Name: בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: למדו הדמיית פיזור Raman מגורה בשני צבעים לאבחון רקמות בזמן אמת במוח עכבר. שיטה זו מאפשרת יצירת תמונות היסטולוגיות ללא צביעה או עיבוד רקמות, ומאיצה משמעותית את זמן הניתוח הקליני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי NIH R35 GM133435 עד D.F.

<ol><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Cui, M., Zhang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+and+computational+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence and computational pathology.</a> Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).</li>
<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li>
<li>Orringer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+intraoperative+histology+of+unprocessed+surgical+specimens+via+fibre-laser-based+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0027(2017).</li>
<li>Ji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free+detection+of+brain+tumors+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).</li>
<li>Hollon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+real-time+intraoperative+brain+tumor+diagnosis+using+stimulated+Raman+histology+and+deep+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks.</a> Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).</li>
<li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraoperative+assessment+of+skull+base+tumors+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20392(2019).</li>
<li>Lu, F. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+neurosurgical+pathology+with+stimulated+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging.</a> Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).</li>
<li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+imaging+of+breast+calcifications+in+association+with+neoplastic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes.</a> Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).</li>
<li>Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+imaging+with+stimulated+Raman+scattering+by+chirped+femtosecond+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).</li>
<li>Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+microscale+temperature+imaging+by+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).</li>
<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li>
<li>Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li>
<li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+intracellular+distribution+of+tyrosine+kinase+inhibitors+in+living+cells+with+quantitative+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering.</a> Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li>
<li>Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTsai%2C+PS+%22In+Vivo+Optical+Imaging+of+Brain%22">In Vivo Optical Imaging of Brain</a>. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).</li>
<li>Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+pathology+by+spectrally+sliced+femtosecond+stimulated+Raman+scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy.</a> PLoS One. 12 (5), 0178750(2017).</li>
<li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-phase+stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+real-time+two-color+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging.</a> Optica. 4 (1), 44-47 (2017).</li>
<li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-window+sparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li>
<li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li>
<li>Wright, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+for+enhanced+signal+in+CARS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy.</a> Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

ערכת ההדמיה של SRS בשני צבעים המוצגת בפרוטוקול זה תלויה ביישום נכון של הדמיית SRS בצבע אחד. בהדמיית SRS בצבע אחד, השלבים הקריטיים הם יישור מרחבי, יישור זמני, עומק אפנון והסטת פאזה. שילוב מרחבי של שתי הקורות נעשה על ידי מראה דיכרואית. מספר מראות היגוי משמשות להתאמה עדינה בעת שליחת הקורות למראה הדיכרואית. לאחר שילוב הקורות עם המראה הדיכרואית, ניתן לאשר יישור מרחבי על ידי בחירת נתיב הקרן המשולב עם מראה כדי לשלוח לעבר קיר במרחק של >1 מ 'תוך בדיקת הקרן המשולבת כדי לראות אם היא חופפת לכרטיס IR. לאחר יישור מרחבי באמצעות המיקרוס...

