Name: אפיון תלת מימדי של אתרי מגע בין-אורגניים בהפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חתך טורי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: למד אפיון תלת ממדי של אתרי מגע בין אברונים בהפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חתך טורי. שיטה זו מאפשרת חקר מורפולוגיה ואינטראקציות תאיות ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג'ואנה הנלי, רבקה פיאדיירו ואניה סטראטמן-איוונובסקה על סיוע טכני מומחה. אנו מודים גם לחברי המעבדה של סטפן ולאיאן ג'יי ווייט על דיונים מועילים. J.J.B. נתמך על ידי מימון MRC למעבדת MRC לביולוגיה מולקולרית של התא ב- UCL, קוד הפרס MC_U12266B. C.J.S. נתמך על ידי מימון MRC ליחידה האוניברסיטאית של מעבדת MRC לביולוגיה מולקולרית של התא ב- UCL, קוד פרס MC_UU_00012/6. P.G. ממומן על ידי המועצה האירופית למחקר, קוד מענק ERC-2013-StG-337057.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

טכניקת vEM נגישה להדמיה של מבנה אברונים ואינטראקציות בתלת-ממד מתוארת בפרוטוקול זה. המורפולוגיה של מגעים בין-אורגניים בהפטוציטים מוצגת כמקרה בוחן כאן. עם זאת, גישה זו יושמה גם כדי לחקור מגוון דגימות ותחומי מחקר אחרים, כולל אינטראקציות של תאי שוואן-אנדותל בעצבים היקפיים45, ביוגנזה של גוף וייבל פאלאדה בתאי אנדותל46, הפרשת מטען בתאי כליה47, ומורפולוגיה של סינפסה בתאי עצב בהיפוקמפוס48 . כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של הכבד, ניתן...

