Name: משקעי חלבון אורגניים מבוססי ממסים לטיהור פרוטאום חזק לפני ספקטרומטריית מסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: למד שיטת משקעי חלבון אורגניים מבוססי ממסים לטיהור פרוטאום יעיל לפני ספקטרומטריית מסה. הפרוטוקול ממוטב לביצוע מהיר ומספק שחזור גבוה וטוהר עקבי של חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה. המחברים מודים לביואינפורמטיקה סולושנס בע"מ (ווטרלו, קנדה) ול-SPARC BioCentre (אנליזה מולקולרית) בבית החולים לילדים חולים (טורונטו, קנדה) על תרומתם לרכישת נתוני טרשת נפוצה.

1. שיקולים חומריים והכנה לדוגמה מראש
<ol><li>השתמש רק בממסים בטוהר גבוה (אצטון, כלורופורם, מתנול) (>99.5%) ובכימיקלים, ללא לחות עודפת.</li>
	<li>מכינים תמיסות נתרן כלורי ואבץ גופרתי (1 M) במים. הערה: ניתן לאחסן תמיסות מלח ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר, כל עוד הן נקיות מזיהומים או מצמיחה מיקרוביאלית.</li>
	<li>השתמש בבקבוקון המיקרו-צנטריפוגה הקטן ביותר של פוליפרופילן (PP) המספיק כדי לשמור על נפח הדגימה והממסים הנדרשים כדי לגרום למשקעים.</li>
	<li>ודא שריכוז ה-SDS במדגם שיש לזרז אינו עולה על 2% (w/v). אם SDS גבוה יותר, דיללו את הדגימה במים.</li>
	<li>הקפידו על ריכוז חלבון בין 0.01 ל-10 גרם לליטר ליעילות משקעים אופטימלית. הערה: המסה האופטימלית למשקעים נעה בין 1-100 מיקרוגרם חלבון.</li>
	<li>ודא שכל הממסים והפתרונות נקיים מחומר חלקיקי לפני השימוש. בצע סינון (<0.5 מיקרומטר) או שלב צנטריפוגה (10,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר) כדי להסיר חלקיקים לא פתורים.</li>
	<li>אם נדרשת הפחתת קשרים דיסולפידיים ואלקילציה, בצעו את השלבים הבאים לפני משקעי החלבון. עודף ריאגנטים מפחיתים ואלקילטיים יוסרו בתהליך המשקעים.</li>
	<li>זרז את החלבונים על ידי בחירה וביצוע של אחד הפרוטוקולים (שלבים 2, 3, 4 או 5).</li>
</ol>2. משקעי חלבון מהירים (על בסיס בקבוקון) עם אצטון
<ol><li>Pipet 90 μL של חלבון (ללא חלקיקים) או תמיסת פרוטאום לתוך צינור מיקרוצנטריפוג PP. לאחר מכן, הוסף 10 μL של 1 M NaCl מימי. הערה: אם העוצמה היונית של תמצית הפרוטאום כבר עולה על 100 mM, אין צורך במלח נוסף.</li>
	<li>Pipet 400 μL של אצטון לתוך הדגימה. מכסים את הבקבוקון ומקישים על הבקבוקון בעדינות כדי לשלב את הממסים. ערבוב נמרץ אינו נדרש. הערה: ניתן להגדיל את נפח החלבון, המלח והאצטון כל עוד נשמר היחס היחסי של כל אחד מהם.</li>
	<li>אפשרו לבקבוקון לדגור בטמפרטורת החדר, באין מפריע, למשך 2 דקות לפחות. הערה: דגירות ארוכות יותר, כולל אלה בטמפרטורה מופחתת (למשל, משקעי אצטון קונבנציונליים משתמשים במשקעי לילה במקפיא), עשויים לגרום להיווצרות של חלקיקי חלבון מצטברים גדולים יותר (גלויים לעין) (איור 1A), שבדרך כלל אינם משפרים את התאוששות החלבון הכוללת.</li>
	<li>לאחר הדגירה, למקם דגימות בצנטריפוגה, תוך ציון כיוון הבקבוקון. סובבו למשך 2 דקות לפחות, בטמפרטורה של 10,000 x g ומעלה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שחררו את הבקבוקון ופרקו בעדינות את ה-supernatant על ידי היפוך איטי של הבקבוקון למיכל פסולת. גע בבקבוקון ההפוך במגבת נייר כדי לשאוב שאריות ממס מהבקבוקון. אזהרה: יש לשמור ולהשליך ממסים לפסולת בהתאם לפרוטוקולים המתאימים.</li>
	<li>עבור דגימות המכילות SDS, מחלקים 400 μL של אצטון טרי, נזהרים שלא להפריע לכדור. הערה: שלב 2.6 הוא אופציונלי.<ol><li>מיד צנטריפוגה של הדגימה (10,000 x g ומעלה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר), ומניחים את הבקבוקון לתוך הרוטור באותו כיוון כמו הספין הראשוני. דקאנט את ממס הכביסה כמתואר בשלב 2.5.</li>