אבחון רקמות מסורתי מסתמך על פרוטוקולי צביעה ולאחר מכן בדיקה תחת מיקרוסקופ אופטי. אחת משיטות ההכתמה הנפוצות בהן משתמשים פתולוגים היא צביעת H&E: המטוקסילין מכתים גרעיני תאים בכחול ארגמני, ואוזין מכתים את המטריצה החוץ-תאית ואת הציטופלסמה בוורוד. צביעה פשוטה זו נותרה תקן הזהב בפתולוגיה עבור משימות רבות של אבחנות רקמות, במיוחד אבחון סרטן. עם זאת, להיסטופתולוגיה של H&E, במיוחד לטכניקת החתך הקפואה המשמשת במסגרת תוך ניתוחית, עדיין יש מגבלות. הליך ההכתמה הוא תהליך מייגע הכולל הטבעת רקמות, חתך, קיבוע וכתם1. זמן ההסבה הטיפוסי הוא 20 דקות או יותר. ביצוע H&E במהלך חתך קפוא יכול לפעמים להפוך למאתגר יותר כאשר מקטעים מרובים מעובדים בבת אחת בשל הצורך להעריך תכונות תאיות או דפוסי גדילה בתלת-ממד לצורך הערכת שוליים. יתר על כן, טכניקות היסטולוגיות תוך ניתוחיות דורשות טכנאים וקלינאים מיומנים. הגבלה במספר הפתולוגים המוסמכים בבתי חולים רבים היא אילוץ להתייעצות תוך ניתוחית במקרים רבים. ניתן להקל על מגבלות כאלה עם תחומי העניין המתפתחים במהירות בפתולוגיה דיגיטלית ובאבחון מבוסס בינה מלאכותית2. עם זאת, תוצאות צביעת H&E משתנות, בהתאם לניסיון של הטכנאי, מה שמציב אתגרים נוספים לאבחון מבוסס מחשב2.
ניתן להתמודד עם אתגרים אלה באמצעות טכניקות הדמיה אופטית ללא תוויות. טכניקה אחת כזו היא מיקרוסקופיית SRS. SRS משתמש בלייזרים מסונכרנים עם פולסים – משאבה וסטוקס – כדי לעורר תנודות מולקולריות ביעילות גבוהה3. דיווחים אחרונים הראו כי הדמיית SRS של חלבונים ושומנים יכולה ליצור תמונות שוות ערך ל-H&E (הידועות גם בשם היסטולוגיה של ראמאן מגורה או SRH) עם רקמה טרייה שלמה, אשר עוקפת את הצורך בכל עיבוד רקמות, מקצרת באופן משמעותי את הזמן הדרוש לאבחון, והותאמה תוך ניתוחית4. יתר על כן, הדמיית SRS יכולה לספק תמונות תלת מימד, מה שמציע מידע נוסף לאבחון כאשר תמונות דו-ממדיות אינן מספיקות5. SRH אינו משוחד ומייצר תמונות דיגיטליות הזמינות בקלות לאבחון מבוסס מחשב. הוא מתגלה במהירות כפתרון אפשרי לאבחון סרטן תוך ניתוחי ולניתוח שולי גידול, במיוחד בסרטן המוח 6,7,8. לאחרונה, הדמיית SRS של שינויים כימיים של רקמות הוצעה גם כדי לספק מידע אבחוני שימושי שיכול לעזור עוד יותר לקלינאים לריבוד סוגי סרטן שונים או שלבים9.
למרות הפוטנציאל העצום שלה ביישומי אבחון רקמות, הדמיית SRS מוגבלת בעיקר למעבדות אקדמיות המתמחות באופטיקה בשל המורכבות הקשורה לפלטפורמת ההדמיה, הכוללת לייזרים מהירים במיוחד, מיקרוסקופ סריקת לייזר ואלקטרוניקה מתוחכמת לזיהוי. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה מפורטת להדגמת השימוש במקור לייזר femtosecond נפוץ להדמיית SRS דו-צבעית בזמן אמת וליצירת תמונות פסאודו-H&E מרקמת המוח של עכבר. הפרוטוקול יכסה את ההליכים הבאים:
יישור ואופטימיזציה של ציוץ רוב תוכניות ההדמיה של SRS משתמשות בלייזרים פיקוז-שניות או פמטו-שניות כמקור העירור. עם לייזרים femtosecond, רוחב הפס של הלייזר הוא הרבה יותר גדול מאשר קו Raman. כדי להתגבר על מגבלה זו, נעשה שימוש בגישת מיקוד ספקטרלי כדי לצייץ את לייזרי הפמטו-שניות לציר את ציר הזמן של פיקוז-שניות כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית צרה10. רזולוציה ספקטרלית אופטימלית מושגת רק כאשר הציוץ הזמני (הידוע גם בשם פיזור השהיית הקבוצה או סתם פיזור) מותאם כראוי למשאבה וללייזרים של סטוקס. הליך היישור והצעדים הדרושים כדי לייעל את פיזור קרני הלייזר באמצעות מוטות זכוכית בעלי פיזור גבוה מודגמים כאן.