מאז המצאתם בשנות ה-30 של המאה ה-20, מיקרוסקופי אלקטרונים אפשרו לחוקרים לדמיין את המרכיבים המבניים של תאים ורקמות 1,2. רוב החקירות סיפקו מידע דו-ממדי, שכן בניית מודלים תלת-ממדיים דורשת איסוף מקטעים סדרתיים קפדניים, צילום ידני, עיבוד שלילי, מעקב ידני, יצירה והרכבה של מודלים תלת-ממדיים מיריעות זכוכית, פלסטיק או קלקר 3,4. כמעט 70 שנה לאחר מכן, חלה התקדמות ניכרת בהיבטים רבים של התהליך, החל מביצועי מיקרוסקופ, איסוף מקטעים סדרתיים, הדמיה דיגיטלית אוטומטית, תוכנה וחומרה מתוחכמות לשחזור תלת-ממדי, הדמיה וניתוח וכלה בגישות חלופיות למה שמכונה כיום ביחד VOLUME EM (vEM). טכניקות vEM אלה נחשבות בדרך כלל כמספקות מידע אולטרה-סטרוקטורלי תלת-ממדי ברזולוציות ננומטר על פני קני מידה של מיקרון וכוללות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) וטכניקות חדשות יותר של מיקרוסקופ אלקטרונים סורקים (SEM); ראה חוות דעת 5,6,7,8.
לדוגמה, קרן יונים ממוקדת SEM (FIB-SEM) משתמשת בקרן יונים ממוקדת בתוך SEM כדי לכרסם את פני השטח של הבלוק בין סריקות הדמיה SEM עוקבות של פני השטח של הבלוק, מה שמאפשר כרסום/הדמיה אוטומטיים חוזרים ונשנים של דגימה ובניית מערך נתונים תלת-ממדי לשחזור 9,10. לעומת זאת, SEM של פני בלוקים טוריים (SBF-SEM) משתמש ב- ultramicrotome בתוך ה- SEM כדי להסיר חומר מפני הבלוק לפני ההדמיה 11,12, בעוד שטומוגרפיה של מערך היא תהליך לא פולשני הדורש איסוף של מקטעים טוריים, על כיסויים, ופלים או קלטת, לפני הגדרת זרימת עבודה אוטומטית של הדמיית אזור העניין בקטעים רציפים ב- SEM כדי ליצור את ערכת הנתונים התלת-ממדית13 . בדומה לטומוגרפיה של מערך, מקטע טורי TEM (ssTEM) דורש איסוף מקטעים פיזיים לפני ההדמיה; עם זאת, מקטעים אלה נאספים ברשתות TEM ומצטלמים ב- TEM 14,15,16. ניתן להרחיב את ssTEM על ידי ביצוע טומוגרפיה הטיה 17,18,19. טומוגרפיה של הטיה טורית מספקת את הרזולוציה הטובה ביותר ב-x, y ו-z, ובעוד שהיא שימשה לשחזור תאים שלמים20, היא מאתגרת למדי. פרוטוקול זה מתמקד בהיבטים המעשיים של ssTEM כטכניקת ה- vEM הנגישה ביותר הזמינה למעבדות EM רבות שאולי אין להן כרגע גישה למקטעים מיוחדים או למכשירי vEM, אך ייהנו מיצירת נתוני vEM תלת-ממדיים.
אולטרה-מיקרוטומיה סדרתית לשחזור תלת-ממדי נחשבה בעבר למאתגרת. היה קשה לגזור סרטים ישרים בעובי חתך אחיד, להיות מסוגלים לסדר ולאסוף סרטים בגודל הנכון, בסדר הנכון, לרשתות עם תמיכה מספקת, אך ללא פסי רשת המסתירים אזורי עניין, והכי חשוב, מבלי לאבד קטעים, שכן סדרה לא שלמה עשויה למנוע שחזור תלת-ממדי מלא21. עם זאת, שיפורים באולטרה-מיקרוטומים מסחריים, סכיני חיתוך וגיזום יהלומים22,23, יריעות תמיכה בבלוטת אלקטרונים ברשתות21,24, ודבקים לסיוע בהדבקת מקטעים ושימור סרטים13,21 הם רק חלק מההתקדמות המצטברת לאורך השנים שהפכה את הטכניקה לשגרתית יותר במעבדות רבות. לאחר איסוף מקטעים סדרתיים, הדמיה סדרתית ב- TEM היא פשוטה ויכולה לספק תמונות EM עם גדלי px תת-ננומטריים ב- x ו- y, מה שמאפשר חקירה ברזולוציה גבוהה של המבנים התת-תאיים - דרישה פוטנציאלית לשאלות מחקר רבות. מחקר המקרה שהוצג כאן מדגים את השימוש ב- ssTEM ו- 3D שחזור במחקר של מגעים אנדופלסמיים מסוג רטיקולום (ER) - אברונים בהפטוציטים בכבד, שם נצפו לראשונה מגעי ER-אברונים25,26.
בעודו רציף עם המעטפת הגרעינית, ה-ER גם יוצר קשרים הדוקים עם אברוני תאים רבים אחרים, כולל ליזוזומים, מיטוכונדריה, טיפות שומנים וקרום פלזמה27. מגעי ER-אברונים היו מעורבים בחילוף החומרים של השומנים28, פוספוינוסיטיד ואיתות סידן29, ויסות אוטופגיה ותגובת עקה30,31. המגעים בין ER-אברונים ומגעים בין-אורגנטיים אחרים הם מבנים דינמיים מאוד המגיבים לצרכים מטבוליים תאיים ולרמזים חוץ-תאיים. הודגם כי הם משתנים מבחינה מורפולוגית בגודלם ובצורתם ובמרחקים שבין ממברנות אברונים32,33. ההערכה היא שהבדלים אולטרה-סטרוקטורליים אלה עשויים לשקף את הרכבי החלבון/שומנים השונים שלהם ולתפקד34,35. עם זאת, זו עדיין משימה מאתגרת להגדיר אנשי קשר בין-אורגניים ולנתח אותם36. לפיכך, נדרש פרוטוקול אמין אך פשוט לבחינה ואפיון של מגעים בין-אורגניים לצורך חקירות נוספות.
מכיוון שמגעי ER-אברונים יכולים לנוע בין 10 ל-30 ננומטר בהפרדת ממברנה לממברנה, תקן הזהב לזיהוי היה באופן היסטורי TEM. TEM בעל חתך דק חשף לוקליזציה ספציפית של תת-דומיינים עבור חלבוני ER תושבים במגעי ממברנה שונים37. באופן מסורתי, זה חשף מגעים ER-אברוניים עם רזולוציית nm, אך לעתים קרובות הציג רק תצוגה דו-ממדית של אינטראקציות אלה. עם זאת, גישות vEM חושפות את ההצגה וההקשר האולטרה-סטרוקטורליים של אתרי קשר אלה בתלת-ממד, ומאפשרות שחזור מלא של אנשי קשר וסיווג מדויק יותר של אנשי קשר (נקודה לעומת צינורית לעומת דמוית ציסטרנל) וכימות38,39. בנוסף להיותו סוג התא הראשון שבו נצפו מגעי ER-אברונים25,26, להפטוציטים יש מערכת נרחבת של מגעים בין-אורגניים אחרים המשרתים תפקידים חיוניים בארכיטקטורה ובפיזיולוגיה שלהם28,40. עם זאת, אפיון מורפולוגי יסודי של ER-אברון ומגעים בין-אורגניים אחרים בהפטוציטים עדיין חסר. לפיכך, האופן שבו נוצרים קשרים בין-אורגניים ומשתפצים במהלך התחדשות ותיקון רלוונטי במיוחד לביולוגיה של הפטוציטים ולתפקוד הכבד.

