Name: ביו-פרוספקציה של מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים לטיפול בזיהום סביבתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: למד שיטה לאיתור ולבידוד מיקרואורגניזמים עמידים למתכות כבדות ממעיינות גיאותרמיים. הפרוטוקול משמש לביורמדיציה ולניטור סביבתי בקלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: כימרה עמילואידית פונקציונלית לביוסנסינג ימי", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 ועל ידי GoodbyWaste: להשיג מוצריGOOD-ניצול על-ידי-מוצרים-להפחית פסולת, MIUR 2017-JTNK78.006, איטליה. אנו מודים לד"ר מוניקה פיוצ'י ולד"ר אנג'לה מורמונה (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, איטליה) על הזיהוי והאפיון של האתר הגיאותרמי.

1. דגימה של מיקרואורגניזמים מאתרים גיאותרמיים
<ol><li>בחר את האתר לדגימה באמצעות כמקומות קריטריון עם הטמפרטורה הרצויה ו- pH. מדוד את הפרמטרים הפיזיקליים באמצעות בדיקה תרמית דיגיטלית, והכנס אותה לבריכות או לבוץ שנבחרו.</li>
	<li>לאסוף 20 גרם של דגימות קרקע (במקרה זה, מבוץ באתר הידרותרמי של Pisciarelli Solfatara), להרים אותם עם כפית מעוקרת. קח לפחות שתי דוגמאות עבור כל אתר שנבחר.</li>
	<li>שים את הדגימות בצינורות פוליפרופילן סטריליים של 50 מ"ל ומיד לסגור.</li>
	<li>מדוד pH וטמפרטורה באמצעות גשושית thermocouple דיגיטלית על ידי החדרתה ישירות לאתר הדגימה. לאחר השימוש, לשטוף את הבדיקה בזהירות עם מים deionized.</li>
</ol>2. בידוד של מיקרואורגניזמים עמידים למתכות כבדות
הערה: בצע שלבים 2.1-2.7 תחת מכסה מנוע ביולוגי סטרילי.
<ol><li>חסן 2 גרם מכל דגימה שנאספה לתוך 50 מ"ל של מדיום Luria-Bertani שהוכן לאחרונה (LB), שבו ה- pH הותאם ל-4 או 7 באמצעות תוספת של HCl או NaOH.</li>
	<li>הדגירה של הדגימות באותה טמפרטורה של אתר הדגימה ובטמפרטורה של ±5 מעלות צלזיוס (55 מעלות צלזיוס ו-60 מעלות צלזיוס לדגימות פיסיארלי) בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה למשך 24 שעות עם קצב רעד של 180 סל"ד.</li>
	<li>צלחת 200 μL של הדגימות שגודלו על LB agar (pH 4 או pH 7) ודגירה במצב סטטי במשך 48 שעות ב 55 °C (55 °C ) או 60 ° C .</li>
	<li>מבודדים מושבות בודדות וחוזרים על מחזורי ציפוי פסים (שלבים 2.3 ו-2.4) לפחות שלוש פעמים.</li>
	<li>כדי להכין -80 מעלות צלזיוס מלאי תאים קפואים, לגדל את התרביות בן לילה (ON) ולהוסיף לתאים הגדלים 20% גליצרול (בנפח סופי של 1 מ"ל); השתמש בתערובת של אצטון וקרח יבש להקפאה מהירה.</li>
	<li>כדי להכין אינוקולום ממלאי גליצרול, לחסן 50 μL ב-50 מ"ל של LB (pH 4 או pH 6) ולדגום ב-55 °C או 60 °C (60 °C) בשייקר המסלולי ב-180 סל"ד ON.</li>
	<li>כדי לקבל פרופיל גדילה, דיללו קדם-תרבות (המתקבלת משלב 2.6) ל-0.1 OD600 ננומטר ב-10 מ"ל של LB (pH 4 או pH 6), הגדילו את התאים ב-55 °C או 60 °C במשך 16 שעות בשייקר המסלולי, ומדדו את OD600 ננומטר במרווחים של 30 דקות.</li>
	<li>בנה עקומת גדילה מהנתונים המתקבלים בשלב 2.7 עם זמן (דקה) על ציר X ו- OD600 ננומטר על ציר Y.</li>
	<li>לממש את אותה עקומת גדילה המתוארת בשלבים 2.7 ו-2.8, אך לשנות את ה-pH (± 1 יחידה) של מדיום התרבית (למשל, pH 3 ו-5 עבור דגימות שגודלו ב-pH 4) כדי לקבוע את ה-pH האופטימלי לתנאי מעבדה.</li>
</ol>3. זיהוי מבודדים מיקרוביאליים
<ol><li>הכנת דנ"א גנומי<ol>
<li>לחסן את המבודד המפוספס ממלאי הגליצרול ב-50 מ"ל של מדיום LB (pH 4 או pH 6) ולגדול בשייקר מסלולי ב-55 מעלות צלזיוס או 60 מעלות צלזיוס ב-180 סל"ד ON.</li>