כיול תדרים יתרון של מיקוד ספקטרלי SRS הוא שניתן לכוונן במהירות את עירור הראמן על ידי שינוי השהיית הזמן בין המשאבה ללייזרים של סטוקס. כוונון כזה מאפשר הדמיה מהירה ורכישה ספקטרלית אמינה בהשוואה לכוונון אורכי גל לייזר. עם זאת, הקשר הליניארי בין תדירות העירור לעיכוב בזמן דורש כיול חיצוני. ממיסים אורגניים עם פסגות ראמאן ידועות משמשים לכיול תדר ראמאן למיקוד ספקטרלי SRS.
הדמיה בזמן אמת, בשני צבעים חשוב להגביר את מהירות ההדמיה ביישומי אבחון רקמות כדי לקצר את הזמן הדרוש לניתוח דגימות רקמות גדולות. הדמיית SRS דו-צבעית סימולטנית של שומנים וחלבונים מייתרת את הצורך לכוונן את הלייזר או את השהיית הזמן, מה שמגדיל את מהירות ההדמיה ביותר מפי שניים. זה מושג על ידי שימוש בטכניקת אפנון אורתוגונלית חדשנית ודמודולציה דו-ערוצית עם מגבר נעילה11. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לאפנון אורתוגונלי ולרכישת תמונה דו-ערוצית.
דימות SRS במצב אפי רוב הדמיית ה-SRS המוצגת עד כה מבוצעת במצב שידור. הדמיה במצב אפי מזהה פוטונים מרוסקים מרקמות12. עבור יישומים פתולוגיים, דגימות כירורגיות יכול להיות גדול למדי. עבור הדמיה במצב שידור, חתך רקמות הוא לעתים קרובות הכרחי, אשר באופן בלתי רצוי דורש זמן נוסף. לעומת זאת, הדמיה במצב אפי יכולה לעבוד עם דגימות כירורגיות שלמות. מכיוון שאותה מטרה משמשת לאיסוף אור מרוסק לאחור, אין גם צורך ביישור מעבה בעל צמצם מספרי גבוה הנדרש להדמיית שידור. מצב אפי הוא גם האפשרות היחידה כאשר חיתוך רקמות קשה, כגון עם עצם. בעבר הוכחנו כי עבור רקמת המוח, הדמיה במצב אפי מציעה איכות הדמיה מעולה לעובי הרקמה > 2 מ"מ13. פרוטוקול זה משתמש במפצל קרן מקטב (PBS) כדי לאסוף פוטונים מפוזרים שעברו דה-פולריזציה על ידי רקמה. ניתן לאסוף יותר פוטונים עם גלאי טבעתי על חשבון המורכבות של הרכבה מותאמת אישית של גלאי12. גישת PBS פשוטה יותר ליישום (בדומה לפלואורסצנציה), כאשר הפוטודיודה הסטנדרטית כבר משמשת לזיהוי מצבי שידור.
יצירת תמונות פסאודו-H&E לאחר איסוף תמונות SRS בשני צבעים, ניתן לצבוע אותן מחדש כדי לדמות את צביעת H&E. מאמר זה מדגים את הנוהל להמרת תמונות ליפידים וחלבון SRS לתמונות פסאודו-H&E SRS עבור יישומי פתולוגיה. פרוטוקול הניסוי מפרט שלבים קריטיים הדרושים ליצירת תמונות SRS באיכות גבוהה. ההליך המוצג כאן אינו ישים רק לאבחון רקמות, אלא גם יכול להיות מותאם ליישומי הדמיית SRS היפרספקטרליים רבים אחרים כגון הדמיית תרופות והדמיה מטבולית14,15.
דרישות מערכת כלליות מערכת הלייזר של פרוטוקול זה חייבת להיות מסוגלת להפיק 2 קרני לייזר מסונכרנות של femtosecond. מערכות כוללות באופן אידיאלי מתנד פרמטרי אופטי (OPO) לכוונון אורכי גל רחבים של אחת מקרני הלייזר. ההתקנה בפרוטוקול זה משתמשת במערכת לייזר מסחרית Insight DS+ המפיקה שני לייזרים (קרן קבועה אחת ב-1,040 ננומטר וקרן אחת מבוססת OPO הניתנת לכוונון, הנעה בין 680 ל-1,300 ננומטר) עם קצב חזרה של 80 מגה-הרץ. מיקרוסקופים לסריקת לייזר, בין אם מיצרני מיקרוסקופים גדולים או שנבנו בבית, יכולים לשמש להדמיית SRS. המיקרוסקופ המנוצל הוא מיקרוסקופ סריקת לייזר זקוף הבנוי על גבי מסגרת מיקרוסקופ זקופה מסחרית. זוג מראות גלבו 5 מ"מ משמשות לסריקת קרן הלייזר. עבור משתמשים הבוחרים לאמץ מיקרוסקופ סריקת לייזר ביתי, עיין בפרוטוקול שפורסם בעבר לבניית מיקרוסקופ סריקת לייזר16.