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; m מסנן מזרק</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>מגשי אלומיניום</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3912</td><td></td></tr><tr><td>Amira v6</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td></td><td>פישר C/4960/PB08</td><td></td></tr><tr><td>DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride</td><td>TAAB</td><td>T027</td><td>Epon מרכיב</td></tr><tr><td>סכין יהלום</td><td>DiaTOME</td><td>אולטרה 45&deg;</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30 / 2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) פנול</td><td>TAAB</td><td>D032</td><td>Epon מרכיב</td></tr><tr><td>פינצטה Dumont N5</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5293</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://imagej.net/ Fiji TrakEM2 plugin</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr> <tr><td>פורמלדהיד 36% תמיסה</td><td>TAAB</td><td>F003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar רשת חריץ מצופה</td> אלטרנטיבה <td>תוצרת בית</td><td></td><td>: EMS diasum (FF2010-Cu)</td></tr> <tr><td>בקבוק זכוכית עם מוט מוליך</td><td>Medisca</td><td>6258</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15364769</td><td></td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד 25% תמיסה</td><td>TAAB</td><td>G011</td><td></td></tr><tr><td>MNA/Methyl Nadic Anhydride</td><td>TAAB</td><td>M011</td><td>מרכיב Epon</td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד 2% פתרון</td><td>TAAB</td><td>O005</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן Ferricyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת פרופילן</td><td>פישר מדעי</td><td>E/0050/PB08</td><td></td></tr><tr><td>דבק רב פעמי</td><td>כחול טאק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ריינולדס עופרת ציטראט</td><td>TAAB</td><td>L037</td><td>כתם</td></tr><tr><td>חתך נתרן קקודילאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C-0250</td><td>ל הכינו 0.1 M Caco buffer</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>RS Components</td><td>918-6872</td><td>דבק ציאנואקרילט, שלב 1.3</td></tr><tr><td>TAAB 812 שרף</td><td>TAAB</td><td>T023</td><td>מרכיב Epon</td></tr><tr><td>חומצה טאנית</td><td>TAAB</td><td>T046</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>שני חלקים שרף אפוקסי</td><td>RS רכיבי</td><td>132-605</td><td>אלטרנטיבה: שלב 2.13</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>UC7</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום רוטט</td><td>Leica</td><td></td><td>100 ומיקרו; פרוסות בעובי M, חיתוך של 0.16 מ"מ לשנייה במשרעת של 1 מ"מ.</td></tr><tr><td>מלט מגע מקורי של</td><td>Weldwood DAP</td><td>107</td><td>דבק מגע: שלב 3.1.4</td></tr></tbody></table>

אפיון תלת מימדי של אתרי מגע בין-אורגניים בהפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חתך טורי

