חקר האינטראקציה הביומולקולרית בין המלווה המולקולרי Hsp90 לבין חלבון הלקוח שלו Kinase Cdc37 באמצעות טכנולוגיית ביוסנסינג בעלת אפקט שדה

FEB היא פלטפורמת זיהוי אינטראקציות _____ __ ללא תווית וחסכונית המציעה מדידות מהירות ומדויקות. שיטה זו מציעה אימות של אינטראקציות ידועות או לא ידועות ודרך קלה לבדוק מעכבים פוטנציאליים של האינטראקציות הביומולקולריות. היתרון העיקרי של FEB הוא התוכנה האוטומטית והידידותית למשתמש שלה, אשר משערת את המשתמש לאורך כל הניסוי עם פלטפורמת צנרת פתוחה ביד, ומאפשרת למשתמשים לעבוד עם מעט או אפילו ללא הכשרה.

טכנולוגיית FEB מציעה גם יישומים בתחומים מגוונים של תרופות, ניתוח ביומולקולרי של מולקולות קטנות, פפטידים וחלבונים, אימות תרופות על ידי תרגום פעילות ביולוגית חוץ גופית בקלות ליעילות in vivo. בהיותך מתחיל, אתה עלול להתמודד עם אתגרים בבחירת ריכוזי האנליט הנכונים כדי לייעל את הניסוי כדי לקבל ערך KD אמין. אנו ממליצים לתת תשומת לב לתהליך פונקציונליזציה של השבב ולהחלפת מאגר נכונה.

התחל על ידי ערבוב נפחים שווים של תמיסת EDC וסולפו-NHS על ידי צנרת למעלה ולמטה. מניחים את שבב הביוסנסור המסופק על ידי החברה בצלחת פטרי מזכוכית עם מכסה מותאם. כל שלבי הפונקציונליזציה הכרוכים בהפעלת שבבים מוצעים להיעשות בתוך צלחת פטרי.

החל 50 מיקרוליטרים של מאגר MES טוחן אחד על שבב הביוסנסור. דגירה לדקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את המאגר והחלו 50 מיקרוליטרים של תמיסת EDC sulfo-NHS באופן מיידי על שבב החיישן.

מכסים את צלחת הפטרי ודוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את פתרון ה-EDC sulfo-NHS מהשבב והחלו 50 מיקרוליטרים של מאגר MES טוחן אחד. שאפו למאגר MES ושטפו את השבב פעמיים עם 50 מיקרוליטרים של 1X PBS.

שאפו את ה-PBS מהשבב והוסיפו את מולקולת המטרה Hsp90. כסו את צלחת הפטרי מזכוכית ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו לתמיסה המכילה את מולקולת המטרה ושטפו שלוש פעמים עם 50 מיקרוליטרים של 1X PBS.

שאפו את פתרון ה-1X PBS מהשבב והוסיפו 50 מיקרוליטרים של פתרון ה-quench one. מכסים את צלחת הפטרי הזכוכית ודגורים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את תמיסת ה-quench One מהשבב והוסיפו 50 מיקרוליטרים של תמיסת quench two.

מכסים את צלחת הפטרי הזכוכית ודגורים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את תמיסת המרווה שתיים מהשבב ושטפו את השבב חמש פעמים באמצעות 50 מיקרוליטרים של 1X PBS והשאירו את טיפת ה-PBS האחרונה על החיישן. הכן את סדרת דילול האנליטים עבור Cdc37 בטווח הריכוז הרצוי.

תכנן את הניסוי כך שיכלול לפחות שמונה ריכוזי אנאליטים שונים כדי לקבל קבוע דיסוציאציה אמין, או ערך KD, והכן את הדילולים השונים האלה באותו מאגר המשמש לכיול וחלבון מטרה. הניחו את השבב בזהירות על המכשיר. ודא שהתוכנה דולקת ונורית ה- LED הופכת לירוקה.

לאחר מכן, לחץ על מודול הפעל ניסוי בתוכנה האוטומטית ובחר 10 נקודות עם התחדשות או כל פרוטוקול רצוי אחר. מלא את הפרטים כגון שם המפעיל, שם הניסוי, תאריך, מאגר ההתחדשות, המטרה המשותקת והאנליזה בתמיסה. לחץ על לחצן התחל ניסוי המוצג בתוכנה ופעל לפי ההוראות המוצגות על-ידי התוכנה האוטומטית.

כדי לבצע את כיול המכשיר, שאפו את פתרון ה-PBS הנותר מהשבב והחלו 50 מיקרוליטרים של מאגר הכיול. לחץ על לחצן המשך והמתן חמש דקות עד ששלב הכיול יסתיים. התוכנה מציגה את נקודת הקצה שנקבעה לשלב הכיול עם אזעקת אזהרה למעקב.

לאחר מכן, בצע קשר אנאליט על ידי שאיפת חיץ הכיול מהשבב והחלת 50 מיקרוליטרים של ריכוז האנאליטים הנמוך ביותר. לחץ על לחצן המשך והמתן חמש דקות עד לסיום שלב האסוציאציה. התוכנה מציגה את נקודת הסיום של שלב השיוך עם אזעקת אזהרה להמשך.