	</ol></li>
	<li>אפשרו לדגימה להתייבש באופן מלא כשהכובע פתוח (כדקה אחת). לסכם את הבקבוקון ולהמשיך עם סולוביליזציה של כדוריות (שלב 6).</li>
</ol>3. משקעים של פפטידים במשקל מולקולרי נמוך (LMW) (ZnSO4 + אצטון)
<ol><li>מחלקים 54 μL של תמצית פרוטאום לבקבוקון 2 מ"ל PP, ולאחר מכן מוסיפים 6 μL של 1 M ZnSO4. הערה: התאוששות אופטימלית של פפטידי LMW (≤5 kDa) מתקבלת על ידי הוספת אצטון ל-97% הסופי לפי נפח. בהנחה של בקבוקון PP של 2 מ"ל, נפח הדגימה הראשוני המקסימלי הוא 54 μL.</li>
	<li>הוסף 1940 μL של אצטון ל-97% סופי לפי נפח. מערבלים בעדינות כדי לערבב, ומניחים לעמוד באין מפריע על הספסל למשך 2 דקות לפחות.</li>
	<li>צנטריפוגה (10,000 x g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר) ולהסיר את supernatant על ידי היפוך הבקבוקון, ולאחר מכן לגעת בקבוקון למגבת נייר.</li>
	<li>עבור דגימות המכילות SDS, מחלקים 400 μL של אצטון טרי, נזהרים שלא להפריע לכדור. הערה: שלב 3.4 הוא אופציונלי.<ol><li>מיד צנטריפוגה של הדגימה לפי שלב 3.3, תוך הצבת הבקבוקון לתוך הרוטור באותו כיוון כמו הספין הראשוני. נקו את ממס הכביסה כמתואר בשלב 3.3.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לסלול מחדש את הכדור היבש שנוצר בממס מימי עם מערבולת קצרה או סאונדציה (כ-5 דקות).</li>
</ol>4. משקעי חלבון על ידי כלורופורם/מתנול/מים (CMW)
<ol><li>מחלקים 100 μL של תמיסת החלבון או הפרוטאום לבקבוקון PP. מוסיפים 400 μL של מתנול, ואחריו 100 μL של כלורופורם. מכסים את הבקבוקון והמערבולת לזמן קצר כדי לערבב. הערה: עבור משקעי CMW, עדיפות לבקבוקונים של 1.5 מ"ל עם תחתית צרה (איור 2A). אזהרה: יש לטפל בממס כלורופורם במכסה אוורור מתאים. יש להתייחס לכל הממסים המגעים עם כלורופורם כאל פסולת הלוגנית כאשר הם מושלכים.</li>
	<li>מחלקים במהירות 300 μL של מים ישירות למרכז הבקבוקון. מכסה את הבקבוקון. אפשרו לדגימה לשבת על הספסל באין מפריע במשך דקה אחת. הערה: הפתרון ייראה מיד לבן מעונן. הימנעו מערבוב הבקבוקון לאחר הוספת מים.</li>
	<li>ממקמים את בקבוקון ה-PP בצנטריפוגה ומסובבים למשך 5 דקות לפחות (10,000 x גרם ומעלה בטמפרטורת החדר). הערה: לאחר הצנטריפוגה, שתי שכבות ממס נראות לעין ייווצרו (שכבה עליונה = מתנול/מים; תחתית = כלורופורם). כדור חלבון מוצק נוצר בממשק הממס (איור 2A).</li>
	<li>באמצעות קצה מיקרופיפט גדול (1 מ"ל), והחזקת הבקבוקון בטמפרטורה של כ-45°, הסר כ-700 μL של הממס מהשכבה העליונה בקצב אחיד.</li>
	<li>השתמש בקצה מיקרופיפט קטן יותר (200 μL) כדי להמשיך להסיר את שכבת הממס העליונה מהבקבוקון המוטה ~ 45°. פיפט בתנועה רציפה אחת עד ששכבת הממס העליונה יוצרת חרוז בבקבוקון.</li>
	<li>הוסיפו 400 μL של מתנול טרי לבקבוקון המדגם, מבלי להפריע לכדור, על ידי חלוקת הממס בצד הבקבוקון.</li>
	<li>מכסה את הבקבוקון. שלב את שכבות הממס על ידי נדנדה עדינה של הבקבוקון כדי לסובב את הממסים יחד. הערה: חיוני להימנע משיבוש הכדור. אין לסובב את הבקבוקון.</li>
	<li>תוך ציון כיוון הבקבוקון ברוטור, צנטריפוגה למשך מינימום של 10 דקות (10,000 x גרם בטמפרטורת החדר). גלולת החלבון נדבקת לתחתית הבקבוקון (איור 2B).</li>
	<li>הטה את הבקבוקון ב-45°, כאשר הכדור פונה כלפי מטה. מניחים את קצה הפיפטה לאורך הקצה העליון של הבקבוקון ומסירים את הסופרנטנט עם קצה מיקרופיפטה של 1 מ"ל בקצב איטי אך רציף. שמור על ~ 20 μL של ממס בבקבוקון.</li>