<table><tbody><tr><td>עדשה אכרומטית 100 מ"מ</td><td>THORLABS</td><td>AC254-100-B</td><td>פס רחב, 650 - 1,050 ננומטר, אורך מוקד עדשה אכרומטית, מסנן פס פס 100 מ"מ</td></tr><tr><td>20 מגה-הרץ</td><td>מיני-מעגלים</td><td>BBP-21.4 +</td> <td>מסנן מעבר פס LC גושי, 19.2 - 23.6 מגה-הרץ, 50 ואומגה;</td></tr><tr><td>עדשה אכרומטית 200 מ"מ</td><td>THORLABS</td><td>AC254-200-B</td><td>פס רחב, 650 - 1,050 ננומטר, אורך מוקד עדשה אכרומטית, 200 מ"מ</td></tr><tr><td>חצי לוחית גל אכרומטית</td><td>איחוד אופטי</td><td>WPA2210-650-1100-M25.4</td><td>חצי לוח גל בפס רחב</td></tr><tr><td>רבע לוח גל איחוד</td><td>אופטי</td><td>WPA4210-650-1100-M25.4</td><td>פס רחב רבע לוחית</td></tr><tr><td>גל דוגם קרן</td><td>THORLABS</td><td>BSN11</td><td>10:90 Plate Beamsplitter</td></tr><tr><td>Dichroic Mirror</td><td>THORLABS</td><td>DMSP1000</td><td>ניתן להשתמש בדיכרואיקות אחרות עם אורך גל מרכזי בסביבות 1,000 ננומטר.</td></tr><tr><td>DMSO (דימתיל סולפוקסיד)</td><td>ממס 472301 סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>לכיול משמרת ראמאן. ניתן להשתמש בממיסים אחרים עם פסגות ראמאן ידועות.</td></tr><tr><td>מודולטור משרעת אלקטרואופטית</td><td>THORLABS</td><td>EO-AM-NR-C1</td><td>יש צורך בשני EOMs לאפנון אורתוגונלי והדמיה דו-ערוצית. גרסת תהודה מומלצת כך שניתן להשתמש בנפח נהיגה נמוך יותרtage.</td></tr><tr><td>יד כוזבת E Staining Script</td><td>Matlab</td><td></td><td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td></tr><tr><td>Fanout Buffer</td><td>PRL-414B</td><td>מעבדת מחקר דופק</td><td>1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer ודוחף קו, ליצירת תדר הנהיגה EOM וההתייחסות לגלאי</td></tr><tr><td>הפוטודיודה המהירה</td><td>THORLABS</td><td>DET10A2</td> Si, 1 <td>ns Rise</td></tr><tr><td>Time Divider</td><td>PRL-220A</td><td>מעבדת</td> <td>מחקר דופקTTL Freq. מחלק (f/2, f/4, f/8, f/16), להפקת 20MHz מפלט הלייזר.</td></tr><tr><td>מוטות זכוכית מפזרים במיוחד</td><td>Union Optic</td><td>CYLROD01</td><td>עדשת מוט H-ZF52A פיזור גבוה 120 מ"מ, עדשת מוט SF11 100 מ"מ</td></tr><tr><td>Insight DS+</td><td>Newport</td><td></td><td>מערכת לייזר המסוגלת להוציא שני לייזרים פולסים מסונכרנים (קרן קבועה אחת ב-1,040 ננומטר וקרן אחת ניתנת לכוונון, הנעה בין 680-1,300 ננומטר) עם קצב חזרה של 80 מגה-הרץ.</td></tr><tr><td>מגבר נעילה</td> מכשירים <td>נוזליים</td><td>Moku Lab</td><td>מגבר נעילה לחילוץ אות SRS מהפוטו-דיודה. ניתן להשתמש גם במכשיר ציריך HF2LI או במכשיר דומה.</td></tr><tr><td>מראות</td><td>THORLABS</td><td>BB05-E03-10</td><td>מראה דיאלקטרית בפס רחב, 750 - 1,100 ננומטר. ניתן להשתמש גם במראות כסף.</td></tr><tr><td>שלב עיכוב ממונע</td><td>Zaber</td><td>X-DMQ12P-DE52</td><td>שלב עיכוב לשליטה עדינה בחפיפה הזמנית של המשאבה והלייזרים של סטוקס. כל שלב ממונע אחר אמור לעבוד.</td></tr><tr><td>מעבה טבילה בשמן</td><td>ניקון</td><td>CSC1003</td><td>1.4 NA. ניתן להשתמש במעבים אחרים עם NA>1.2.</td></tr><tr><td>אוסצילוסקופ</td><td>Tektronix</td><td>TDS7054</td><td>כל אוסילוסקופ אחר עם פס 400 מגה-הרץ ומעלה אמור לעבוד.</td></tr><tr><td>Phase Shifter</td><td>SigaTek</td><td>SF50A2</td><td>להסטת הפאזה של תדר האפנון</td></tr><tr><td>דיודת Photodiode</td><td>Hamamatsu Corp</td><td>S3994-01</td><td>סיליקון PIN עם שטח גדול (10 x 10 ס"מ2). ניתן להשתמש בדיודות אחרות בעלות שטח גדול וקיבול נמוך.</td></tr><tr><td>מפצל קרן מקטב</td><td>איחוד אופטי</td><td>PBS9025-620-1000</td><td>מפצל אלומה מקטב פס</td></tr><tr><td>רחב מסד נתונים</td><td></td><td></td> אינדקס רפאקטיבי <td>refractiveindex.info</td></tr><tr><td>רפלקטור רטרו-רפלקטור</td><td>אופטיקה אדמונד</td><td>34-408</td><td>BBAR פריזמה בזווית ישרה. ניתן להשתמש במנסרות אחרות או ברטרופלקטור.</td></tr><tr><td>מגבר כוח RF</td><td>מיני-מעגלים</td><td>ZHL-1-2W +</td> <td>בלוק רווח, 5 - 500 מגה-הרץ, 50 ואומגה;</td></tr><tr><td>סריקת מראות</td><td>קיימברידג' טכנולוגיות</td><td>6215H</td><td>השתמשנו בסט מראות 5 מ"מ עם ציפוי כסף</td></tr><tr><td>ScanImage</td><td></td><td>Vidrio ScanImage תוכנת</td><td>בקרת מיקרוסקופ סריקת לייזר</td>בסיסית</tr><tr><td>מסנן מעבר קצר</td><td>THORLABS</td><td>FESH1000</td><td>25.0 מ"מ מסנן מעבר קצר פרימיום, אורך גל חיתוך: 1,000 ננומטר. לדיכוי יעיל של הסטוקס, ייתכן שיהיה צורך בשני מסננים.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זקוף</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td>ניתן להשתמש בכל מסגרת מיקרוסקופ אחרת. אם קיים מיקרוסקופ סריקת לייזר, ניתן להשתמש בו ישירות. אחרת, היה צורך להוסיף למיקרוסקופ סורק גלבו ועדשת סריקה.</td></tr><tr><td>מטרת טבילה במים</td><td>אולימפוס</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>לאובייקט המולטיפוטון 25X יש NA של 1.05. ניתן להשתמש במטרות דומות אחרות.</td></tr></tbody></table>