		<li>קציר את תרבות ON על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 5000 x g. השליכו את הסופרנאטנט.</li>
		<li>הכן 10 מ"ל של מאגר ליזה של חיידקים המורכב על ידי: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA, 1.2% Triton X-100, ו lysozyme (20 מ"ג / מ"ל) מיד לפני השימוש.</li>
		<li>החייאת הכדור ב-180 μL של חיידקים lysis buffer. אינקובציה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>עקוב אחר ההנחיות שצוינו על ידי ערכת טיהור דנ"א גנומית (טבלת חומרים) כדי לחלץ דנ"א גנומי.</li>
		<li>לכמת את הדנ"א הגנומי המופק ואת טוהרו על ידי מדידת UV-Vis. עבור טוהר לקבוע יחסים-OD 260/280 ננומטר ו- OD 260/230 ננומטר.</li>
		<li>הערך את שלמות הדנ"א הגנומי על ידי העמסת 200 ננוגרם של כל דגימה על ג'ל אגרוז של 0.8% והשוואת התפלגות הגודל לסמן מולקולרי בעל משקל גבוה.</li>
		<li>נציבות לשירות חיצוני את הכנת מקטעי rRNA 16S rRNA, ריצוף וניתוח השוואתי של הרצף המתקבל (1000 bp) עם אלה הנמצאים במאגר הנוקלאוטידים של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי בארה"ב (NCBI)33.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לאשש נתונים של ריצוף 16S rRNA, בצע גם ריבוטיפינג אוטומטי על הדנ"א הכרומוזומלי המעוכל (שירות חיצוני, טבלת חומרים).</li>
	<li>במקרה שבו לא ניתן לקבוע את זיהוי ה-specie רק באמצעות נתוני ריבוטיפ, הזמינו ניתוח MALDI-TOF MS לזיהוי חומצות שומן.</li>
	<li>כדי לבצע ניתוח פילוגנטי של הסוג שזוהה, לנתח את רצף 16S rRNA של המבודד עם BLASTn34. יש להשתמש ברצפים עם זהויות של 99% עד 97% כדי לבנות יישור רצפים מרובים באמצעות CLUSTAL Omega35. בנה עץ מצטרף לשכן באמצעות אפשרות ברירת המחדל של ClustalW2 (פילוגנזה פשוטה).</li>
</ol>4. רגישות למתכות כבדות ואנטיביוטיקה
<ol><li>לחסן את המבודד ממלאי גליצרול (ראה שלב 2.5) ולגדל אותו ב-200 מ"ל של LB בתנאי ה-pH והטמפרטורה האופטימליים שנקבעו קודם לכן.</li>
	<li>דיללו כל קדם-תרבות ב-0.1 OD600 ננומטר ב-5 מ"ל של מדיום LB (ב-pH המתאים) המכילים ריכוזים הולכים וגדלים של מתכות כבדות. הריכוזים נעים בין 0.01-120 mM עבור מתכות כבדות [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), Ni(II), V(V)] או 0.5-1 מ"ג/מ"ל לאנטיביוטיקה [אמפיצילין, בציטרצין, כלוראמפניקול, ציפרופלוקסצין, אריתרומיצין, קנאמיצין, סטרפטומיצין, טטרציקלין ואנקומיצין].</li>
	<li>לבצע טיפולים במתכת כבדה ואנטיביוטיקה בנפרד. השתמשו בצינור פוליפרופילן של 50 מ"ל והגדילו את התאים בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה עם קצב רעד של 180 סל"ד ב-55 מעלות צלזיוס או 60 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות לכל מצב/טיפול.</li>
	<li>חישוב ריכוז מעכב מינימלי (MIC) עבור אנטיביוטיקה או מתכות כבדות על ידי זיהוי ערכי הריכוז בצינורות שבהם לא מתרחשת צמיחה מיקרוביאלית, כלומר קביעת הערכים המעכבים לחלוטין את צמיחת התאים לאחר 16 שעות.</li>
	<li>בדוק שהריכוז מעכב ולא קטלני עבור התאים על ידי ציפוי 200 μL של התרבית שגדלה בערך שנחשב כ- MIC על צלחות LB-agar (ב- pH ובטמפרטורה המתאימים) ואימות נוכחות של מושבות לאחר דגירה ON. הערה: מכיוון שהתרבית על צלחת אגר LB היא בת קיימא בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס רק למשך מספר שבועות, על מנת לשמר את המבודדים למשך זמן רב יותר, הוכנו מלאי הגליצרול ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. לצורך קביעת MIC, בוצעו לפחות שלושה שכפולים עצמאיים באמצעות תרביות עצמאיות. סטיית התקן חושבה בין ניסויים משולשים.</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