	<li>שטפו את גלולת החלבון עבור דגימות המכילות SDS על ידי חלוקה איטית של 400 μL של מתנול טרי. אין לסובב את הבקבוקון.<ol><li>המשך ישירות עם צנטריפוגה (10,000 x g במשך 2 דקות בטמפרטורה), תוך הצבת הבקבוקון לתוך הרוטור עם אותו כיוון כמו הספין הראשוני.</li>
	</ol></li>
	<li>הסר את הממס, לפי שלב 4.9. אפשרו לדגימה להתייבש באוויר באדים עד שהממס השיורי יתאדה.</li>
	<li>התייעץ עם נהלי ההרגעה המומלצים בשלב 6.</li>
</ol>5. משקעי חלבון באמצעות מחסנית סינון חד פעמית
הערה: כל פרוטוקול משקעים מבוסס ממס המתואר בשלבים 2-5 יכול להתבצע במחסנית סינון ומיצוי דו-שלבית (ראה טבלת חומרים).
<ol><li>כאשר התקע מחובר למחסנית הסינון העליונה (איור 3A), הוציאו את הנפח הרצוי של הפרוטאום, המלח והממס המופקים, כפי שמתואר באחת משלוש האפשרויות הבאות.<ol><li>(אפשרות 1) עבור משקעי חלבון עם אצטון, שלבו 90 μL של תמיסת חלבון או פרוטאום, 10 μL של 1 M NaCl מימי, ו-400 μL של אצטון. דגירה למשך 2 דקות לפחות על הספסל. הערה: משקע נראה לעין יתפתח עבור דגימות חלבון מרוכזות (1 גרם/ליטר) (איור 3B).</li>
		<li>(אפשרות 2) עבור משקעים פפטידיים של LMW, שלב 15 μL של הדגימה, 1.5 μL של 1 M ZnSO4, ו 485 μL של אצטון. דגירה למשך 2 דקות לפחות על הספסל. הערה: ריכוז מלח של 90 mM בדגימה מימית לא ישפיע על ההתאוששות ביחס ל-100 mM המומלצים בשלב 3.</li>
		<li>(אפשרות 3) עבור משקעי CMW, הוסיפו 50 μL של תמצית פרוטאום, 200 μL של מתנול ו-50 μL של כלורופורם. מכסה את הבקבוקון ולזמן קצר מערבולת לשילוב.<ol><li>מחלקים במהירות 150 μL של מים ישירות למרכז הבקבוקון. דגירה במשך דקה אחת על הספסל.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 2,500 x g בטמפרטורת החדר עם התקע עדיין מחובר למחסנית הסינון.</li>
	<li>הפוך את המחסנית ולאחר מכן פתח את התקע והסר את התקע מבסיס המחסנית.</li>
	<li>מניחים את מחסנית הסינון בבקבוקון נקי וחוזרים לצנטריפוגה. סובבו במשך 3 דקות בטמפרטורה של 500 x גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את ממס הזרימה מהבקבוקון התחתון. הערה: אם ממס כלשהו נשאר במחסנית הסינון העליונה, חזור לצנטריפוגה ובצע סיבוב נוסף.</li>
	<li>לשטוף את גלולת החלבון על ידי הוספת 400 μL של אצטון למחסנית הסינון (עבור משקעי CMW, שלב 5.1.3, להוסיף 400 μL של מתנול).</li>
	<li>צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 500 x g בטמפרטורת החדר או עד שלא נשאר ממס במחסנית העליונה.</li>
	<li>בצעו מחדש את גלולת המשקעים כמתואר בשלב 6.</li>
</ol>6. התפשטות מחדש של גלולת החלבון
<ol><li>הרטיבו את הממברנה בבסיס מחסנית הסינון על ידי חלוקת 2-5 μL של איזופרופנול ישירות לממברנה מיד לפני פרוטוקולי ההרגעה המתוארים להלן.</li>
	<li>עקוב אחר אחת משיטות ה- resolubilization הבאות.<ol><li>(אפשרות 1) הוסף מינימום של 20 μL של מאגר מימי המכיל ≥2% SDS למחסנית הסינון. כובע ומערבולת במרץ (כדקה אחת). לחלופין, sonicate (>10 דקות) כדי לפזר את גלולת החלבון.<ol><li>מחממים את הדגימה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות). חזור על שלב הערבוב לאחר החימום. הערה: מאגר העמסת ג'ל Laemmli יכול לבודד מחדש את גלולת החלבון. עם זאת, דגימות המכילות SDS אינן תואמות לעיכול טריפסין ול-LC ו-MS בפאזה הפוכה.</li>
		</ol></li>
