>דגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך למשך 15 יום לכל היותר.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד של מושבות פטרייתיות שגדלו ממדיה סלקטיבית למדיה של צמיחה.<ol>
<li>החל מ-3 ימים לאחר ההכנה, בדקו מדי יום את מנות הפטרי הסלקטיביות המוכנות למשך 15 יום לכל היותר.</li>
		<li>בדוק את כל המושבות הפטרייתיות הקיימות עבור דמיון. במידת הצורך, הכינו שקופית שתצפה תחת מיקרוסקופ אור. הערה: המטרה היא לבודד את המספר הגבוה ביותר של מושבות פטרייתיות, אך יש צורך להימנע מלבודד תמיד את אותו זן פטרייתי מצלחות שונות, ולכן בדיקה זו חשובה מאוד. חפשו מושבות עם מאקרו ומיקרומורפולוגיה שונים.</li>
		<li>מתחת לארון זרימה למינרי או במבער בונזן, בודדו כל זן פטרייתי שנבחר על ידי הסרה עדינה של חלק קטן מהתפטיר מהמושבה באמצעות מחט חיסון סטרילית והעברתו לצלחת MEA Petri חדשה. הערה: בשלב זה, חשוב מאוד להיות עדין ומדויק מכיוון שקיים סיכון גבוה לזיהום ממושבות פטרייתיות אחרות הקיימות בצלחת פטרי המקורית. אם יותר מזן פטרייתי אחד גדל על צלחת ה-MEA המחוסנת, חזרו על שלב 1.5.3.</li>
		<li>דגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך למשך 7 ימים. אלה הם הזנים הפטרייתיים שיש לבדוק עוד יותר על חומרים סרבנים ספציפיים.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מבחני גדילה על חומרים סרבנים
<ol><li>מבחן צמיחה על פטרולאטום.<ol>
<li>מעבירים 20 מ"ל של BH נוזלי (3.26 גרם/ליטר של BH) לתוך בקבוקונים של 50 מ"ל ומעקרים אותם על ידי אוטוקלאב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
		<li>מעבירים 7 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה לבקבוקוני זכוכית של 15 מ"ל ומוסיפים כמה חתיכות של כיסויי זכוכית שבורים לכל בקבוקון.</li>
		<li>לעקר אותם על ידי autoclaving ב 121 °C (66 °F) למשך 20 דקות.</li>
		<li>מתחת לארון הזרימה הלמינרי, הוסיפו 1 מ"ל של פטרולאטום לכל בקבוקון 50 מ"ל BH באמצעות פיפטה סטרילית. שמור כמה בקבוקונים עם רק BH כמו שליטה שלילית.</li>
		<li>מתחת לארון הזרימה הלמינרי, הסר את התפטיר על פני השטח של המדיום מלוחות MEA עם הזנים הפטרייתיים שנבחרו (שהוכנו בשלב 1.5.3.) באמצעות מחט סטרילית והעבר אותה לבקבוקוני זכוכית של 15 מ"ל עם הכיסויים השבורים.</li>
		<li>התסיסו כל בקבוקון על מערבל מערבולת למשך 2 דקות, מה שמאפשר לכיסויים השבורים לחתוך את הקובייה של המושבה הפטרייתית, וליצור תרחיף פטרייתי.</li>
		<li>חסן כל בקבוקון פטרולאטום עם 200 μL של תרחיף פטרייתי. הכינו שני שכפולים לכל זן פטרייתי.</li>
		<li>עבור השליטה השלילית, לשים 200 μL של תרחיף פטרייתי לתוך בקבוקונים עם רק BH נוזלי. יתר על כן, לשמור על כמה בקבוקונים עם petrolatum ללא כל חיסון פטרייתי כדי לבדוק זיהום במדיום.</li>
		<li>דגירו את הבקבוקונים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ובדקו אותם לאחר 15 יום ו-30 יום מהאינוקולום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מבחן צמיחה על שמן מנוע משומש.<ol>
<li>שים 3.26 גרם של BH ו-15 גרם של אגר לתוך 1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה והכניס אותו אוטומטית למשך 20 דקות ב-121 מעלות צלזיוס (BHA).</li>
		<li>צלחת את ה- BHA לתוך צלחות פטרי מתחת לארון זרימה למינרי.</li>
		<li>לאחר שהתמצק, העבירו 500 μL של שמן מנוע משומש על צלחות ה-BHA Petri ופיצו אותו באופן שווה על משטחי הצלחת באמצעות מפזר תאים חד פעמי סטרילי בצורת L.</li>
		<li>חסן כל צלחת BHA שמן מנוע משומשת עם כל זן פטרייתי, ואסף את התפטיר מהלוחות שהוכנו בשלב 1.5.3. עבוד במבער Bunsen או מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי כדי למנוע זיהום. הכינו שני שכפולים לכל זן פטרייתי.</li>
		<li>עבור השליטה השלילית, לחסן את צלחות פטרי עם BHA בלבד. יתר על כן, שמור כמה כלי שמן מנוע משומשים BHA פטרי ללא כל חיסון פטרייתי כדי לבדוק זיהום במדיום.</li>
		<li>דגירו את צלחות הפטרי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ובדקו אותן לאחר 15 יום ו-30 יום מהאינוקולום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מבחן גדילה על פלסטיק.<ol>
<li>מעבירים 200 μL של תרחיף פטרייתי (שלבים 2.1.5.-2.1.6.) לתוך צלחת של 96 מיקרווול. הכינו שלושה העתקים של שילוב הזן-פלסטיק הפטרייתי.</li>
		<li>לכל באר עם ההשעיה הפטרייתית, להוסיף 10 מ"ג של סוג אחר של אבקת פלסטיק (פוליאתילן טרפתלט - PET, פוליוויניל כלוריד - PVC, פוליאתילן בצפיפות גבוהה - HDPE, פוליסטירן - PS, פוליאוריתן - PUR).</li>
		<li>עבור הבקרה השלילית, במקום להוסיף את אבקת הפלסטיק, להוסיף 200 μL של תמיסת BH מעוקרת לבאר עם המתלים הפטרייתיים. יתר על כן, עבור כל סוג של אבקת פלסטיק, למלא באר עם 200 μL של תמיסת BH מעוקרת ו 10 מ"ג של כל אבק פלסטיק כדי לבדוק זיהום של המדיום.</li>