בזמן אמת, שני צבעים מגורה raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) התגלתה כטכניקת הדמיה אופטית רבת עוצמה לאבחון רקמות. בשנים האחרונות, הוכח כי SRS בשני צבעים מסוגל לספק תמונות שוות ערך להמטוקסילין ו-eosin (H&E) המאפשרות אבחון מהיר ואמין של סרטן המוח. יכולת כזו אפשרה יישומים מרגשים לאבחון סרטן תוך ניתוחי. הדמיית SRS בשני צבעים של רקמה יכולה להיעשות עם מקור לייזר פיקוז-שניות או פמטו-שניות. לייזרי Femtosecond נהנים מהיתרון בכך שהם מאפשרים מצבי הדמיה גמישים, כולל הדמיה היפרספקטרלית מהירה והדמיית SRS דו-צבעית בזמן אמת. גישה של מיקוד ספקטרלי עם פולסי לייזר מצייצים משמשת בדרך כלל עם לייזרים פמטו-שניות כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית גבוהה. 
ניתן לממש רכישת SRS בשני צבעים באמצעות אפנון אורתוגונלי וזיהוי נעילה. המורכבות של ציוץ דופק, אפנון ואפיון היא צוואר בקבוק לאימוץ נרחב של שיטה זו. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט כדי להדגים את היישום והאופטימיזציה של SRS המתמקד בספקטרלי והדמיה בזמן אמת בשני צבעים של רקמת המוח של העכבר במצב epi-mode. פרוטוקול זה יכול לשמש למגוון רחב של יישומי הדמיית SRS הממנפים את המהירות הגבוהה ואת יכולת ההדמיה הספקטרוסקופית של SRS.