		<li>(אפשרות 2) הכינו תמיסה של 80% (v/v) חומצה פורמית במים. Prechill את תמיסת חומצה (-20 °C), כמו גם את מחסנית הסינון המכילה חלבון מזורז.<ol><li>מחלקים 50 μL של חומצה פורמית קרה לתוך המחסנית; כובע ומערבולת במשך 30 שניות. חזרו למקפיא (-20 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.</li>
			<li>מערבולת את המחסנית שוב במשך 30 שניות. לאחר מכן, חזור על מחזור הקירור והערבוב פעם נוספת (10 דקות, -20 מעלות צלזיוס, מערבולת של 30 שניות).</li>
			<li>מוסיפים מים ל-500 מיקרול' סופיים, ומדללים את החומצה הפורמית ל-8%. הערה: פרוטוקול החומצה הפורמית הקרה אינו תואם לעיכול טריפסין הבא, אך הוא תואם ל- LC-MS.</li>
		</ol></li>
		<li>(אפשרות 3) הוסיפו 50 μL של אוריאה 8 M במים שהוכנו זה עתה למחסנית הסינון. סוניקט למשך 30 דקות.<ol><li>אפשרו למחסנית לדגור על הספסל למשך שעה אחת (עד הלילה).</li>
			<li>דיללו את האוריאה 8 M לפחות פי 5 עם מים או חיץ מתאים. הערה: לאחר מדולל, פרוטוקול ה-urea solubilization תואם לעיכול טריפסין הבא, כמו גם ל-LC-MS.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. עיכול חלבונים
<ol><li>לצורך ניתוח טרשת נפוצה מלמטה למעלה, הכפיפו את החלבונים שעברו ספיגה מחדש לעיכול אנזימטי באמצעות אחת משתי השיטות המוזכרות להלן.<ol><li>(אפשרות 1) עבור resolubilization חומצה פורמית, להפחית את הנפח הראשוני של 80% חומצה פורמית בשלב 6.2.2.1 עד 25 μL. בשלב 6.2.2.3, השתמש ב-375 μL של מים כדי לדלל את החומצה הפורמית ל-5% (v/v).</li>
		<li>מחלקים פפסין למחסנית ביחס חלבון לאנזים משוער של 50:1. עם תקע המחובר למחסנית הסינון, דגירה של הדגימה למשך הלילה בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li>
	<li>(אפשרות 2) עבור resolubilization באוריאה, להבטיח pH בין 8 ל 8.3 עם הכללה של 100 mM של Tris או אמוניום ביקרבונט בשלב 6.2.3.2.<ol><li>מוסיפים טריפסין ביחס מסה משוער של חלבון לאנזים של 50:1. עם תקע מחובר למחסנית, דגירה של הדגימה למשך הלילה באמבט מים חמים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>סיימו את העיכול על ידי החמצת התמיסה עם 10% TFA ל-1% סופיים.</li>
	</ol></li>
	<li>שחזרו את החלבון המעוכל של פפסין או טריפסין על ידי הסרת התקע מבסיס המסנן וצנטריפוגה של המחסנית הכלולה בתוך בקבוקון נקי (2 דקות, 5000 x גרם, טמפרטורת החדר).</li>
</ol>8. ניקוי SPE
הערה: עבור התפלת דגימה נוספת לאחר עיכול או החלפת ממסים, הדגימה יכולה להיות כפופה לניקוי פאזה הפוכה כמתואר.
<ol><li>ראש מחסנית SPE (ראה טבלת חומרים) על ידי העברת 300 μL של מתנול (2 דקות, 400 x גרם) ואחריו 300 μL של 5% אצטוניטריל / 0.1% של TFA (2 דקות, 400 x גרם).</li>
	<li>חבר את מחסנית ה-SPE הראשונית לבסיס מחסנית הסינון המכילה חלבון שעבר ספיגה מחדש או עיכול.</li>
	<li>סובבו את החלבון דרך מחסנית ה-SPE (5 דקות, 800 x גרם בטמפרטורת החדר). אם הממס נשאר במחסנית העליונה, החזר את המחסנית לצנטריפוגה וחזור על הסיבוב. הערה: העברת הדגימה דרך מחסנית ה- SPE בפעם השנייה עשויה לשפר את ההתאוששות.</li>
	<li>הוסף 300 μL של 5% אצטוניטריל / 0.1% של TFA במים למחסנית. כדי לשטוף, לזרום דרך מחסנית SPE (2 דקות, 2000 x גרם). השליכו את הזרימה-דרך.</li>
	<li>עבור חלבוני LMW או פפטידים מעוכלים, יש ללקט את הדגימה על ידי זרימה של 300 μL של 50% אצטוניטריל/0.1% TFA (5 דקות, 2500 x גרם).</li>
	<li>עבור חלבונים שלמים, עקוב אחר שלב 8.5 עם שלב אלוטיון נוסף באמצעות 300 μL של 75% אצטוניטריל / 0.1% TFA. שלבו את שתי התמציות המתקבלות. הערה: שלב 8.6 הוא אופציונלי.</li>
</ol>