		<li>דגירה של לוחות המיקרווול בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ובדקו אותן לאחר 15 יום ו-30 יום מהאינוקולום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. מבחנים אנזימטיים איכותיים
<ol><li>אנזימים ליינינוליטיים איכותיים בדיקת קולורימטריה.<ol>
<li>שים 27 גרם של ציר דקסטרוז תפוחי אדמה (PD) ו -15 גרם של אגר לתוך 1 L של מים שעברו דה-יוניזציה ו autoclaveed אותו במשך 20 דקות ב 121 ° C (PDA).</li>
		<li>כאשר המדיום התקרר מעט אך עדיין נוזלי, מוסיפים חומצה גאלית (5 גרם/ליטר) מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי ומכניסים את המדיום לכלי פטרי.</li>
		<li>חסן את לוחות החומצה הגאלית + PDA + עם כל זן פטרייתי, ואסף את התפטיר מהצלחות שהוכנו בשלב 1.5.3. עבוד במבער Bunsen או מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי כדי למנוע זיהום.</li>
		<li>כבקרה שלילית, מכינים צלחות פטרי עם PDA בלבד (ללא חומצה גאלית) ומחסנים אותן עם הזנים הפטרייתיים (אחד לכל זן פטרייתי), כמו גם צלחת פטרי אחת עם PDA + חומצה גאלית וללא חיסון פטרייתי.</li>
		<li>דגירו את צלחות הפטרי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ובדקו אותן לאחר 7 ימים מהאינוקולום.</li>
	</ol></li>
	<li>מבחן קולורימטרי איכותי של לקאזות.<ol>
<li>שים 27 גרם של PD ו-15 גרם של אגר לתוך 1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה והכניס אותו אוטומטית למשך 20 דקות ב-121 מעלות צלזיוס (PDA).</li>
		<li>כאשר המדיום התקרר מעט אך הוא עדיין נוזלי, מוסיפים גואיאקול (400 μL/L) מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי ומצמידים אותו לכלי פטרי.</li>
		<li>חסן את לוחות ה- PDA + guaiacol עם כל זן פטרייתי, ואסף את התפטיר מהלוחות שהוכנו בשלב 1.5.3. עבוד במבער Bunsen או מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי כדי למנוע כל זיהום.</li>
		<li>כבקרות שליליות, הכינו צלחות פטרי עם מחשב כף יד בלבד (ללא גואיאקול) וחסנו אותן עם הזנים הפטרייתיים (אחד לכל זן פטרייתי), כמו גם צלחת פטרי אחת עם PDA + guaiacol וללא חיסון פטרייתי.</li>
		<li>דגירו את צלחות הפטרי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ובדקו אותן לאחר 7 ימים מהאינוקולום.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת פרוטאזות איכותיות.<ol>
<li>הכן את המדיום של YES על ידי הוספת K2HPO4 (1 גרם/ל' ), KH2PO4 (0.5 גרם/ל' ), MgSO4·7H2O (0.5 גרם/ל'), MnCl2·4H2O (0.001 גרם/ל'), CuCl2·2H2O (1.4 x 10-5 גרם/ל'), ZnCl2 (1.1 x 10-5 גרם/ל' ), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 גרם/ל'), Na2MoO4·2H2O (1.3 x 10-5 גרם/ליטר), FeCl3·6H2O (7.5 x 10-5 גרם/ליטר), וג'לטין/פפטון (0.02 גרם/ליטר) למים שעברו דה-יוניזציה.</li>
		<li>הניחו את מדיום ה-YES על מערבל מגנטי (ללא חום) עם מוט ערבוב מגנטי בתוך המדיום למשך 10 דקות.</li>
		<li>כאשר כל המלחים התמוססו לתוך המדיום, להעביר 5 מ"ל של התמיסה לתוך 20 מ"ל בקבוקוני זכוכית סטריליים autoclaveve אותם autoclaveed אותם במשך 20 דקות ב 121 °C (66 °F).</li>
		<li>עבור השליטה השלילית, להכין כ 20 מ"ל בקבוקוני זכוכית סטריליים עם 5 מ"ל של תמיסת BH autoclaveve אותם autoclaveveed אותם במשך 20 דקות ב 121 °C (66 °F).</li>
		<li>תחת ארון זרימה למינרי, יש להעביר 200 μL של תרחיף פטרייתי (שלבים 2.1.5.-2.1.6.) עבור כל זן לבקבוקונים המעוקרים הבינוניים של YES (יש ליצור לפחות 2 שכפולים לכל זן פטרייתי). עבור כל זן פטרייתי, יש להוסיף 200 μL של אותה תרחיף פטרייתי לבקבוקונים מעוקרים BH כדי לקבל שליטה שלילית.</li>
		<li>דגירה של הבקבוקונים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך למשך 21 יום ובדקו אותם כל 7 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>מבחן אסטרזות איכותיות.<ol>
<li>הכן את המדיום Tween 80 על ידי הוספת פפטון (10 גרם /ליטר), NaCl (5 גרם / L), CaCl2 (0.1 גרם / L) ו - 10 מ"ל של Tween 80 עד 1 L של מים deionized.</li>
		<li>הניחו את מדיום Tween 80 על מערבל מגנטי (ללא חום) עם מוט ערבוב מגנטי בתוך המדיום למשך 10 דקות.</li>
		<li>כאשר הכל נמס בתוך המדיום, להעביר 5 מ"ל של התמיסה לתוך 20 מ"ל בקבוקוני זכוכית סטריליים autoclaveve אותם autoclaveed אותם במשך 20 דקות ב 121 °C (66 °F).</li>
		<li>עבור השליטה השלילית, להכין כ 20 מ"ל בקבוקוני זכוכית סטריליים עם 5 מ"ל של תמיסת BH autoclaveve אותם autoclaveveed אותם במשך 20 דקות ב 121 °C (66 °F).</li>
		<li>תחת ארון זרימה למינרי, העבירו 200 μL של מתלים פטרייתיים (שלבים 2.1.5.-2.1.6.) עבור כל זן לבקבוקונים המעוקרים הבינוניים Tween 80 (בצעו לפחות 2 שכפולים לכל זן פטרייתי). עבור כל זן פטרייתי, יש להוסיף 200 μL של אותה תרחיף פטרייתי לבקבוקונים מעוקרים BH לשליטה שלילית.</li>
		<li>דגירה של הבקבוקונים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך למשך 21 יום ובדקו אותם כל 7 ימים.</li>
	</ol></li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