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

מיקרוסקופיית אלקטרונים של תמסורת נחשבת זה מכבר לתקן הזהב להדמיה של מבנה-על תאי. עם זאת, האנליזה מוגבלת לעתים קרובות לשני ממדים, מה שמקשה על היכולת לתאר באופן מלא את המבנה התלת-ממדי (התלת-ממדי) ואת הקשר התפקודי בין האברונים. מיקרוסקופיית אלקטרונים בנפח (vEM) מתארת אוסף של טכניקות המאפשרות חקירה של מבנה-על תאי בתלת-ממד ברזולוציות מזוקליות, מיקרו-קנה מידה וננומטריות. 
פרוטוקול זה מספק שיטה נגישה וחזקה להשגת נתוני vEM באמצעות EM (TEM) של העברת מקטעים טוריים ומכסה את ההיבטים הטכניים של עיבוד דגימות עד לשחזור תלת-ממדי דיגיטלי בתהליך עבודה יחיד ופשוט. כדי להדגים את התועלת של טכניקה זו, מוצג הקשר האולטרה-סטרוקטורלי התלת-ממדי בין הרשתית האנדופלסמית והמיטוכונדריה לבין אתרי המגע שלהם בהפטוציטים בכבד. מגעים בין-אורגניים ממלאים תפקידים חיוניים בהעברת יונים, שומנים, חומרים מזינים ומולקולות קטנות אחרות בין אברונים. עם זאת, למרות הגילוי הראשוני שלהם בהפטוציטים, עדיין יש הרבה מה ללמוד על התכונות הפיזיות שלהם, הדינמיקה והתפקודים שלהם. 
אנשי קשר בין-אורגניים יכולים להציג מגוון של מורפולוגיות, המשתנות בסמיכות של שני האברונים זה לזה (בדרך כלל ~ 10-30 ננומטר) ובהיקף אתר המגע (החל מאנשי קשר נוקבים וכלה באנשי קשר תלת-ממדיים גדולים יותר דמויי ציסטרנל). בדיקת מגעים קרובים דורשת הדמיה ברזולוציה גבוהה, ו- TEM מקטע סדרתי מתאים היטב כדי לדמיין את האולטרה-סטרוקטורל התלת-ממדי של מגעים בין-אורגניים במהלך התמיינות הפטוציטים, כמו גם שינויים בארכיטקטורת הפטוציטים הקשורים למחלות מטבוליות.

עבור טכניקה זו, אזורי עניין נבחרים על סמך מטרת המחקר הביולוגי וזוהו לפני חיתוך וחיתוך של רקמות משובצות. באופן דומה, גודל פני הבלוק עשוי להיות מוכתב על ידי שאלת המחקר; במקרה זה, הדגימה נחתכה כדי להשאיר פני בלוק של כ-0.3 מ"מ x 0.15 מ"מ (איור 4A). זה איפשר שתי רשתות של 9 מקטעים טוריים לכל רשת, סיפקו 18 מקטעים טוריים ושילבו נפח של רקמת כבד בנפח של כ-62 מיקרומטר3 (316 מיקרומטר x 150 מיקרומטר x 1.3 מיקרומטר). נפח זה הספיק כדי לאפשר שחזור תלת-ממדי מלא של מיטוכונדריה בודדת ברקמת הכבד....

פרוטוקול פשוט ומקיף לרכישת פרטים תלת מימדיים של אתרי מגע ממברנה בין אברונים בהפטוציטים מהכבד או תאים ברקמות אחרות.