מעיינות חמים מכילים מגוון לא מנוצל של מיקרוביום עם יכולות מטבוליות מגוונות באותה מידה12. פיתוח אסטרטגיות לבידוד של מיקרואורגניזמים שיכולים להמיר ביעילות מתכות כבדות לתרכובות פחות רעילות10 מייצג תחום מחקר בעל עניין הולך וגובר ברחבי העולם. מאמר זה נועד לתאר גישה יעילה לסינון ובידוד של מיקרובים עם היכולת להתנגד לכימיקלים רעילים. ניתן לשנות בקלות את השיטה המתוארת כדי לבודד מיקרובים ממקורות סביבתיים מגוונים כגון מים, מזון, אדמה או משקעים. עם זאת, ישנן כמה מגבלות בטכניקה זו הקשור...

הסביבות הקיצוניות על פני כדור הארץ שלנו הן מקורות מצוינים של מיקרואורגניזמים המסוגלים לסבול תנאים קשים (כלומר, טמפרטורה, pH, מליחות, לחץ ומתכות כבדות)1,2, בהיותם איסלנד, איטליה, ארה"ב, ניו זילנד, יפן, מרכז אפריקה והודו, האזורים הגעשיים המוכרים והנחקרים ביותר 3,4,5,6,7,8,9 . תרמופילים התפתחו בסביבות קשות במגוון טמפרטורות מ 45 °C (76 °F) עד 80 °C (80 °F) 10,11,12 . מיקרואורגניזמים תרמופיליים, השייכים לממלכות הארכאיות או החיידקיות, הם מאגר לחקר המגוון הביולוגי, הפילוגנזה וייצור ביומולקולות בלעדיות ליישומים תעשייתיים 13,14,15,16. ואכן, בעשורים האחרונים, הביקוש התעשייתי המתמשך בשוק העולמי עודד ניצול של אקסטרמופילים ותרמוזימים ליישומיהם המגוונים במספר תחומים ביוטכנולוגיה 17,18,19.
מעיינות חמים, שבהם אורגניזמים חיים במאגדים, הם מקורות עשירים של מגוון ביולוגי, ולכן מייצגים בית גידול אטרקטיבי לחקר אקולוגיה מיקרוביאלית20,21. יתר על כן, אזורים עשירים במתכות געשיות אלה מיושבים בדרך כלל על ידי מיקרואורגניזמים שפיתחו מערכות עמידות כדי לשרוד ולהסתגל לנוכחות של מתכות כבדות22,23 ולכן הם מעורבים באופן פעיל במחזורים הביוגיאוכימיים שלהם. כיום, מתכות כבדות נחשבות למזהמים מועדפים עבור בני אדם והסביבה. המיקרואורגניזמים העמידים למתכות כבדות מסוגלים לבודד ולזרז מתכות על ידי הפיכתן ושיפוץ המערכות האקולוגיות שלהם24,25. ההבנה של המנגנונים המולקולריים של עמידות מתכות כבדות היא נושא חם עבור הדחיפות לפתח גישות ירוקות חדשות 26,27,28. בהקשר זה, הגילוי של חיידקים סובלניים חדשים מייצג את נקודת המוצא לפיתוח אסטרטגיות חדשות לשיקום ביולוגי סביבתי24,29. בליווי המאמצים לחקור סביבות הידרותרמיות באמצעות הליכים מיקרוביולוגיים ולהגביר את הידע על תפקידם של הגנים העומדים בבסיס הסבילות למתכות כבדות, נערכה בדיקה מיקרוביאלית באזור המעיין החם של קמפי פלגרי באיטליה. סביבה זו, העשירה במתכות כבדות, מראה פעילות הידרותרמית רבת עוצמה, פומרולה ובריכות רותחות, המשתנה ב-pH ובטמפרטורה בתלות בעונתיות, גשמים ותנועות גיאולוגיות תת-קרקעיות30. בפרספקטיבה זו, אנו מתארים דרך קלה ליישום ויעילה לבודד חיידקים העמידים בפני מתכות כבדות, לדוגמה, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (שנקרא כבודד 1) ו- Alicyclobacillus mali FL1832 (שנקרא כבודד 2) מאזור Pisciarelli בקמפי פלגרי.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>Aura Mini</td><td>bio air s.c.r.l.</td><td></td><td>ברדס ביולוגי</td></tr><tr><td>בציטראצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B0125</td><td></td></tr><tr><td>קדמיום כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>202908</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>ציפרופלוקסצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>קובלט כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>נחושת כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>224332</td><td></td></tr><tr><td>אריתרומיצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E5389</td><td></td></tr><tr><td>שירות חיצוני</td><td>DSMZ</td><td></td><td>מכון לייבניץ DSMZ-אוסף גרמני של מיקרואורגניזמים ותרביות תאים GmbH</td></tr><tr><td>ערכת טיהור DNA גנומי</td><td>תרמו מדעי</td><td>#K0721</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין סולפט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>MaxQTM 4000 שייקר אורביטלי Benchtop</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td></td></tr><tr><td>כספית כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>215465</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניקל כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>654507</td><td></td></tr><tr><td>אוריון כוכב A221 מד pH נייד</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>STARA2218</td><td></td></tr><tr><td>נתרן (מטה) ארסניט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S7400</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ארסן דו-בסיסי הפטהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A6756</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>טטרציקלין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון ביוכימיה</td><td>Applichem Panreac</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>ונקומיצין</td><td>סיגמא אולדריץ</td><td>' PHR1732</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים לביולוגיה מולקולרית</td><td>Applichem Panreac</td><td>&nbsp; א3732</td><td></td></tr></tbody></table>

ביו-פרוספקציה של מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים לטיפול בזיהום סביבתי

Bioprospecting of Extremophilic Microorganisms to Address Environmental Pollution