מעבדת Doucette הגתה ורשמה פטנט על ProTrap XG שהועסק במחקר זה. AAD הוא גם שותף מייסד של Proteoform Scientific, אשר מסחור מחסנית הכנת הדגימה.

אפיון מיטבי של טרשת נפוצה מושג כאשר SDS שיורי מתרוקן מתחת ל-10 עמודים לדקה. בעוד שגישות חלופיות, כגון FASP ועיכול על חרוזים, מציעות דלדול כמותי של SDS עם התאוששות משתנה 31,32,33, המטרה העיקרית של משקעים היא למקסם את הטוהר והתפוקה בו זמנית. זה תלוי בבידוד יעיל של הסופרנטנט (המכיל את ה-SDS) מבלי להפריע לכדור החלבון. עם משקעים על בסיס בקבוקון, ברגע שחלק הארי של הסופרנאטנט מוסר על ידי צנרת, סביר יותר ויותר שחלק מהכדורים המצטברים הול...

ניתוח פרוטאומים על ידי ספקטרומטריית מסות הפך לקפדני יותר ויותר, בשל הרגישות, הרזולוציה, מהירות הסריקה והרב-תכליתיות המשופרות של מכשירי MS מודרניים. התקדמות הטרשת הנפוצה תורמת ליעילות גדולה יותר של זיהוי חלבונים ולכמות מדויקת יותרשל 1,2,3,4,5. עם מכשור משופר לטרשת נפוצה, החוקרים דורשים אסטרטגיית הכנת דגימות חזיתית עקבית המתאימה, המסוגלת לשחזר כמותית של חלבונים בעלי טוהר גבוה בזמן מינימלי בכל שלבי זרימת העבודה 6,7,8,8,9,10,11 . כדי לשקף במדויק את מצב הפרוטאום של מערכת ביולוגית, יש לבודד חלבונים ממטריצת הדגימה המקומית בצורה יעילה ובלתי משוחדת. לשם כך, כולל חומר פעילי שטח דנטורינג, כגון נתרן דודציל סולפט (SDS), מבטיח מיצוי חלבונים יעיל וסולוביליזציה12. עם זאת, SDS מפריע מאוד ליינון אלקטרוספריי, וגורם לדיכוי אות חמור של טרשת נפוצה אם לא בוטל כראוי13.
אסטרטגיות שונות של דלדול SDS זמינות לניתוח פרוטאומים לאחר מכן, כגון שימור חלבונים מעל מסנן ניתוק משקל מולקולרי הכלול בתוך מחסניות ספין חד פעמיות 14,15,16. שיטת הכנת הדגימה בסיוע מסנן (FASP) מועדפת מכיוון שהיא מדלדלת ביעילות SDS מתחת ל-10 עמודים לדקה, ומאפשרת טרשת נפוצה אופטימלית. עם זאת, התאוששות חלבונים עם FASP היא משתנה, מה שהניע את חקר הטכניקות האחרות. גישות כרומטוגרפיות הלוכדות באופן סלקטיבי חלבון (או פעילי שטח) התפתחו למחסניות נוחות שונות או לפורמטים מבוססי חרוזים 17,18,19,20,21. בהתחשב באסטרטגיות הפשוטות והעקביות (האידיאליות) הללו לטיהור חלבונים, לעתים קרובות מתעלמים מהגישה הקלאסית של משקעי חלבונים עם ממסים אורגניים כגישה מבטיחה לבידוד חלבונים. בעוד שמשקעים ממסים הוכחו כמדלדלים SDS מתחת לרמות קריטיות בהצלחה, התאוששות חלבונים היא דאגה ארוכת שנים של גישה זו. קבוצות רבות הבחינו בהטיית התאוששות חלבונים, עם תפוקת משקעים נמוכה באופן בלתי מתקבל על הדעת כפונקציה של ריכוז חלבונים, משקל מולקולרי והידרופוביות22,23. בשל מגוון פרוטוקולי המשקעים המדווחים בספרות, פותחו תנאי משקעים סטנדרטיים. בשנת 2013, Crowell et al. דיווחו לראשונה על התלות של חוזק יוני ביעילות המשקעים של חלבונים ב-80% אצטון24. עבור כל החלבונים שנבדקו, תוספת של עד 30 mM נתרן כלורי הוכחה כחיונית כדי למקסם את היבולים (עד 100% התאוששות). לאחרונה, ניקרסון ואחרים הראו כי השילוב של חוזק יוני גבוה עוד יותר (עד 100 מ"מ) עם טמפרטורה גבוהה (20 מעלות צלזיוס) במהלך משקעי אצטון נתן כמעט התאוששות כמותית תוך 2-5 דקות25. נצפתה ירידה קלה בהתאוששות של חלבוני משקל מולקולרי נמוך (LMW). לכן, דו"ח מאוחר יותר של Baghalabadi et al. הדגים את ההתאוששות המוצלחת של חלבוני LMW ופפטידים (≤5 kDa) על ידי שילוב של מלחים ספציפיים, במיוחד אבץ גופרתי, עם רמה גבוהה יותר של ממס אורגני (97% אצטון)26.
בעוד שעידון פרוטוקול המשקעים מעניק אסטרטגיה אמינה יותר לטיהור חלבונים עבור פרוטאומיקה מבוססת טרשת נפוצה, ההצלחה של משקעים קונבנציונליים מסתמכת במידה רבה על טכניקת המשתמש. אחת המטרות העיקריות של עבודה זו היא להציג אסטרטגיית משקעים חזקה המאפשרת את הבידוד של גלולת החלבון מהסופרנטנט המזהם. מחסנית סינון חד פעמית פותחה כדי למנוע צנרת על ידי בידוד חלבון מצטבר מעל מסנן קרום PTFE נקבובי27. רכיבים המפריעים ל-MS בסופרנטנט מוסרים ביעילות בשלב צנטריפוגה קצר במהירות נמוכה. מחסנית המסנן החד פעמית מציעה גם מחסנית SPE הניתנת להחלפה, המאפשרת ניקוי דגימות לאחר מכן לאחר רה-lubilization ועיכול חלבונים אופציונלי, לפני ספקטרומטריית מסה.
סדרה של תהליכי עבודה מומלצים של משקעי פרוטאום מוצגים כאן, כולל פרוטוקולים מותאמים של אצטון וכלורופורם/מתנול/מים28 , בפורמט קונבנציונלי (מבוסס בקבוקון) ובפורמט חצי אוטומטי במחסנית סינון ומיצוי חד-פעמית של שני מצבים. התאוששות החלבון המתקבלת ויעילות דלדול ה-SDS מודגשים, יחד עם כיסוי פרוטאום LC-MS/MS מלמטה למעלה, כדי להדגים את התוצאה הצפויה מכל פרוטוקול. היתרונות המעשיים והחסרונות הקשורים לכל גישה נדונים.