אופטימיזציה של רזולוציה ספקטרלית: פיזור דרך חומר מושפע ממדיום הפיזור (אורך וחומר) ומאורך הגל. שינוי אורך מוט הפיזור משפיע על הרזולוציה הספקטרלית ועל גודל האות. זוהי מערכת יחסים של תן וקח שניתן לשקול באופן שונה בהתאם ליישום. המוטות מותחים את פולס הקרן מלהיות רחב בתדר וצר בזמן להיות צר בתדר ורחב בזמן. איור 7 מראה את ההשפעה של אורכי מוט משתנים על הרזולוציה הספקטרלית. איור 7A מדגים רזולוציה ספקטרלית ירודה מאוד; במערך זה אין מוטות ציוץ זכוכית, ושת...

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכניקת הדמיה עוצמתית, לא פולשנית ונטולת תוויות. יישום מתפתח אחד הוא היסטולוגיה של ראמאן, שבה הדמיית SRS בשני צבעים במעברי החלבון והשומנים ראמאן משמשת ליצירת תמונות פסאודו-המטוקסילין ואוזין. כאן אנו מדגימים פרוטוקול להדמיית SRS בשני צבעים בזמן אמת לאבחון רקמות.

בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

פרוטוקול זה ידגים יישום ואופטימיזציה של מיקרוסקופיית SRS ממוקדת ספקטרלית וכיצד ניתן להשתמש בה ליישומי היסטולוגיה של ראמאן בזמן אמת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא המהירות שבה דגימות ניתן לעבד לאחר המכשור מיושר כראוי, שכן SRS אינו דורש עיבוד רקמות וצביעה. פרוטוקול זה חל על יישומי SRS אחרים, ולא רק מוגבל להיסטולוגיה.יישומים כאלה כוללים מולקולות קטנות, תרופות, תאים ורקמות. התחל בהתקנת זוג עדשות אכרומטיות עבור קרן המשאבה כדי להגדיל את גודל קרן הלייזר פי שניים כנקודת התחלה. הניחו עדשת 100 ו-200 מילימטרים במרחק של כ-300 מילימטרים זה מזה.לאחר מכן יישרו את קרן המשאבה דרך מרכז שתי העדשות. לאחר מכן הניחו מראה אחרי העדשה השנייה כדי לשלוח את הקורה לכיוון קיר במרחק של יותר ממטר אחד. עקבו אחר הקורה מהמראה אל הקיר באמצעות כרטיס IR ובדקו אם הקרן משתנה בגודלה.רכז את הקרן אם הקרן משתנה בגודלה כפונקציה של מרחק. שלבו את שתי קרני הלייזר על ידי התקנת מראה דיכרואית עם מספר מראות היגוי להתאמה. מטב את החפיפה המרחבית של המשאבה ושל סטוקס על ידי ניטור אלומות אחרי המראה הדיכרואית בשתי עמדות שונות במרחק של כמטר אחד זו מזו.כוונון איטרטיבי של מראת ההיגוי ואחריה המראה הדיכרואית כדי ליישר את קרן סטוקס עם קרן המשאבה. ודא שהקורות המשולבות נשלחות למרכז מראות הסריקה של מיקרוסקופ סריקת הלייזר על ידי התאמת זוג מראות היגוי כאשר מראות הסריקה נמצאות במצב החונה. לאחר המעבה, השתמש בזוג עדשות נוסף עם אורכי מוקד של 100 מילימטרים ו -30 מילימטרים, בהתאמה, כדי להעביר את הקרן המועברת על הפוטודיודה, ולהבטיח ששתי האלומות מוכלות בתוך הפוטודיודה.לאחר מכן התקן שני מסנני מעבר נמוכים כדי לחסום את קרן סטוקס המאופננת. הניחו דוגם קרן בנתיב הקרן של סטוקס כדי לאסוף 10% מהקרן ושלחו אותה לפוטודיודה מהירה כדי לזהות את רכבת הדופק של 80 מגה-הרץ. קחו את אחת היציאות של מאגר המניפה וסננו אותה עם מסנן פסים כדי להשיג גל סינוסואידלי של 20 מגה-הרץ.לאחר מכן השתמש במנחת RF כדי להתאים את שיא היציאה למתח שיא לכ-500 מיליבולטים. שלח את הפלט המתקבל למשנה פאזה, המאפשר התאמה עדינה של פאזת ה- RF עם מקור מתח. שלח פלט זה למגבר כוח RF וחבר את הפלט של המגבר ל- EOM.לאחר הסרת החסימה של קרן סטוקס, מטב את עומק המודולציה של ה- EOM הראשון על ידי הצבת פוטודיודה בנתיב הקרן. התאם את מתח ה- EOM ואת לוחית הגלים הרבעונית עד שעומק המודולציה ייראה משביע רצון. הניחו פוטודיודה אחרי המראה הדיכרואית כדי לזהות את קרן הלייזר.חסום תחילה את קרן סטוקס, ואז התקרב לאחת מפסגות פולס המשאבה באוסצילוסקופ. מקם סמן אנכי כדי לסמן את המיקום הזמני של שיא זה עם האוסצילוסקופ. עכשיו לחסום את קרן המשאבה, ולבטל את החסימה של קרן סטוקס.תרגם את שלב ההשהיה כך שיתאים באופן זמני את מיקומי השיא באוסצילוסקופ למיקום המסומן בשלב הקודם. על ידי חישוב מרחק ההשהיה הנדרש כדי להתאים את שתי הקורות ולאחר מכן הארכת נתיב הקרן של הקרן המהירה יותר או קיצור נתיב הקרן של הקרן האיטית יותר. לאחר מכן הכינו דגימת שקופיות של מיקרוסקופ עם DMSO וסרט דו-צדדי כמרווח כדי להחזיק את הדגימה בין השקופית לכיסוי.הניחו את הדגימה על המיקרוסקופ כשצד הכיסוי פונה אל מטרת המיקרוסקופ והתבוננו בדגימה מתוך היצירה I תחת תאורת שדה בהיר. מצא את מוקד הדגימה הן בשכבה העליונה והן בשכבה התחתונה של בועות האוויר בממשק סרט הזכוכית, ולאחר מכן הזז את המיקוד להיות בין שתי השכבות של הקלטת. לאחר מכן הגדר את תפוקת הקרן הניתנת לכוונון ל-798 ננומטר.