המגוון הביולוגי העשיר של האדמה הוא מקור שופע של פטריות בעלות יכולות מטבוליות רבות, שחלקן עשויות להיות מועמדות פוטנציאליות לשיקום ביולוגי. בדיקות מדיה סלקטיביות (סעיף 1 של הפרוטוקול) הן שיטות קלות לביצוע ויעילות לבידוד פטריות המסוגלות לגדול על פולימרים מורכבים טבעיים כמקור הפחמן היחיד שלהן. פטריות יכולות לייצר הידרולזות חוץ-תאיות ולא ספציפיות ואוקסידורדוקטאזות30 כגון האנזימים הליניליטיים לקאזות ופרוקסדזות31. אנזימים אלה יכולים לפרק את הליגנוצלולוז וחומצות הומיות, אך גם קסנוב...

אדמה היא מרכיב בסיסי בחיים על פני כדור הארץ והיא הבסיס למערכות אקולוגיות רבות. המינרלים, החומר האורגני והמיקרואורגניזמים בקרקע יכולים להיחשב כמערכת אחת, עם קשרים הדוקים ואינטראקציות המתרחשות ביניהם. לאינטראקציות של תרכובות אלה יש השפעה חשובה על תהליכים יבשתיים, איכות הסביבה ובריאות המערכת האקולוגית1. זיהום קרקע מציב בעיות סביבתיות חמורות ברחבי העולם. ליישום חסר ההבחנה, ארוך הטווח והמופרז של חומרים סרבנים ורעילים, כגון חומרי הדברה, מוצרי נפט, פלסטיק וכימיקלים אחרים, יש השפעות חמורות על האקולוגיה של הקרקע, וכתוצאה מכך, הוא יכול לשנות את המיקרוביוטה של הקרקע. קהילות מיקרוביאליות בקרקעות מורכבות ממגוון רחב של אורגניזמים במצבים פיזיולוגיים שונים, כאשר רובם הם חיידקים ופטריות. לרבים מהמזהמים בקרקעות יש יציבות לטווח בינוני עד ארוך, וההתמדה שלהם עלולה להוביל לפיתוח מנגנוני הסתגלות המאפשרים למיקרואורגניזמים להשתמש בחומרים סרבנים כחומרים מזינים 2,3. מיקרואורגניזמים אלה יכולים, אם כן, להיחשב עבור טכניקות bioremediation.
Bioremediation מנסה למתן את ההשפעות של זיהום על ידי שימוש במיקרואורגניזמים ובאנזימים שלהם לפירוק או טרנספורמציה של פסולת לתרכובות פחות רעילות או לא רעילות. מינים שונים של ארכיאה, חיידקים, אצות ופטריות הם בעלי יכולת התחדשות ביולוגית זו4. כתוצאה מהפעולות המתכלות המסוימות שלהם, פטריות הן אורגניזמים מבטיחים במיוחד עבור bioremediation. הם יכולים לתקוף מצעים שונים באמצעות רשת ההיפל שלהם, מה שמאפשר להם לחדור למטריצת הקרקע בצורה יעילה יותר מאשר מיקרואורגניזמים אחרים. בנוסף, הם יכולים להגיע לאינטרסטים בלתי נגישים שבהם קשה להסיר מזהמים5, והם יכולים גם לשרוד רמות לחות נמוכות6. יתר על כן, פטריות מסנתזות קלטות שונות של אנזימים לא ספציפיים, בדרך כלל כדי לפרק חומרים סרבנים טבעיים כגון תאית, ליגנין וחומצות הומיות. אלה שאין להם את מצע המטרה יכולים להיות מעורבים בפירוק של מגוון רחב של מזהמים סרבנים, כגון פחמימנים, פלסטיק וחומרי הדברה 7,8,9,10. לכן, למרות שמינים פטרייתיים רבים כבר דווחו כסוכנים ביולוגיים, יש עניין גובר לחקור מינים שעדיין לא נחקרו כדי לבחור מועמדים לתיקון ביולוגי של חומרים מזהמים סרבניים. המינים שכבר ידועים כבעלי תכונות ביולוגיות שייכים לפילה אסקומיקוטה 11,12,13, באסידיומיקוטה14,15 ומוקורומיקוטה. לדוגמה, הסוגים פניציליום ואספרגילוס ידועים כמעורבים בפירוק של פחמימנים אליפטיים13, פולימרים פלסטיים שונים 16,17,18, מתכות כבדות19 וצבעים20. באופן דומה, מחקרים שבוצעו על פטריות basidiomycetes, כגון Phanerochaete chrysosporium ו- Trametes versicolor, חשפו את מעורבותם בחמצון של חומרים סרבנים כגון פחמימנים ארומטיים13 ופלסטיק21. דוגמה נוספת לפטריות המעורבות בתהליכי ההתכלות הביולוגית הן הזיגומיסטים Rhizopus spp., Mucor spp., ו- Cunninghamella spp.22,23. בפרט, קנינגהם מסוגלת לאקסידאז פחמימנים ארומטיים ונחשבת לאורגניזם מודל לחקר ניקוי רעלים של מוצרים ממגוון רחב של קסנוביוטיקה13.