<table><tbody><tr><td>אצטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AC177170010</td><td>&le; 0.002% אלדהיד</td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A998-4</td><td>דרגת HPLC</td></tr><tr><td>ביקרבונט אמוניום</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>A6141-1KG</td><td>מוצק</td></tr><tr><td>בטא מרקפטואנול</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>M3148-25ML</td><td>דרגת ביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>B8026-5G</td><td>מלח נתרן כחול ברומופנול</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C298-400</td><td>כלורופורם</td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>הוניוול</td><td>56302</td><td>תוסף אלואנט עבור LC-MS</td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסה פיוז'ן לומוס</td><td>תרמופישר סיינטיפיק</td><td></td><td>לניתוח תערובת חלבונים סטנדרטית</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>356352-1L-M</td><td>בביולוגיה מולקולרית, > 99%</td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A4641</td><td>דרגת HPLC</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A452SK-4</td><td>דרגת HPLC</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>75-400-102</td><td>עד 21,000 XG</td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-130</td><td>תחתית מחודדת</td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (2 מ"ל)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-681-321</td><td>תחתית מעוגלת</td></tr><tr><td>טיפים למיקרופיפטות&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (0.1-10 & mu; L)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>21-197-28</td><td>קצה פיפט אוניברסלי, לא סטרילי</td></tr><tr><td>טיפים למיקרופיפטות&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (1-200 & mu; L)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-302</td><td>קצה פיפט אוניברסלי, לא סטרילי</td></tr><tr><td>טיפים למיקרופיפטות&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (200-1000 & mu; L)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-303</td><td>קצה פיפט אוניברסלי, לא סטרילי</td></tr><tr><td>מיקרופיפטות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-710-903</td><td>חבילת מיקרופיפט טריו</td></tr><tr><td>פפסין</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>P0525000</td><td>אבקה ליופילית,&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; >3200 יחידות למ"ג</td></tr><tr><td>ProTrap XG</td><td>פרוטאופורם סיינטי</td><td>PXG-0002</td><td>50 יחידות מלאות לכל קופסה</td></tr><tr><td>כלוריד נתרן</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>S9888-1KG</td><td>תגובת ACS, >99%</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>תרמופישר סיינטיפיק</td><td>28312</td><td>אבקה מוצקה</td></tr><tr><td>timsTOF Pro ספקטרומטר מסה</td><td>ברוקר</td><td></td><td>לניתוח תמצית פרוטאום בכבד</td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>תרמופישר סיינטיפיק</td><td>L06374. AP</td><td>99%</td></tr><tr><td>טריס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP152-500</td><td>דרגת ביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>9002-07-7</td><td>מלבלב בקר, מטופל ב-TPCK</td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>ביו-ראד</td><td>1610731</td><td>מוצק</td></tr><tr><td>מים (דה-יוניזציה)</td><td>מערכת טיהור המים המיני Sartorius Arium</td><td>76307-662</td><td>סוג 1 אולטרה-טהור (18.2 M&Omega; ס"מ)</td></tr><tr><td>אבץ סולפט</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>307491-100G</td><td>מוצק</td></tr></tbody></table>