מעיינות גיאותרמיים עשירים ביוני מתכת שונים בשל האינטראקציה בין סלע למים המתרחשת באקוויפר העמוק. יתר על כן, בשל שונות עונתיות ב- pH ובטמפרטורה, תנודות בהרכב האלמנטים נצפות מעת לעת בסביבות קיצוניות אלה, ומשפיעות על קהילות המיקרוביאליות הסביבתיות. מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים המשגשגים בנביעות תרמיות געשיות פיתחו מנגנוני התנגדות לטיפול במספר יוני מתכת הנמצאים בסביבה, ובכך לוקחים חלק במחזורים ביו-גיאוכימיים מורכבים של מתכות. יתר על כן, אקסטרמופילים ומוצריהם מצאו דריסת רגל נרחבת בשוק, וזה נכון במיוחד לגבי האנזימים שלהם. בהקשר זה, האפיון שלהם פונקציונלי לפיתוח ביו-מערכות ועיבודים ביולוגיים לניטור סביבתי ולתיעוד ביולוגי. נכון להיום, הבידוד והטיפוח בתנאי מעבדה של מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים עדיין מהווים צוואר בקבוק לניצול מלא של הפוטנציאל הביו-טכנולוגי שלהם. עבודה זו מתארת פרוטוקול יעיל לבידוד של מיקרואורגניזמים תרמופיליים ממעיינות חמים, כמו גם את הזיהוי הגנוטיפי והפנוטיפי שלהם באמצעות השלבים הבאים: (1) דגימה של מיקרואורגניזמים מאתרים גיאותרמיים ("Pisciarelli", אזור וולקני של קמפי פלגרי בנאפולי, איטליה); (2) בידוד של מיקרואורגניזמים עמידים למתכות כבדות; (3) זיהוי מבודדים מיקרוביאליים; (4) אפיון פנוטיפי של המבודדים. המתודולוגיות המתוארות בעבודה זו עשויות להיות מיושמות באופן כללי גם לבידוד של מיקרואורגניזמים מסביבות קיצוניות אחרות.

אתר הדגימה פרוטוקול זה ממחיש שיטה לבידוד של חיידקים עמידים למתכות כבדות ממעיין חם. במחקר זה, אזור פיסיארלי, סביבה גיאותרמית חומצית-סולפידית, שימש כאתר דגימה (איור 1). מערכת אקולוגית זו מאופיינת בזרימה של נוזלי גופרית אגרסיביים שמקורם בפעילות געשית. הוכח כי הקהילות המיקרוביאליות במערכות גיאותרמיות חומציות-סולפידיות נתונות ללחץ סלקטיבי קיצוני שנוצר על ידי נוכחות של ריכוזים גבוהים של מתכות כבדות. הדגימות נאספו בשתי תקופות שונות של השנה (אפריל וספטמבר) מ-2,21...

הבידוד של מיקרובים עמידים למתכות כבדות ממעיינות גיאותרמיים הוא נושא חם לפיתוח מערכות ביולוגיות וניטור סביבתי. מחקר זה מספק גישה מתודולוגית לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים למתכות כבדות ממעיינות חמים.

Geothermal springs are rich in various metal ions due to the interaction between rock and water that takes place in the deep aquifer. Moreover, due to ...