ישנם מספר אנזימים פטרייתיים המעורבים בתהליכים המשפילים העיקריים של חומרים סרבנים24,25, כגון אסטראז, לקאז, פרוקסידאז ופרוטאז. לקאזות הן אוקסידאזות המכילות נחושת המיוצרות בתא ומופרשות לאחר מכן, המאפשרות חמצון של מגוון תרכובות פנוליות וארומטיות. הם יכולים לפרק אורתו ופרה-דיפנולים, את הפנולים המכילים את קבוצת האמינו, את הליגנין ואת הדיאמינים המכילים את קבוצת האריל26. פרוקסידאזות משתמשות במי חמצן כמתווך כדי לפרק את הליגנין ותרכובות ארומטיות אחרות. ישנם פרוקסידאזות רבות ושונות, אך אלה עם הפוטנציאל הגדול ביותר לפרק חומרים רעילים הם ליגנין פרוקסידאז ומנגן פרוקסידאז27.
אסטרזות ופרוטאזות שייכות לקבוצת האנזימים החוץ-תאיים או האקטו-תאיים, הפועלים מחוץ לתאי המוצא שלהם אך עדיין קשורים אליהם. אנזימים אלה יכולים לזרז את ההידרוליזה של מולקולות סרבניות גדולות למולקולות קטנות יותר. בשל הספציפיות הנמוכה שלהם לסובסטרט, אנזימים אלה יכולים למלא תפקיד מפתח בחידוש ביולוגי של מזהמים שונים, כגון צבעי טקסטיל, שפכים המשתחררים מתעשיות העיסה והנייר ושיזוף עור, מוצרי נפט, פלסטיק וחומרי הדברה 28,29,30.
מספר שיטות סינון לבחירה עבור זנים פטרייתיים ביו-רמדיקטיביים כבר פורסמו. לדוגמה, מדיום אגר מבוסס קש שימש לסינון פטריות ריקבון לבן עם פוטנציאל גבוה בהתפרקות הפחמימנים הארומטיים הפוליציקליים (PAH)31; ופיסות קטנות של עץ נרקב הונחו על אגר תמצית מאלט (MEA) כדי לבודד פטריות נרקבות עץ32. עם זאת, רוב השיטות שכבר הוצעו בוחרות פטריות ספציפיות מאוד לפעילות העניין שלהן. מחקר זה מציע גישה רחבה יותר לבחירת פטריות אדמה עם טווח פעולה רחב יותר. השיטה מסתמכת על ציפוי ראשוני של דילולים סדרתיים של דגימות קרקע על מדיום מתוקן עם חומצות הומיות או lignocellulose מעורבב עם אנטיביוטיקה כדי לבחור פטריות עם היכולת לפרק את החומרים הסרבניים הטבעיים האלה. חומצות הומיות וליגנוצלולוז, למעשה, הן חומרים עמידים מאוד להתכלות ביולוגית מכיוון שיש להם מבנים מולקולריים מורכבים מאוד, וזה מאפשר להם להיות אינדיקטורים מצוינים ליכולת המשפילה של הפטריות שנבדקו33,34. לאחר מכן, הפטריות שנבחרו בבדיקות הראשונות נבדקות כדי לזהות את אלה שיש להן פוטנציאל לפגוע במזהמים ספציפיים כמו פטרולאטום, שמן מנוע משומש ופלסטיק. לבסוף, בדיקות אנזימטיות איכותיות מבוצעות כדי לזהות זנים פטרייתיים המסוגלים לייצר אנזימים המעורבים בתהליכי הפירוק הביולוגי של חומרים סרבנים. לשם כך נערכות בדיקות פרוטאז ואסטראז, בעוד שחומצה גאלית וגואיקול משמשות כאינדיקטורים ללקאז ולייצור אנזים לינינוליטי אחר35,36. מצעים אלה משמשים משום שנמצא מתאם חזק בין יכולתן של פטריות לחמצן אותן לצורתן החומה לבין החזקת היכולת הלינינוליטית 37,38,39.
באמצעות פרוטוקולים אלה, ניתן לבודד זנים פטרייתיים בעלי פוטנציאל מתכלה גבוה וקשת רחבה של פעולה ישירות מדגימות קרקע. הבידוד של הזנים הפטרייתיים האלה יכול לעזור למצוא מועמדים חדשים למטרות של רה-מדיה ביולוגית.