משקעי חלבון אורגניים מבוססי ממסים לטיהור פרוטאום חזק לפני ספקטרומטריית מסה

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

בעוד שהתקדמות מרובה במכשירי ספקטרומטריית מסות (MS) שיפרה את ניתוח הפרוטאומים האיכותי והכמותי, גישות חזיתיות אמינות יותר לבודד, להעשיר ולעבד חלבונים לפני טרשת נפוצה הן קריטיות לאפיון מוצלח של פרוטאומים. התאוששות חלבון נמוכה ולא עקבית וזיהומים שיוריים כגון חומרים פעילי שטח מזיקים לניתוח טרשת נפוצה. משקעים בחלבון נחשבים לעתים קרובות כלא אמינים, גוזלים זמן ומאתגרים מבחינה טכנית לביצוע בהשוואה לאסטרטגיות אחרות להכנת דגימות. על חששות אלה מתגברים על ידי שימוש בפרוטוקולים אופטימליים של משקעי חלבונים. עבור משקעי אצטון, השילוב של מלחים ספציפיים, בקרת טמפרטורה, הרכב ממסים וזמן משקעים הוא קריטי, בעוד שהיעילות של משקעי כלורופורם/מתנול/מים תלויה בצנרת נכונה ובמניפולציה של בקבוקון. לחלופין, פרוטוקולי משקעים אלה יעילים ואוטומטיים למחצה בתוך מחסנית ספין חד פעמית. התוצאות הצפויות של משקעי חלבון מבוססי ממס בפורמט הקונבנציונלי ושימוש במחסנית סינון ומיצוי חד-שלבית דו-שלבית מודגמות בעבודה זו. זה כולל את האפיון המפורט של תערובות פרוטאומיות על ידי ניתוח LC-MS/MS מלמטה למעלה. הביצועים המעולים של זרימות עבודה מבוססות SDS מודגמים גם ביחס לחלבון שאינו מזוהם.

איור 4 מסכם את הידלדלות ה-SDS הצפויה בעקבות משקעים מבוססי בקבוקון או מקלים על מחסנית של חלבונים במחסנית מסנן חד פעמית באמצעות אצטון. דגירה קונבנציונלית בלילה (-20 מעלות צלזיוס) באצטון מושווית לפרוטוקול משקעי האצטון המהיר בטמפרטורת החדר (שלב 2), כמו גם למשקעי CMW (שלב 4). שאריות SDS כומתו על ידי בדיקת החומרים הפעילים הכחולים של מתילן (MBAS)29. בקצרה, דגימת 100 μL שולבה עם ריאגנט 100 μL MBAS (250 מ"ג מתילן כחול, 50 גרם נתרן גופרתי, 10 מ"ל חומצה גופרתית, מדוללת במים ל-1....

הפרוטוקול הנוכחי מתאר משקעי חלבונים מבוססי ממסים בתנאים מבוקרים להתאוששות וטיהור חזקים ומהירים של דגימות פרוטאום לפני ספקטרומטריית מסות.