הפרוטוקול מתאר גישה יעילה לסינון ובידוד של מיקרובים עמידים למתכות כבדות ממעיינות גיאותרמיים. גישה זו מייצגת תחום מחקר בעל עניין הולך וגובר ברחבי העולם ליישום בתחום הביוסנסינג והביו-רמדיה. ניתן לשנות בקלות את השיטה המתוארת בו כדי לבודד מיקרובים ממקורות סביבתיים מגוונים כגון מים, מזון, אדמה או משקעים.הריכוז המעכב המינימלי לזיהוי מיקרובים עמידים הוא אסטרטגיה מהירה לאפיון המינים או הזנים החדשים. פרוטוקול זה קל לביצוע ודורש רק מיומנות וניסיון ידניים בטכניקות המיקרוביולוגיה הבסיסיות. כדי להתחיל, לחסן שני גרם של דגימה שנאספה לתוך 50 microlites של מדיום Luria-Bertani מוכן טרי עם pH של ארבעה או שבעה.דגירה של דגימה זו בטמפרטורה של אתר הדגימה פלוס או מינוס חמש מעלות צלזיוס. צלחת 200 microliters של הדגימה על לוריא-ברטאני אגר עם pH של ארבעה או שבעה ולשמור אותו במצב סטטי ב 55 או 60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לאחר הדגירה, בודדו מושבות בודדות וחזרו על מחזור ציפוי הפסים הזה לפחות שלוש פעמים.כדי להכין מיליליטר אחד של מלאי תאים קפואים, הוסיפו 20% גליצרול לתאים שגדלו במשך הלילה. השתמשו בתערובת של אצטון וקרח יבש להקפאה מהירה. כדי להכין אינוקולום ממלאי גליצרול, חסן 50 מיקרוליטרים ב-50 מיליליטרים של לוריא-ברטאני.כדי לקבל פרופיל צמיחה, דללו את הקדם-תרבית הזו ב-10 מיקרוליטרים של לוריא-ברטאני. כדי להתאים את הצפיפות האופטית ל- 0.1 הוסף 600 ננומטר. לגדל את התאים האלה במשך 16 שעות בטמפרטורה של 55 או 60 מעלות צלזיוס בשייקר המסלולי.מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר במרווחים של 30 דקות. עקומה מנתונים אלה עם זמן על ציר X וצפיפות אופטית ב 600 ננומטר על ציר Y. הצב עקומות גדילה דומות עם pH משתנה של מדיום התרבית, כדי לקבוע את ה- pH האופטימלי לתנאי מעבדה, חסן את המבודד המפוספס ממלאי הגליצרול ב-50 מיקרוליטרים של מדיום לוריא-ברטאני ודגירה בן לילה.צנטריפוגה זו תרבות גדלה בן לילה במשך 10 דקות ב 5, 000 פעמים G ואז להשליך את supernatant וקציר את לוח התרבית. הכן 10 מיליליטרים של חיידקים lysis buffer המורכב מ 20 millimolar Tris-HCL, שני מילימולאר EDTA, 1.2%Triton X-100 ו 20 מיליגרם למיליליטר ליזוזום מיד לפני השימוש. להשעות מחדש את הכדור ב-180 מיקרוליטרים של מאגר חיידקים.