בהתבסס על התפוקה האופטית של המעבה, התאם את ההספק האופטי כך שיהיה כ-40 מילי-וואט כל אחד עבור המשאבה ואת אלומות סטוקס במוקד המטרה. לאחר מכן פתח את תמונת הסריקה ב- MATLAB ולחץ על הכפתור שכותרתו מיקוד כדי להתחיל בסריקה. התאם את מראת ההיגוי לפני סורק ה-galvo כדי למרכז את אות ה-DC בצג הערוץ הראשון.הזז את שלב ההשהיה הממונע והתבונן מקרוב בפלט הנעילה המוצג בתצוגת ערוץ שתיים. לבסוף התאם את השהיית הזמן כדי למקסם את עוצמת האות AC. התאם את המראה הדיכרואית למרכז אות ה- SRS בערוץ AC.לאחר מכן התאם את הפאזה של מגבר הנעילה כדי למקסם את האות. לאחר הרכבת הדגימה החלקה על המיקרוסקופ והתאמת העוצמה של שתי האלומות לכ-40 מילי-וואט כל אחת במוקד הדגימה כפי שהודגם קודם לכן. פתח את תמונת הסריקה מ- MATLAB.לאחר מכן מצא את אות ה- SRS המקסימלי על ידי סריקה דרך שלב ההשהיה המתאים לשיא Raman ההופכי של 2, 913 סנטימטרים הפוכים של DMSO. רכשו תמונת SRS המתאימה לשיא ראמאן ההופכי של 2, 913 ס"מ, של DMSO. פתחו את התמונה ב-ImageJ ובחרו אזור קטן במרכז המסגרת.השתמש בפונקציית המדידה כדי לחשב את הממוצע וסטיית התקן של ערכים באזור שנבחר. לכיול גישת תדרים, שמור סריקה היפרספקטרלית עם טווח שלבי ההשהיה המכסה את פסגות 2, 913 ו- 2, 994 סנטימטרים הפוכים של Raman של DMSO. לאחר מכן שמור את מיקומי הבמה המתאימים לערכת הנתונים ההיפר-ספקטרלית.בצע רגרסיה ליניארית לתנוחות הבמה ותזוזות ראמאן ב-2, 913 ו-2, 994 סנטימטרים הפוכים. באמצעות משוואת הרגרסיה הליניארית, המר את מיקומי ההשהיה לתדרי הראמן המתאימים. לכיול הרזולוציה הספקטרלית, הערך את מיקום הבמה בהתבסס על המיקום הקודם עם אורך הנתיב האופטי המוגבר עקב החדרת מוטות.יישור מחדש את החפיפה המרחבית של הקורות בגלל הסטייה הקלה של הקורה כאשר מוסיפים מוטות זכוכית. התקינו מפצל קרן מקטב, צלחת רבע גל ו-EOM שני לנתיב קרן הטבילה לאחר ה-EOM הראשון. נתק את כניסת האות ל- EOM השני, ולאחר מכן חבר את קלט האות ל- EOM הראשון והפעל אותו.כוונן את קרן סטוקס ב-20 מגה-הרץ על ידי שליחת הקרן דרך ה-EOM הראשון. התאם את ההטיה והמיקום של ה- EOM הראשון כדי להבטיח שהקרן ממורכזת דרך גביש EOM. הכינו דגימת שקופית טישו עם סרט דו-צדדי, החלקת מיקרוסקופ וזכוכית כיסוי.הניחו את הדגימה על המיקרוסקופ כשצד הכיסוי פונה אל מטרת המיקרוסקופ. להדמיית SRS במצב אפי, התקינו לוחית חצי גל לפני שהקרן נכנסת למיקרוסקופ כדי לשנות את הקיטוב של הקרן הנכנסת למיקרוסקופ. מקם מפצל קרן מקטב מעל המטרה כדי לאפשר לקרן המוחזרת האחורית המדה-קוטבית להגיע לגלאי.לאחר מכן, השתמש בעדשת 75 מילימטר achromate ועדשה אספרית של 30 מילימטר כדי להעביר את הפוטונים המפוזרים מאחור מהפתח האחורי של המטרה לגלאי הצילום. הרכיבו את הגלאי כדי לאסוף את האור המפוזר האחורי המכוון על ידי מפצל האלומות המקטב. לאחר מכן התקן מסנן כדי לחסום את הקרן המאופננת מלהיכנס לגלאי.שינוי אורכי המוט משפיע על הרזולוציה הספקטרלית. כאשר לא נעשה שימוש במוטות ציוץ זכוכית, שתי פסגות הראמן מ- DMSO אינן נפתרות כלל. עלייה במספר מוטות ציוץ הזכוכית מתחילה לפתור את שתי הפסגות בנקודה משביעת רצון.ציוץ תואם פותר את שתי הפסגות וניתן להשתמש בו כדי לכייל את מיקומי הבמה לתדר. שתי רכבות דופק מושהות בזמן של קיטוב אורתוגונלי המשמשות לצילום ספקטרום DMSO מראות את עיכוב הזמן בין עירורי SRS עם עומק אפנון מקובל והפרדה זמנית. לעומת זאת, שינוי פאזה לקוי של SRS בשני צבעים, יוצר פסגות הפוכות או שליליות.הדמיית SRS בשני צבעים בזמן אמת ב-2, 850 ו-2, 930 סנטימטרים הפוכים של רקמת מוח של עכבר ex vivo מוצגים כאן. תמונות השומנים והחלבון הגולמיות היו מקודדות בצבע כדי לייצר תמונה אחת המתארת את תרומת השומנים והחלבון. צביעה מחדש של המטוקסילין ואאוזין כוזבים, בוצעו גם כדי לחקות את ההמטוקסילין ואת צביעת האאוזין ליישומים פתולוגיים.חפיפה טמפורלית מרחבית ואופטימיזציה של רזולוציה מרחבית הם השלבים החשובים ביותר לגישת המיקוד המרחבי של SRS. שיטה זו ישימה בדרך כלל לניסויים אחרים במיקרוסקופיה של בדיקות משאבה כגון מיקרוסקופיית ספיגה חולפת. השיטה מאפשרת גם הדמיה של מולקולות שאינן פלואורסצנטיות בתאים וברקמות.השיטה המוצגת כאן מאיצה את זמן רכישת התמונה לתרגום עתידי של היסטולוגיה של ראמאן מגורה במרפאה.

