בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

שיטה זו תספק תובנה טובה יותר על תפקודו של אנדותל עורקי parenchymal אשר מקשר ישירות את זרימת הדם התוך מוחית לתדלוק של פעילות עצבית גליה ברחבי המוח. יתרון טכני מובהק על פני אנדותל עורקי הוא הרזולוציה המשופרת של ממדים מורפולוגיים ואיתות סידן וחשמלי בקרב תאי אנדותל תוך-מוחיים בודדים והאברונים שלהם. בתחילה, בידוד ובדיקה של אנדותל תוך מוחי יהיה מאתגר מאוד.

עם זאת, ניתן לשלוט בטכניקה זו עם שפע של תרגול מלווה סבלנות ומסירות. לשטוף את המוח המבודד עם פתרון ניתוח קר בכוס או צלחת פטרי כדי להסיר את הדם הנותר מפני השטח של המוח. מניחים את צד המוח הגחוני פונה כלפי מעלה בתא המכיל פתרון חתך קר כדי לבודד עורקים parenchymal.

כדי לבודד עורקים פרנצ'ימליים, אבטחו את המוח המבודד עם סיכות פלדה בתמיסת ביתור קרה בצלחת פטרי המכילה ציפוי סיליקון פולימרי בעומק של יותר מ-50 ס"מ. חותכים מלבן של רקמת המוח משתי ההמיספרות עם מספריים חדים ומקושרים סביב ה- MCA תוך הבטחה כי החלק העליון של קטע הרקמה הוא בעבר נקודת ההסתעפות ממעגל ויליס. אבטחו את רקמת המוח לתוך הצלחת עם MCA פונה כלפי מעלה עם סיכות פלדה.

בזהירות לעשות חתך רדוד ליד הסיכות ולהסיר את פיא עם מלקחיים קטנים, בעדינות קילוף מקצה אחד לכיוון השני. בזהירות לאבטח את פיה מבודד עם arterioles parenchymal הסתעף מ MCA בצלחת עם הסיכות ולנתח בזהירות את arterioles parenchymal. חותכים את כל הענפים הדיסטליים הנותרים ומוודאים שהעורקים נקיים ללא רקמות מחוברות.

השתמש זה עורק שלם נקי לעיכול אנזימטי. לחלופין, לחתוך כל arteriole לשני חלקים לעיכול אנזימטי להכין צינורות אנדותל אם תרצה. לעיכול חלקי של מקטעים arteriolar, למקם מקטעים arteriolar שלמים לתוך מיליליטר אחד של פתרון דיסוציאציה בצינור זכוכית 10 מיליליטר המכיל פפאין, dithioerythritol, collagenase, ואלסטאז.

מגזרי דלקת עורקים דגירה ב 34 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 12 דקות. כדי לבודד את צינור אנדותל arteriolar, למקם את פיפטה trituration מחובר עם מזרק מיקרו בתמיסת הדיסוציאציה בתא ומקם אותו קרוב לקצה אחד של קטע כלי מעוכל. הגדר קצב בטווח של ננו-ליטר אחד עד שלושה ננו-ליטרים לשניה בבקר המשאבה לטריטורציה עדינה.

תוך שמירה על הגדלה של פי 100 עד פי 200, הסר את מקטע העורקים לתוך הפיפטה ולאחר מכן הזריק כדי לנתק את ההרפתקנטיה ולהחליק את תאי השריר. הפוך את מקטע הכלי לטריטורלי עד שכל תאי השריר החלקים יתנתקו ורק תאי אנדותל יישארו כצינור שלם. עם מיקרו מניפולטורים, לאבטח כל קצה של צינור אנדותל על מכסה הזכוכית בתא עם זכוכית borosilicate הצמדת פיפטות כדי למדוד את פוטנציאל קרום אנדותל, תוך כדי צפייה דרך המטרה 4X, בזהירות למקם את קצה האלקטרודה החדה רק מעל תא של צינור אנדותל arteriolar לתוך פתרון מלח פיזיולוגי זורם עם מניפולטור מיקרו.

הגדל בהדרגה את ההגדלה ל-400X ומקם מחדש את קצה האלקטרודה לפי הצורך. באמצעות מניפולטור מיקרו, בעדינות להכניס את הקצה של אלקטרודה חדה לתוך אחד התאים של צינור אנדותל ולהתחיל להקליט VM באמצעות אלקטרומטר. לאחר VM מנוחה אנדותל יציב ממינוס 30 למינוס 40 מיליוולט, להחיל את הסוכנים הפרמקולוגיים הרצויים לכל מטרה ניסיונית.

טען את צינור האנדותל עם גשש פלואורסצנטיות עבור קרום הפלזמה או אברון הרצוי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 30 דקות. לשטוף את התאים עם תמיסת מלח פיזיולוגית superfusion טרי ותאים חיים תמונה מתחת למיקרוסקופ על אורך גל עירור של הצבעים המתאימים. תפקוד אנדותל הוערך על ידי מדידת סידן תאי ופוטנציאל ממברנה בתגובה סוכן פרמקולוגי MTA, אגוניסט קולטן פורינרגי חזק ב 37 מעלות צלזיוס.

עם יישום של MTA מיקרומולרי אחד, ריכוז סידן תאי עולה במהירות עם היפרפולריזציה בו זמנית. יתר על כן, האנדותל השלם היה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם גששים פלואורסצנטיים להדמיה כדי לבחון מורפולוגיה תאית. הדמיית תאי אנדותל חיה הראתה כתמים משותפים עבור קרום פלזמה וגרעינים.

קרום הפלזמה היה מוכתם יחד עם כתם פלואורסצנטי רטיקולום אנדופלסמי לפיו אזורים של חפיפה לכאורה של ER בסמיכות של קרום הפלזמה נראים כתומים. הנסיין צריך להיות זהיר במהלך ניתוח ובידוד כדי למנוע נזק arterioles כי arterioles פגום בהחלט לא להניב צינור אנדותל שלם. בעקבות ההליך, התאים עשויים לשמש אימונוהיסטוכימיה קבועה עם נוגדנים פלואורסצנטיים או כתמי תאים חיים של אברונים ושומנים ממברנה.

טכניקה זו תיצור מידע חדש להבנת מנגנונים העומדים בבסיס זרימת הדם המוחית ברמה הבסיסית לפיזיולוגיה ובחירת מעברים לפתולוגיה לטיפול.