מיצוי דנ"א גנומי כפי שהונחה בערכת הטיהור ומדידת דנ"א גנומי וטוהרו על ידי UV-Vis. כדי להעריך את הטוהר, קבע את יחסי הצפיפות האופטית של 260 עד 280 ו-260 עד 230. הערך את שלמות הדנ"א הגנומי על ידי העמסת 200 ננוגרם של כל דגימה על ג'ל אגרוז של 0.8% והשוואת התפלגות הגודל לסמן מולקולרי בגובה ובמשקל.לגדל את הבידוד ממלאי הגליצרול ב-200 מיליליטרים של תנאי ה-pH והטמפרטורה האופטימליים של לוריא-ברטאני. דיללו כל קדם-תרבית בחמישה מיליליטרים של מדיום לוריא-ברטאני ב-50 מיליליטר של צינורות פוליפרופילן המכילים ריכוזים הולכים וגדלים של מתכות כבדות ואנטיביוטיקה כדי לקבל צפיפות אופטית של 0.1 ב-600 ננומטר. לגדל את התאים במשך 16 שעות על שייקר מסלולי עם 180 סיבובים לדקה ב 55 או 60 מעלות צלזיוס.חשב את הריכוז המעכב המינימלי עבור אנטיביוטיקה או מתכות כבדות על ידי זיהוי ערכי הריכוז בצינורות שבהם לא מתרחשת צמיחה מיקרוביאלית. בדקו שהריכוז מעכב ולא קטלני עבור התאים על ידי ציפוי 200 מיקרוליטרים של התרבית שגדלו בריכוזים מעכבים מינימליים על צלחות אגר לוריא-ברטאני ואימות נוכחות של מושבות לאחר הדגירה של הלילה. פרוטוקול זה שימש לבדיקת דגימות חיידקים מאזור פיסקרלי, סביבה גיאותרמית של חומצה גופרתית אפיון פנוטיפי של המיקרואורגניזמים המבודדים הראה כי לבידוד יש עמידות גבוהה יותר לארסנאט וונדאט והוא עמיד בפני קדמיום.נתונים השוואתיים מצביעים על כך שלבודד יש עמידות חזקה לארסן מחומש בעוד שלבודד שניים יש עמידות לארסן טריוולנטי. בדיקות עמידות לאנטיביוטיקה הראו כי אדם מבודד רגיש מאוד לכל האנטיביוטיקה שנבדקו גם כאשר נעשה שימוש בריכוזים נמוכים. לעומת זאת, לבודד שניים עמיד לכל האנטיביוטיקה שנבדקו למעט כלורמפניקול וטטרציקלין.המיקרואורגניזם ככל הנראה רכש עמידות לאנטיביוטיקה עקב מוטציות אקראיות או העברת גנים אופקית המייצגים יתרון סלקטיבי בתנאים סביבתיים קיצוניים. מחקר זה מדגים את התועלת של שיטות כאלה לבחירת מיקרואורגניזם סביבתי שיכול להשבית את המזהמים ולהמיר אותם למוצרים לא מזיקים.