<table><tbody><tr><td>96 צלחת מיקרווול</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>VWR</td><td>84609.05</td><td></td></tr><tr><td>מרק בושנל-האס</td><td>פלוקה</td><td>B5051</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>כלורואמפניקול</td><td>Eurobio</td><td>GABCRL006Z</td><td></td></tr><tr><td>כלורטטרציקלין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td>Y0001451</tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3279</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VWR כימיקלים</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&middot; 6 ש'<תת>2</תת>O</td><td>מסנן 236489 סיגמא-אולדריץ</td><td></td>' 0.2 ומיקרו;<td></td></tr><tr><td> m</td><td>Whatman</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גאלית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>החלקות כיסוי זכוכית</td><td>Biosigma</td><td>VBS634</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית 15 מ"ל</td><td>SciLabware</td><td>P35467</td><td></td></tr><tr><td>guaiacol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5502</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן בצפיפות גבוהה (HDPE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434272</td><td></td></tr><tr><td>חומצות הומיות</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>53680</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lignocellulose</td><td>/</td><td>/</td><td>פסולת ייצור ביו-אתנול מעוקר</td></tr><tr><td>מפזר תאים בצורת L</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21133</td><td></td></tr><tr><td>בוחש מגנטי</td><td>A.C.E.F</td><td>8235</td><td></td></tr><tr><td>תמצית מאלט מרק</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>70146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 1000 &mu; L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 200&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2</td><td>O Sigma-Aldrich</td><td>M1651</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0401000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1504489</td><td></td></tr><tr><td>פפטון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83059</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן טרפתלט (PET)</td><td>Goodfellow</td><td>ES306031</td><td></td></tr><tr><td>מנות פטרי</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>פטרולטום (נוזל פרפין)</td> <td>A.C.E.F</td><td></td><td></td></tr><tr><td>009661 מרק דקסטרוז תפוחי אדמה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6685</td><td></td></tr><tr><td>פוליסטירן (PS)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' 331651</td><td></td></tr><tr><td>פוליאוריטן (PUR)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>GF20677923</td><td></td></tr><tr><td>פוליוויניל כלוריד ( PVC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>81388</td><td></td></tr><tr><td>צינור בז סטרילי</td><td>Greiner bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית סטריליים 20 מ"ל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SU860051</td><td></td></tr><tr><td>נקודה סטרילית 1000&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>F172511</td><td></td></tr><tr><td>נקודה סטרילית 200&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>F172311</td><td></td></tr><tr><td>שקיות פוליאתילן סטריליות</td><td>WHIRL-PAK</td><td>B01018</td><td></td></tr><tr><td>קרני מזרק סטריליות</td><td></td><td>5523CM25</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-6501</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>שמן מנוע משומש</td><td>/</td><td>/</td><td>תערובת מורכבת של פחמימנים, תוספי מנוע ומתכות, המסופקת על ידי חברה פרטית איטלקית</td></tr><tr><td>בקבוקונים 50 מ"ל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33108-U</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד וסינון מהמגוון הביולוגי בקרקע עבור פטריות המעורבות בהתדרדרות של חומרים סרבנים