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

פרוטוקול זה מאפשר שחזור תלת-ממדי של אברונים בצורה פשוטה וחזקה, תוך שהוא נגיש למעבדות שאין להן כיום מיקרוסקופים של אלקטרונים בנפח מומחה. טכניקה זו גמישה ביותר, ומספקת רזולוציית X/Y מצוינת, תוך היכולת לצלם מחדש דגימות במידת הצורך. הוא גם תואם לטומוגרפיה של הטיה כאשר נדרשת רזולוציית Z גבוהה מאוד.טכניקה זו מאפשרת חקירות של מורפולוגיה אברונית בהקשר בין-אברוני. לכן, ניתן להרחיב אותו כדי לבחון כל מצב פתולוגי עם פגמים אברוניים. גישה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות אברונים ואירועי סחר בתאים.שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על רקמות אחרות, מודלים אורגנואידים, ומערכות תרביות תאים, בנוסף hepatocytes. משתמשים בפעם הראשונה עשויים למצוא חתך סדרתי ולהרים מאתגרים ללא אובדן. מומלץ להיות בקיאים בחתך דק במיוחד רגיל לפני החלת פרוטוקול זה על מדגם יקר ערך.התחל על ידי חיתוך קפדני של הרקמה המוטבעת בשרף באמצעות סכין גילוח כאשר הדגימה נעולה במתאם הזמירה. העבר את תיבת הדגימה יחד עם הצ'אק והדגימה לזרוע הדגימה של המיקרוטום ומיקם את ארון הדגימה כך שטווח הנסיעה של התיבה יעבור מלמעלה למטה. מניחים ונועלים את סכין היהלום במחזיק הסכין, ומבטיחים שזווית החיתוך של הסכין מוגדרת כראוי.נעל את מחזיק הסכינים לתוך הבמה בצורה מאובטחת. כבו את תאורת הבמה, הפעילו את תאורת הבמה, הזיזו בזהירות את הסכין לכיוון הדגימה, תוך כוונון מתמיד של הזווית הצידית של הסכין, הטיית הדגימה וסיבוב הדגימה על ידי התאמת הידיות הרלוונטיות עד שפני הבלוק מיושרים לקצה הסכין. הגדר את החלק העליון והתחתון של חלון החיתוך של זרוע הדגימה והשאר את הדגימה ממש מתחת לקצה הסכין.מלאו את סירת הסכינים במים נקיים ומזוקקים פעמיים וודאו כי פני המים מתואמים עם קצה הסכין וקעורים מעט. לאחר מכן, התחל לחתוך חלקים. עצרו את החיתוך רגע אחרי שהדגימה עברה את קצה הסכין.השתמש ברשת חריצים ריקה כדי להעריך את מספר המקטעים שיש לאסוף בכל רשת. באמצעות ריסים בכל יד, חלקו בעדינות את הסרט לסרטים קטנים יותר שיכולים להתאים לאורך רשת החריצים. רשום הערה מנטלית של מיקומם היחסי בתוך המדגם.באמצעות מוט אפליקטור מזכוכית, רחפו טיפה של כלורופורם מעל החלקים כדי לשטח אותם החוצה. הרימו את רשת החריצים הריקה הראשונה עם המלקחיים הממוספרים הראשונים וטבלו אותה בעדינות בטריטון X-100 ולאחר מכן פעמיים במים המזוקקים. השתמש בפיסת נייר סינון כדי להסיר את עודפי המים מקצה המלקחיים.באמצעות מלקחיים, הורידו בעדינות כ-2/3 מרשת החריצים המצופה בפורמבר לתוך המים של סירת הסכינים. ודאו שצד הפורמבר פונה כלפי מטה והקצה הימני הארוך של החריץ נמצא על פני המים ומקביל לשפת המים. סובבו בעדינות את הרשת במים לכיוון הסרטים, כך שעם השבץ החוזר, המקטעים נסחפים לכיוון הרשת.המשך לעשות זאת בתנועות קטנות יותר ויותר, עד שהקצה הימני של הסרט יתיישר עם הקצה הימני של החריץ. לאחר מכן, עם ה-waft האחרון, העלו בעדינות את הרשת למעלה כדי לאסוף את החלקים לרשת החריץ. הניחו מספר כדורים של נתרן הידרוקסיד מתחת למכסה צלחת פטרי כדי לספק סביבה נטולת פחמן דו-חמצני.