bioprospecting-extremophilic-microorganisms-to-address-environmental

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

אאוקריוטים חיידקים הם גם מקור של פחמן photosynthetically הנגזרות ואת הדף מינים טורפים ב לצמיתות מכוסי קרח אגמים אנטארקטיקה. דו"ח זה מתאר תרבות והעשרה הגישה לבודד מטבולית אאוקריוטים חיידקים צדדי מן האגם אנטארקטיקה, אגם בוני, ומעריך את הפוטנציאל אורגניים קיבוע פחמן באמצעות assay radioisotope עבור Ribulose-1 ,5-bisphophate פעילות oxygenase (RuBisCO) carboxylase.

הקמת מיקרוביאלית תרבויות העשרה האיקריוטים מ שכבתית כימית אנטארקטיקה אגם והערכת פוטנציאל קיבוע פחמן

מקור: וילה, ה. ד. מ. ואחרים. חיפוש זנים מיקרוביאליים לביורימדיאציה ופיתוח פרוביוטיקה למחקר ושימור מטאורגניזמים. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים את הבידוד של חיידקים ימיים המפרקים מזהמים באמצעות דילול סדרתי, בחירת מושבות וצמיחה בתווך המכיל EE2. על ידי שימוש ב-EE2 כמקור הפחמן היחיד, הפרוטוקול מזהה זנים חיידקיים המסוגלים לפרק את מזהם הסביבה הזה.

סינון חיידקים ימיים לבידוד זנים מזהמים

מקור: וילה, ה. ד. מ. ואחרים. חיפוש זנים מיקרוביאליים לביורימדיאציה ופיתוח פרוביוטיקה למחקר ושימור מטאורגניזמים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הבידוד הסלקטיבי של חיידקים ימיים המפרקים נפט על ידי העשרת דגימות מי ים על מדיום מבוסס נפט, מה שמאפשר השחזור של זנים טהורים עם יישומים פוטנציאליים בביורימדיציה של נפט גולמי ובניקוי סביבתי.

העשרה סלקטיבית ובידוד של חיידקים ימיים מפרקים נפט מדגימות מי ים

באתר מיקרוביאלי העשרה או בחיי עיר הטיפוח-תרגול טכניקות יכול להקל את ניתוקה של taxa חיידקים קשה-עד-תרבות, במיוחד של סביבות נמוך-ביומסה או geochemically קיצוני. כאן, אנו מתארים את הגדרת אלקטרוכימי של ללא שימוש במקור כוח חיצוני כדי להעשיר את זני חיידקים המסוגלים אלקטרון חוץ-תאית תחבורה (EET).

הגדרת אלקטרוכימי העומד בפני עצמו להעשיר respiring אנודת חיידקים באתר

פרוטוקול זה מתאר ניסויים מיקרוביאלית תחת לחצים מוגבה ללמוד תהליכי ביוניג באתרו. הגישה הניסיונית מעסיקה כור בלחץ גבוה נדנדה מצויד תא התגובה זהב-טיטניום המכיל תרבות מיקרוביאלית של חומצי, ברזל עשיר בברזל.