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

זיהום סביבתי הוא בעיה הולכת וגוברת, וזיהוי פטריות המעורבות בתהליך הביו-רמדיה הוא משימה חיונית. אדמה מארחת מגוון מדהים של חיים מיקרוביאליים ויכולה להיות מקור טוב לפטריות ביולוגיות אלה. עבודה זו נועדה לחפש פטריות אדמה עם פוטנציאל שיקום ביולוגי באמצעות בדיקות סינון שונות. מדיית תרביות מינרלים בתוספת חומרים סרבנים כמקור הפחמן היחיד שימשה כמבחני גדילה. ראשית, דילול הקרקע צופה על צלחות פטרי עם מדיום מינרלי מתוקן עם חומצות הומיות או lignocellulose. המושבות הפטרייתיות הגדלות בודדו ונבדקו על מצעים שונים, כגון תערובות מורכבות של פחמימנים (פטרולאטום ושמן מנוע משומש) ואבקות של פולימרים פלסטיים שונים (PET, PP, PS, PUR, PVC). בדיקות אנזימטיות איכותיות נקשרו לבדיקות הגדילה כדי לחקור את הייצור של אסטרזות, לקאזות, פרוקסידאזות ופרוטאזות. אנזימים אלה מעורבים בתהליכי הפירוק העיקריים של חומר סרבני, וההפרשה המכוננת שלהם על ידי הזנים הפטרייתיים שנבדקו עשויה להיות בעלת פוטנציאל להיות מנוצל לצורך רה-שיקום ביולוגי. יותר מ-100 זנים בודדו ונבדקו, ונמצאו כמה מבודדים עם פוטנציאל שיקום ביולוגי טוב. לסיכום, בדיקות הסינון המתוארות הן שיטה קלה ובעלות נמוכה לזיהוי זנים פטרייתיים עם פוטנציאל לשיקום ביולוגי מהקרקע. בנוסף, ניתן להתאים את בדיקות הסינון למזהמים שונים, על פי הדרישות, על ידי הוספת חומרים סרבניים אחרים למדיה תרבותית מינימלית.

שיטות המדיה הסלקטיביות (סעיף 1 של הפרוטוקול) אפשרו לסנן את המגוון הביולוגי העשיר של הקרקע ולבחור את הפטריות בעלות פוטנציאל ההשבחה הביולוגי הגבוה. עם החומצה ההומית והליגנוצלולוז, בודדו יותר מ-100 זנים פטרייתיים. פטריות אלה ייצרו אנזימים המעורבים בהתפרקות ביולוגית של חומרים סרבנים טבעיים, בעלי מבנה כימי הדומה למזהמים רבים. עם זאת, הזנים הפטרייתיים שבודדו עם המדיה הסלקטיבית נזקקו לסינון נוסף. באופן ספציפי, הבדיקות הסלקטיביות בודדו את הזנים המסוגלים לפרק חומצות הומיות וליגנוצלולוז, בדיקות הגדילה סקרו את הפטריות המבודדות עבור...

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת המגוון הביולוגי בקרקע כדי לחפש זנים פטרייתיים המעורבים בפירוק של חומרים סרבנים. ראשית, זנים פטרייתיים המסוגלים לגדול על חומצות הומיות או ליגנוצלולוז מבודדים. פעילותם נבדקת לאחר מכן הן במבחנים אנזימטיים והן במזהמים כגון פחמימנים ופלסטיק.

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an ...