לאחר מכן, בזהירות פיפטה 40-מיקרוליטר טיפות של ציטראט עופרת של ריינולד על הפרפילם, טיפה אחת לכל רשת. הופכים כל רשת על טיפת העופרת ציטראט ומשאירים מוגנים על ידי מכסה צלחת פטרי למשך 7 עד 10 דקות. בזמן שהרשתות מכתימות, הניחו חמש טיפות של מים מזוקקים בערך 300 מיקרוליטר לכל רשת על הפרפילם.בסוף הדגירה של עופרת ציטראט, מעבירים כל רשת לטיפת מים מזוקקים כדי לשטוף אותה במשך דקה אחת מבלי לנשום ישירות ברשתות. חזור על כך ארבע פעמים נוספות. השתמש במלקחיים מוצלבים ממוספרים כדי להרים את הרשת הראשונה.גע בקצה הרשת כדי לסנן נייר כדי לפתות את רוב המים ולאפשר לייבש את המלקחיים במשך 20 דקות לפחות. חזור על פעולה זו עבור כל רשת. בהגדלה נמוכה, שימו לב לסדר, למיקום ולמיקום של המקטעים הטוריים.נווט אל החלק האמצעי של הסדרה ברשת. עיין במדגם וזהה אזור עניין. לאחר מכן, התבונן במדגם בהגדלה הרצויה.שקול לאסוף את הסדרה בהגדלה מעט נמוכה יותר, מכיוון שלעתים קרובות החלקים אינם מיושרים בצורה מושלמת, וייתכן שיהיה צורך לחתוך תמונות מאוחר יותר. לאחר מכן, צלם תמונות הפניה בהגדלה נמוכה יותר. זה יעזור להעריך את ההקשר של אזור העניין, זה מיקום גס בהגדלות שונות ביחס לגבולות המקטע, ותכונות ציון דרך בתוך המדגם.השתמש בהם כדי לסמן את אזור העניין בסעיפים אחרים. עבור הפניה למסך, השתמש במרק דבק רב-פעמי, במדבקות או בפיסת נייר מקרן תקורה המודבקת על המסך כדי להציב טושים זמניים על המסך. זה יאפשר לדמיין מחדש באופן שגרתי את אותן תכונות של אזור העניין במרכז התמונה לאורך כל מערך הנתונים.פתחו את מחסנית התמונות, ציינו את מדידות הווקסל ובחרו בכרטיסיה 'סגמנטציה' כדי להתחיל בסגמנטציה. לחץ על חדש בחלונית עורך הפילוח כדי להגדיר אובייקטים חדשים ברשימת החומרים. לחץ לחיצה ימנית כדי לשנות את צבע האובייקט ולחץ פעמיים כדי לשנות את שם האובייקט.עבור סגמנטציה ידנית, בחר בכלי הפילוח שמתחת לרשימת החומרים ובחר בכלי המברשת המוגדר כברירת מחדל כדי להדגיש את הפיקסלים. תמונת מיקרוסקופיית האלקטרונים של שני הפטוציטים מנוגדים מוצגת כאן. הדמיית הגדלה גבוהה יותר מאפשרת תצפית על הפרטים המורפולוגיים של האברונים השונים ברזולוציה ננומטרית.התמונה הייצוגית מציגה את הגרסה המקוטעת של אותה טומוגרמה, עקבות של הרשתית האנדופלסמית, המיטוכונדריה והמגעים הבין-ממדיים בין ה-ER למיטוכונדריה של מרחבים שונים מוצגים כאן. התמונה הייצוגית מציגה שכבת אורתו-פרוסה מוטה עם עקבות סגמנטציה ומיקומה היחסי בתוך המיטוכונדריה כולה. שחזור תלת-ממדי של האברונים המפולחים והמגעים האנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בזוויות שונות מוצגים כאן.מכיוון שפרוטוקול זה תואם לטומוגרפיה של הטיה כאשר נדרשת רזולוציית Z גבוהה מאוד, הוא מסייע לפתור מבנים קטנים או מפותלים. טכניקה זו מושלמת להערכה ראשונית של הקשר המרחבי בין אברונים שונים, ולכן שימושית במיוחד בתחום המתקדם של מגעי ממברנה בהומאוסטזיס של הממברנה.