כדי לבצע דיסוציאציה אנאליטית, שאפו את תמיסת האנליט מהשבב והחלו 50 מיקרוליטרים של מאגר הדיסוציאציה. לחץ על לחצן המשך. לאחר משך שלב הדיסוציאציה, התוכנה מציגה את נקודת הקצה של שלב הדיסוציאציה באמצעות אזעקת אזהרה.

לאחר מכן, בצע התחדשות שבבים על ידי שאיפת פתרון הדיסוציאציה מהשבב והחלת 50 מיקרוליטרים של מאגר ההתחדשות. לאחר מכן, לחץ על הלחצן המשך. שלב ההתחדשות נמשך בדרך כלל כ-30 שניות עד לסיום.

לאחר מכן, התוכנה מציגה את נקודת הסיום של שלב ההתחדשות עם אזעקת אזהרה למעקב. לבסוף, כדי לשטוף את השבב, לשאוף את פתרון ההתחדשות מן השבב ולהחיל 50 microliters של חיץ לשטוף. לשאוף את הפתרון מן השבב ולחזור על זה חמש פעמים.

השאירו את הטיפה האחרונה של מאגר הכביסה על השבב. לאחר מכן, לחץ על המשך כפתור והמתן 30 שניות עד שמשך שלב הכביסה יסתיים בתצוגת התוכנה. חזור על השלבים עבור כל ריכוז אנאליט שבו נעשה שימוש.

חמשת השלבים של הכיול, הקשר האנליטי, הדיסוציאציה, ההתחדשות והשטיפה חמישה פעמים מהווים מחזור אחד. לחץ על לחצן ניתוח בתוכנת הניתוח האוטומטית בסוף הניסוי. יופיע חלון תצוגה המכיל את כל נקודות הניסוי.

ודא שריכוזי האנליטים המשמשים לפרוטוקול שנקבע נכונים. לחץ על לחצן הפעל ניתוח כדי ליצור את ערך ה- KD באופן אוטומטי. התוכנה יוצרת עלילת התאמה לגבעה על ידי התוויית ריכוזי האנאליטים כנגד תגובות ה-I המתאימות שמהן מחושב קבוע הדיסוציאציה בשיווי משקל.

חלבון המטרה Hsp90 היה משותק לשבב, ובניסוי הראשון הוכנו 10 ריכוזים של חלבון האנאליט Cdc37 שנעו בין 25 ננומולרים ל-5, 000 ננומולרים. קבצי הנתונים שנוצרו מניסוי אחד הוצגו כאן. נתוני הניסוי המנוטרים בזמן אמת מוצגים כאן.

ציר ה-Y מתאים לתגובת ה-I ביחידות הביו-סנסור, וציר ה-X מתאים לנקודות הזמן והריכוזים השונים של האנליט בניסוי. התמונה הגרפית המוצגת כאן מייצגת את עלילת ההתאמה לגבעה שנוצרה מתוכנת הניתוח האוטומטית. ציר ה-Y מתאים לתגובת ה-I ביחידות הביו-סנסור, וציר ה-X מתאים לריכוזי האנאליטים השונים בניסוי.

התמונה הגרפית המוצגת כאן מייצגת את עלילת האסוציאציה שנוצרה באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי. ציר ה-Y מתאים לתגובת ה-I בסוף שלב האסוציאציה, וציר ה-X מתאים לריכוזים השונים של ה-Cdc37 האנליטי. בניסוי השני נעשה שימוש במערך שונה של ריכוזים הנעים בין 0.4 ננומולאר ל-200 ננומולאר, וקבצי הנתונים שנוצרו מוצגים כאן.

התמונות הגרפיות מייצגות את התרמוגרמה של ITC של האינטראקציה Hsp90 ו- Cdc37. מוצגות כאן העקומות המקבילות המתפתחות בחום שהתקבלו עקב הזריקות הרצופות של Cdc37 לתוך Hsp90 ב-298.15 קלווין. הכוח הדיפרנציאלי המשמש כאן הוא פונקציה של הזמן.

נקודות הנתונים המשולבות בחלקה זו מייעדות את החום המנורמל המתאים לעומת יחס מולר של Hsp90 ל-Cdc37. גישת הצינורות הפתוחים המשמשת כאן דורשת מהמשתמש שליטה בסיסית בצינורות ידיים, תוך הקפדה שלא לגעת בביו-סנסור עם הקצה. יכולת השכפול של תזמון הצעד תלויה לחלוטין במשתמש.

ברגע שהחוקר מאפיין אינטראקציה בין שני ביומולקולות, אנו יכולים לבצע ניסוי סינון על ידי תכנון מעכבים פוטנציאליים או מודולטורים המכוונים לאינטראקציה הביומולקולרית הספציפית באמצעות מערכת FEB. ניתן להשתמש בהליך זה כדי לזהות, לאמת ולכמת אינטראקציה ידועה וחדשנית בין חלבונים, כמו גם מולקולות קטנות, כולל תרופות ופפטידים.