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא מבודד זנים פטרייתיים בעלי פוטנציאל מתכלה גבוה ישירות מדגימות קרקע כדי להיחשב כמועמדים למטרות ביו-רמדיה. פרוטוקול זה הוא הקרנה בעלות נמוכה כדי למצוא פטריות עם פוטנציאל bioremediation. יתר על כן, הוא נותן תוצאות שקל לפרש.מכיוון שטכניקה זו כוללת טיפול במיקרואורגניזמים, חשוב מאוד לעבוד בסטריליות באמצעות ארון זרימה למינרי או מבער בונזן כדי למנוע זיהום. כדי להתחיל, לדגום את הקרקע המעניינת ולסנן את הקרקע באמצעות רשת של שני מילימטרים כדי להסיר שורשים ופסולת צמחים. מתחת לארון זרימה למינרי, הוסיפו גרם אחד של האדמה המסוננת לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר.לאחר מכן, הוסיפו 10 מיליליטרים של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה כדי ליצור דילול של 10 למינוס אחד. לנער את הצינור אופקית במשך 30 דקות. לפני שהמתלים מתיישבים, קחו מיליליטר אחד של 10 לדילול מינוס אחד עם פיפטה סטרילית והעבירו אותה לתשעה מיליליטר של מים ריקים שעברו דה-יוניזציה כדי להפוך 10 לדילול מינוס שתיים.מערבולת את המתלים ביסודיות. באופן דומה, בצעו דילול של 10 עד מינוס שלוש מ-10 לצינור דילול מינוס שתיים. לציפוי דילול קרקע על מדיה סלקטיבית, אספו 100 מיקרוליטרים מתוך 10 עד מינוס שלוש דילול באמצעות מיקרופיפט עם נקודה סטרילית והעבירו אותה לצלחת פטרי אגר הומי.מפזרים את הדילול באופן שווה על משטח התבשיל באמצעות מפיץ תאים סטרילי, חד פעמי, בצורת L. הכינו ארבע עד חמש מנות כאלה. באופן דומה, הכינו מנות ליגנוצלולוז מצינור דילול של 10 עד מינוס שלוש.אפשרו לכלים להתייבש באוויר במשך 10 עד 15 דקות לפני שהם דוגרים ב-25 מעלות צלזיוס בחושך במשך 15 יום. בדוק את כל המושבות הפטרייתיות הקיימות עבור דמיון. במידת הצורך, הכינו שקופית שתצפה תחת מיקרוסקופ אור.מתחת לארון זרימה למינרי או במבער בונזן, יש לבודד כל זן פטרייתי שנבחר על ידי הסרה עדינה של חלק קטן מהתפטיר מהמושבה באמצעות מחט חיסון סטרילית. מעבירים את המושבה המבודדת לתבשיל חדש של תמצית מאלט, או MEA. מעבירים 20 מיליליטרים של בושנל האס, או מדיום BH, לבקבוקוני זכוכית של 50 מיליליטר.מעבירים שבעה מיליליטרים של מים שעברו דה-יוניזציה לבקבוקונים של 15 מיליליטר ומוסיפים חתיכות של כיסוי זכוכית שבור לתוך כל בקבוקון. לעקר את הבקבוקונים על ידי אוטוקלאב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. כדי לבחון צמיחה על פטרולאטום, הוסיפו מיליליטר אחד של פטרולאטום לכל בקבוקון BH של 50 מיליליטר באמצעות פיפטה סטרילית מתחת לארון הזרימה הלמינרי.שמור כמה בקבוקונים עם רק BH כמו שליטה שלילית. הסר את התפטיר על פני השטח של המדיום מצלחת MEA עם הזן הפטרייתי שנבחר באמצעות מחט סטרילית והעביר אותו לבקבוקון זכוכית 15 מיליליטר עם החלקות הכיסוי השבורות. התסיסו את הבקבוקון על מערבל מערבולת במשך שתי דקות, ואפשרו לכיסוי השבור לחתוך את הקובייה של המושבה הפטרייתית, וליצור תרחיף.חסן כל בקבוקון פטרולאטום עם מתלי 200 מיקרוליטרים. הכינו שני שכפולים לכל זן פטרייתי. עבור הבקרה השלילית, הוסף 200 microliters של תרחיף פטרייתי לתוך הבקבוקון המכיל רק BH בינוני.כמו כן, לשמור את הבקבוקון עם petrolatum ללא כל חיסון פטרייתי כדי לבדוק זיהום במדיום. דגירה של הבקבוקונים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך וצפו בהם לאחר 15 ו -30 יום מהאינקולום. כדי לבחון את הצמיחה בשמן מנוע משומש, העבירו 500 מיקרוליטרים של שמן מנוע משומש לצלחת BHA Petri ופיצו את השמן באופן שווה.לאחר מכן, לחסן את הצלחת עם זן פטרייתי על ידי איסוף התפטיר מצלחות MEA. כדי לבחון את הגידול בפלסטיק, העבירו 200 מיקרוליטרים של תרחיף פטרייתי לצלחת של 96 מיקרו-וול. הכינו שלושה העתקים של שילוב הזן-פלסטיק הפטרייתי.מוסיפים 10 מיליגרם של אבקת פלסטיק שונה לכל באר עם ההשעיה הפטרייתית. עבור הבקרה השלילית, הוסף 200 microliters של בינוני BH לבאר עם המתלים הפטרייתיים. יתר על כן, עבור כל אבקת פלסטיק, למלא באר עם 200 microliters של תמיסת BH ו 10 מיליגרם של כל אבק פלסטיק כדי לבדוק זיהום.הדגירה של הלוחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך וצפו בהן לאחר 15 ו-30 יום. לבדיקה קלורימטרית איכותית של לקאזות, הכינו ליטר אחד של אגר דקסטרוז תפוחי אדמה, או PDA, ואוטוקלב במשך 20 דקות. לאחר האוטוקלבינג, כאשר המדיום התקרר אך הוא עדיין נוזלי, מוסיפים 400 מיקרוליטרים של גואיאקול מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי ומצלחים אותו לתוך צלחות פטרי.חסן את צלחת ה- PDA guaiacol במתח פטרייתי על ידי איסוף התפטיר מצלחת ה- MEA. לבקרות שליליות, הכינו צלחות PDA עם כל זן פטרייתי וצלחת אחת עם מחשב כף יד ו-guaiacol. דגירה של הלוחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך וצפו בהן לאחר שבעה ימים.למבחן האסטרזות האיכותיות, הכן ליטר אחד של Tween 80 בינוני. לאחר מכן, הניחו את המדיום על מערבל מגנטי ללא חימום עם מוט ערבוב בתוך המדיום. לאחר 10 דקות, כאשר הכל נמס, להעביר חמישה מיליליטרים של המדיום לתוך בקבוקונים סטריליים 20 מיליליטר ו autoclave.הוסיפו 200 מיקרוליטרים של תרחיף פטרייתי לבקבוקון המעוקר הבינוני Tween 80. עבור הבקרה השלילית, הוסף חמישה מיליליטרים של מדיום BH אוטוקלאב לתוך בקבוקון 20 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 microliters של תרחיף פטרייתי לבקבוקון.דגירו את הבקבוקונים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך במשך 21 יום וצפו בהם כל שבעה ימים. הוערך אחוז הזנים הפטרייתיים המסוגלים לגדול על בנזיןאטום, שמן מנוע משומש ואבקות פלסטיק כמקור הפחמן היחיד שלהם בדרגות שונות של הצלחה. היכולת של פטריות לנצל פטרולאטום הוערכה כהבדל בצמיחת המושבה בין BH מבוקר לבין מכיל פטרולאטום.כמעט 75% מהזנים שנבדקו הצליחו להשתמש בפטרולאטום כמקור הפחמן היחיד שלהם ו-21% הציגו צמיחה מרבית. כמו כן מנוטר הגידול עבור לוחות המכילים רק BHA ובנוכחות שמן מנוע. כמעט 90% מהמאמצים גדלו על שמן מנוע משומש, כאשר 39% מהם הראו צמיחה מרבית.היווצרותה של הילה אדומה-חומה סביב המושבה הפטרייתית הצביעה על ייצור גבוה יותר של לקאזות ואנזימים לינינוליטיים אחרים. כ-60% מהפטריות הצליחו לייצר לקאזות. יתר על כן, 17% מהזנים יצרו הילה כהה עזת סביב המושבה במדיום גואיאקול.פעילות האסטרזות הוערכה על ידי היווצרות של משקע לבן במדיום Tween 80. כמעט 60% מהזנים הראו פעילות אסטרזות ו-13% הדגימו היווצרות משקעים גבוהה יותר. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לסינון פטריות המסוגלות להשפיל כל מזהם על ידי הוספת החומר הסרבן בעל העניין למדיום תרבות מינימלי.