real-time-two-color-stimulated-raman-scattering-imaging-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטות bioimaging להערכת biodistribution התא של חלקיקים המתאימים ניטור טיפולית אבחון של תרכובות nanoformulated. השיטות שתוארו לעיל הם רגיש וספציפי כאשר העריכו ידי coregistration היסטולוגית. מתודולוגיות לספק מסלול translational מ מכרסם ליישומים האדם.

Bioimaging רשום של ננו לניטור האבחון והטיפול

מקור: Espinoza, R.,  et al. הדמיית פיזור רמאן מגורה בשני צבעים בזמן אמת של מוח עכבר לצורך אבחון רקמות. J. Vis. exp. (2022).  הסרטון מדגים הדמיית פיזור רמאן מגורה בשני צבעים (SRS) של מקטעי רקמת מוח של עכבר. שתי קרני לייזר מסונכרנות מכוונות אל קטע הרקמה כדי לעורר תנודות מולקולריות, וכתוצאה מכך שינוי עוצמה יחסי בקרניים. שומנים וחלבונים ברקמה מתגלים באמצעות זוגות תדרים מובחנים של קרני הלייזר. לאחר מכן מוקצים לאותות המתקבלים צבעים נפרדים, ויוצרים תמונה דו-צבעונית המסייעת בזיהוי החלבונים והשומנים...

הדמיית פיזור רמאן מגורה בשני צבעים של רקמת מוח של עכבר

Source: Nishimura, C. et al. כימות של ארכיטקטורת כלי דם מוחיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית במודל עכבר של דלקת עצבית הנגרמת על ידי HIV. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את ההדמיה in vivo של נימים בקליפת המוח במוח העכבר באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. הוא מתאר את השלבים להזרקת צבע פלואורסצנטי לעכבר מורדם עם חלון קליפת המוח דק הגולגולת, הכנת ההתקנה להדמיה ורכישת תמונות מפורטות של מבנים מיקרו-וסקולריים במוח לניתוח.

 מיקרוסקופיה דו-פוטונית להדמיה In Vivo של מיקרו-כלי דם במוח העכבר 

מקור: McCullagh, E. A., et al. יישום קוהרנטי של ספקטרוסקופיית רמאן אנטי-סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים הדמיה פלואורסצנטית וספקטרוסקופיה קוהרנטית של רמאן אנטי-סטוקס (CARS) כדי להמחיש ארכיטקטורה עצבית ברקמת מוח של מכרסמים. צביעת Nissl מסמנת גופי תאים על ידי קשירה ל-RNA ריבוזומלי, בעוד שהדמיית CARS מכוונת למיאלין עשיר בשומנים באמצעות אותות המושרים בלייזר. שכבת תמונות הקרינה וה-CARS מספקת תצוגה מפורטת של גופי תאים ואקסונים מיאליניים.

ספקטרוסקופיה קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן להדמיית נוירונים מיאליניים ברקמת מוח של עכבר

טראומה מוחית חריפה היא פגיעה חמורה שאין לה טיפול הולם עד כה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד אורכי התהליך של התפתחות טראומה המוחית חריפה וחיטוט אסטרטגיות טיפוליות במכרסמים. שני דגמים של טראומה מוחית חריפה למדה אצל בשני פוטונים הדמיה vivo של המוח הם הפגינו בפרוטוקול זה.

טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של ביומולקולות המבוססות על הרטט הפנימי שלהם של קשרים כימיים ספציפיים. בפרוטוקול זה, ההתקנה האינסטרומנטלית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של SRS ושני פוטונים מתוארת כדי לדמיין מבנים תאיים בחוט השדרה של עכברים חיים.

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) של פיזור קדם-תהודה אלקטרונית של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן היא פלטפורמה חדשה להדמיית חלבונים מבוססת אפיטופים מרובבים מאוד. כאן אנו מציגים מדריך מעשי הכולל הכנת נוגדנים, צביעת דגימת רקמות, הרכבת מיקרוסקופ SRS והדמיית רקמות epr-SRS.

הדמיית רקמות מרובבת מאוד עם צבעי ראמאן

הדמיה של מיאלינציה היא מטרה חשובה עבור חוקרים רבים החוקרים את מערכת העצבים. CARS היא טכניקה התואמת את האימונופלואורסצנציה שיכולה לדמות באופן טבעי שומנים בתוך רקמות כגון המוח המאיר מבנים מיוחדים כגון מיאלין.

יישום ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח

פרוטוקול זה מכיל תיאור מקיף של גישה שלב אחר שלב למודל עכבר חלון גולגולתי כרוני ותסחיף מיקרווסקולרי מותאם להדמיה מיקרוסקופית דו-פוטונית בתוך ה-vivo באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות.

מודל עכבר של תסחיף מיקרווסקולרי למיקרוסקופיה דו-פוטונית בחיים באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות

למדו הדמיית פיזור Raman מגורה בשני צבעים לאבחון רקמות בזמן אמת במוח עכבר. שיטה זו מאפשרת יצירת תמונות היסטולוגיות ללא צביעה או עיבוד רקמות, ומאיצה משמעותית את זמן הניתוח הקליני.

בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות

גלה סרטונים נוספים