שימוש גמיש זהב-טיטניום תגובת התאים כדי לדמות פעילות מיקרוביאלית תלויי לחץ בהקשר של ביוניג תת משטח

זיהום משפיע על כל biomes. סביבות ימיות מושפעים במיוחד, במיוחד שוניות אלמוגים, אחת האקולוגיות הרגישות ביותר על כדור הארץ. המשך הגישור הוא היכולת של אורגניזמים לבזות מזהמים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיות כדי לבודד ולבדוק חיידקים הצגת יכולת bioremediation ומאפיינים פרוביוטיקה פוטנציאליים עבור אלמוגים.

החיפוש אחר זנים מחיידקים לפיתוח בימתן ומוצרי פרוביוטיקה עבור המחקר והשימור של מטאפיאורגניזם

אנו מציגים את תהליך הבידוד, ההתרבות והאפיון של חיידקים מפרקים פחמימנים מבתי גידול מימיים. הפרוטוקול מתאר בידוד חיידקים, זיהוי בשיטת 16S rRNA, ובדיקת פוטנציאל פירוק הפחמימנים שלהם. מאמר זה יסייע לחוקרים לאפיין מגוון ביולוגי מיקרוביאלי בדגימות סביבתיות, ובמיוחד לסנן מיקרובים בעלי פוטנציאל לריפוי ביולוגי.

בידוד, ריבוי וזיהוי של מיני חיידקים בעלי תכונות מטבוליזם פחמימני מבתי גידול מימיים

המוקד של מאמר זה הוא לפרט שיטות עבודה מומלצות להכנת מדיה עבור מיקרואורגניזמים אנאירוביים מהירים שנרכשו מסביבה. שיטות אלה מסייעות בניהול תרביות אנאירוביות וניתן ליישם אותן כדי לתמוך בצמיחה של מיקרואורגניזמים חמקמקים ולא מתורבתים, "החומר האפל המיקרוביאלי".

קבוצה של פורמטים מדומים מדומים באתרם לטיפוח מיקרואורגניזמים אנאירוביים שנרכשו בסביבה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אבולוציה ניסיוני להסתגלות בתרמופילים המשתמשים בתרמומיקסרים זולים וחסכוניים באנרגיה כאינקובטורים. הטכניקה מודגמת באמצעות אפיון של התאמת טמפרטורה ב Sulfolobus acidocaldarius, ארכיאון עם טמפרטורת צמיחה אופטימלית של 75 ° C.

הסתגלות בקצוות החיים: אבולוציה ניסיונית עם הארכיאון הקיצוני Sulfolobus acidocaldarius

טכניקת iChip עושה שימוש במכשיר בידוד זול ופשוט באתרו המגביר את שיעורי גילוי המיקרואורגניזמים החדשים מהאדמה. ניתן להשתמש במיקרואורגניזמים חדשים למחקר נוסף הנוגע למיקרוביום הקרקע או לגילוי מוצרים טבעיים, בין היתר.

בידוד מיקרואורגניזמים בקרקע באמצעות טכנולוגיית iChip

כאן, אנו מתארים שיטות דגימה מהאזורים האופוטיים של מערכות אקולוגיות ימיות ומים מתוקים כדי לבודד ציאנופגים (והמארחים שלהם) ותהליכים שלאחר הדגימה המעשירים גנוטיפים בודדים ומאפיינים את דינמיקת האינטראקציה בין וירוס למארח.

דגימה סביבתית של מיקרובים פוטוסינתטיים ווירוסיהם: מהשדה למעבדה

למד שיטה לאיתור ולבידוד מיקרואורגניזמים עמידים למתכות כבדות ממעיינות גיאותרמיים. הפרוטוקול משמש לביורמדיציה ולניטור סביבתי בקלות.

ביו-פרוספקציה של מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים לטיפול בזיהום סביבתי

גלה סרטונים נוספים