isolation-screening-from-soil-biodiversity-for-fungi-involved

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: וילה, ה. ד. מ. ואחרים. חיפוש זנים מיקרוביאליים לביורימדיאציה ופיתוח פרוביוטיקה למחקר ושימור מטאורגניזמים. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים את הבידוד של חיידקים ימיים המפרקים מזהמים באמצעות דילול סדרתי, בחירת מושבות וצמיחה בתווך המכיל EE2. על ידי שימוש ב-EE2 כמקור הפחמן היחיד, הפרוטוקול מזהה זנים חיידקיים המסוגלים לפרק את מזהם הסביבה הזה.

סינון חיידקים ימיים לבידוד זנים מזהמים

סרטי פלסטיק שכותרתו "מתכלה" זמינים מסחרי לשימוש חקלאי כmulches. עבוד האדמה מייצגת שיטת סילוק אטרקטיבית, אבל השפלה בתנאי שדה הוא הבין היטב. מטרתו של מחקר זה הייתה לפתח שיטות לבידוד פטריות וחיידקים אדמת מולדת שליישב סרטים מאלצים פלסטיק לאחר קבורת שדה.

בידוד של מיקרואורגניזמים באדמה אינדיאני עם פוטנציאל לפירוק סרטים מאלצים פלסטיק מתכלים המשמש בחקלאות

כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על מערכת פיתיון תולעי הארוחות (Tenebrio molitor) ששימשה לבידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות (EPF) מדגימות קרקע. נוסחת מספר קונידיה יעילה (ECN) משמשת לבחירת EPF עמיד בפני מתח גבוה המבוסס על מאפיינים פיזיולוגיים לבקרת מזיקים מיקרוביאלית בתחום.

בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע והערכה של אלימות פטרייתית נגד מזיקי חרקים

מושבות פטרייתיות אנטומופתוגניות מבודדות מדגימות קרקע טרופיות באמצעות פיתיון טנבריו , פיתיון גלריה , כמו גם מדיום מלאכותי סלקטיבי, כלומר, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC).

השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה ומהירה של culturing שמרים ואת התבנית Aspergillus fumigatus מקבוצות גדולות של דגימות קרקע תוך 7 ימים בלבד. ניתן לשנות את השיטות בקלות כך שיתאימו למגוון של מדיות דגירה וטמפרטורות לפי הצורך לניסויים.

בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית

הבידוד של מיקרובים עמידים למתכות כבדות ממעיינות גיאותרמיים הוא נושא חם לפיתוח מערכות ביולוגיות וניטור סביבתי. מחקר זה מספק גישה מתודולוגית לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים למתכות כבדות ממעיינות חמים.

ביו-פרוספקציה של מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים לטיפול בזיהום סביבתי

המאמר הנוכחי נועד לספק פרוטוקולים מפורטים ונאותים לבידוד פטריות אנדופיטיות הקשורות לצמחים, שימור ארוך טווח של מבודדים, אפיון מורפולוגי ומיצוי DNA כולל לצורך זיהוי מולקולרי וניתוחים מטאגנומיים לאחר מכן.

בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

פרוטוקול זה מתאר תכנון ושימוש בשבב בידוד (iChip) לגידול באתרו של חיידקי קרקע עקשנים בסביבתם הטבעית. הוא גם מתאר גידול באתרם של חיידקי קרקע המייצרים אנטי-מיקרוביאליים. ניתן להתאים את הפרוטוקול לשחזור חיידקים מנישות מגוונות עם תכונות רצויות אחרות.

באתרו בידוד ותרבות של חיידקי קרקע עקשנים באמצעות שבב בידוד (iChip)

וידאו זה מציג את נוהל בידוד protoplasts שלם מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס. בהתחשב בכך protoplasts מבודדים נותרו על כנן לפחות 96h והם מבודדים שתילים במקום אחד בן חודש צמחים בוגרים, הליך זה מזרז מבחני המחייב protoplasts ללא פגע.

בידוד של Protoplasts מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס thaliana</em

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

למדו לבודד פטריות מקרקע לצורך ביורימדיאציה של חומרים סרבנים כמו פטרוליום ושמנים. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי זני פטריות עם פוטנציאל פירוק גבוה לטיפול בזיהום סביבתי.

בידוד וסינון מהמגוון הביולוגי בקרקע עבור פטריות המעורבות בהתדרדרות של חומרים סרבנים

גלה סרטונים נוספים