three-dimensional-characterization-interorganelle-contact-sites

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המחקר בתאי הכבד סינוסי אנדותל (שניות) חייב להתבצע עם תאים ראשוניים שהתקבלו החיה לא כמו שורות תאים קיימות. שיטה זו מסתמכת על מערכת העיכול הכבד צנטריפוגה ההפרש לטיהור SEC עבור culturing ניסויים עתידיים.

ב אנדוציטוזה כבד vivo ואחריו טיהור בתאי הכבד על ידי זלוף כבד

פרוטוקול זה מטרות תאים ספציפיים ברקמות עבור הדמיה ברזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). תחילה עם תמונה של מספר גדול של טורי מקטעים של שרף-מוטבע בחומר ביולוגי במיקרוסקופ אור כדי לזהות את המטרה ולאחר מכן באופן היררכי ב- SEM.

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד של העכבר hepatocytes מתוך כבדי העכבר למבוגרים באמצעות שונה קולגן הטכניקה הפרו הפרזיה. גם תיאר הוא התרבות ארוכת טווח של hepatocytes בקביעת כריך קולגן תלת-ממד, כמו גם immunolabeling של מרכיבים ציטושלד לחקר היווצרות המרה והתגובה שלה לטיפול.

בידוד וכריך קולגן 3D תרבות של העכבר הראשי Hepatocytes כדי ללמוד את התפקיד של שלד ציטוזה היווצרות של המרה בתוך מחוץ לגופית

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה פשוטה ונגישה להמחיש, לכמת, ומיפוי תאים חיסוניים ב-formalin-קבוע פרפין מוטבע רקמת הגידול סעיפים. מתודולוגיה זו משלבת הדמיה קיימת טכניקות ניתוח דיגיטלי עם המטרה של הרחבת יכולת ריבוב וניתוח רב פרמטרים של הדמיה מספר.

הדמיה, קוונפיקציה, ומיפוי של אוכלוסיות תאים החיסונית במיקרו סביבה הגידול

הצורך בגישות חדשות לחקר אתרי מגע עם ממברנות (MCS) גדל עקב העניין הגובר בחקר מבנים תאיים אלה ומרכיביהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיות מיקרוסקופיה שהיו זמינות בעבר כדי לזהות ולכמת קומפלקסים של חלבונים תוך-אברונים ובין אברונים השוכנים ב-MCS.

ויזואליזציה וכימות של אינטראקציות חלבון תוך-אברוני אנדוגניות באתרי קשר של ER-מיטוכונדריה על ידי מבחני קשירת קרבה

פרוטוקול זה מתאר את היצירה של אורגנואידים אנדודרמליים בכבד (eHEPOs) מהירים וניתנים לשחזור. בעזרת פרוטוקול זה, ניתן לייצר eHEPOs תוך שבועיים ולהתרחב לטווח ארוך (יותר משנה) מבלי לאבד את הבידול והפונקציונליות שלהם.

יצירת אורגנואידים פונקציונאליים בכבד אנדודרמלי

טומוגרפיה Cryo-STEM מספקת אמצעי לדמיין אברונים של תאים שלמים ללא הטבעה, חתך או תכשירים פולשניים אחרים. הרזולוציה התלת-ממדית המתקבלת נמצאת כיום בטווח של ננומטרים בודדים, עם שדה ראייה של מספר מיקרומטרים ועובי נגיש בסדר גודל של 1 מיקרומטר.

הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיקרוסקופ אור-אלקטרונים מתאמי אופטימלי על חתך המבוסס על תיוג אנדוגני פלואורסצנטי ככלי לחקר לוקליזציה של חלבונים נדירים ביחס לאולטרה-מבנה תאי. כוחה של גישה זו מודגם על ידי לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני בתאים מורעבים ללא טיפול Bafilomycin.

לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני על ידי מיקרוסקופ אור-אלקטרונים קורלטיבי בחתך

פרוטוקול זה מתאר כיצד לשחזר כריסטה מיטוכונדריאלית כדי להשיג הדמיה תלת-ממדית בדיוק גבוה, ברזולוציה גבוהה ובתפוקה גבוהה.

טכניקה תלת מימדית להדמיה של שינויים אולטרה-מבניים מיטוכונדריאליים בתאי סרטן הלבלב

פרוטוקול זה מציג צינור הדמיה מקיף להמחשה ומידום מורפולוגיית תאי כוכב כבדיים ברקמת כבד שלמה. גישה זו משלבת תיוג פלואורסצנטי של פיברובלסטים באמצעות גנטיקה של עכברים, הכנת רקמה מבוססת פרפוזיה בכבד במקום , ושיטת ניקוי רקמות iDISCO מותאמת להשגת שקיפות אופטית.

מיפוי מורפולוגיית תאי כוכב כבדיים במודלים של עכברים של פיברוזיס כבד

למד אפיון תלת ממדי של אתרי מגע בין אברונים בהפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חתך טורי. שיטה זו מאפשרת חקר מורפולוגיה ואינטראקציות תאיות ברזולוציה גבוהה.

אפיון תלת מימדי של אתרי מגע בין-אורגניים בהפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חתך טורי

גלה סרטונים נוספים