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

פרוטוקולים אלה נועדו למקסם את ההתאוששות, כמו גם את טוהר החלבונים באמצעות משקעים מבוססי ממסים. אנחנו הולכים להראות לך כמה טריקים כדי לבצע משקעים בקבוקונים, כמו גם גישה חצי אוטומטית בפורמט מחסנית ספין. כמו כן, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול המשקעים כך שיהיה עקבי ומהיר.הפרוטוקול כולו לוקח רק כמה דקות. פרוטוקולים אלה מראים כי משקעים ממסים של חלבונים הם אידיאליים להכנת דגימות לפני ספקטרומטריית מסות. הפרוטוקולים יתאימו בצורה חלקה לתזרימי עבודה מקצועיים מלמטה למעלה, כמו גם מלמעלה למטה.מדגימים עבורנו היום יהיו זיהנג דנג וויקטוריה מילר, מדענית בכירה ב- Proteoform Scientific בהליפקס, נובה סקוטיה פיפטה 90 מיקרוליטר של תמיסת חלבון ללא חלקיקים לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו פוליפרופילן. לאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטרים של נתרן כלורי מימי אחד ו-400 מיקרוליטרים של אצטון לתמיסת הדגימה, כבשו והקישו על הבקבוקון בעדינות כדי לשלב את הממסים. אפשרו לבקבוקון לדגור אותו.טמפרטורת החדר ללא הפרעה במשך מינימום של שתי דקות לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימות לציין את הכיוון של הבקבוקון להסתובב במשך מינימום של שתי דקות ב 10, 000 RCF או גבוה יותר בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, כדור לבן גלוי נצפה בתחתית הצינור. בשלב זה, פתח את הצינור ושקע את הסופרנט למיכל פסולת על ידי היפוך הצינור.השתמש במגבת נייר כדי לשאוב כל ממס שיור

organic-solvent-based-protein-precipitation-for-robust-proteome

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

Digital מיקרופלואידיקה היא טכניקה מאופיין מניפולציה של טיפות בדידים (~ NL - מ"ל) על מערך של אלקטרודות על ידי יישום של שדות חשמליים. הוא מתאים היטב בביצוע מהיר, רציף, מבחני מיניאטורי ביוכימיים אוטומטיות. כאן אנו מדווחים פלטפורמה מסוגל מיכון כמה מדרגות עיבוד proteomic.

מיקרופלואידיקה דיגיטלי עבור עיבוד אוטומטי proteomic

אנו מציגים וריאציה של (immunoprecipitation כמותיים בשילוב עם מציאה) הגישה המהירה שהוצגה בעבר להבחין בין אמת ושקר אינטראקציות בין חלבונים. הגישה שלנו מבוססת...

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

תיוג איזוטופ יציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא אסטרטגיה מהירה וזולה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה מדויקת כמותית. כאן אנו מדגימים שיטה חזקה לעריכה ולניתוח של תערובות חלבון באמצעות הגישה רדה שניתן ליישם כמעט כל סוג מדגם.

פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

האמינות של תוצאות בניסויי metabolomics תלוי באפקטיביות והשחזור של הכנת המדגם. תאר היא שיטה קפדנית ומעמיקה שבמאפשרת מיצוי של מטבוליטים מנוזלים ביולוגיים עם האפשרות של המשך ניתוח עד אלפי תרכובות, או רק את שיעורי המתחם של עניין.

טכניקת הכנה רב שלבים לשחזר חוגים מתחם המטבוליט מרובים לעומק וניתוח Metabolomic אינפורמטיבי

פרוטוקול זה מיועד למיצוי וריכוז של חלבון ו-DNA מביומסה מיקרוביאלית שנאספה ממי ים, ולאחר מכן יצירת פפטידים טריפטיים המתאימים לניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה טנדם.

Metaproteomics זרימת עבודה Aquatic מיקרוביאלית: מתאים לtryptic פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסת טנדם

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

מתוארים היא זרימת עבודה פרוטאומניקה לזיהוי שותפים אינטראקציה חלבונים מתוך שבר גרעיני subcellular באמצעות העשרת זיקה חיסונית של חלבון נתון של ריבית ותוויות המסה חינם התווית. זרימת העבודה כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, סינון הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר מסה וצינור ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיצוי של חומצות אמינו שאינן חלבוניות ממטריצות ביולוגיות באמצעות משקעי חלבון חומצה טריכלורואצטית (TCA) והידרוליזה חומצית לפני ניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם.

מיצוי חומצות אמינו שאינן חלבוניות מציאנובקטריה לכרומטוגרפיה נוזלית-ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם

כאן, אנו מקימים שיטה פרוטאומית מבוססת ספקטרומטריית מסה תוך שימוש באזורי עניין מבודדים בקטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין. פרוטוקול זה משמש לניתוח פרוטאום מאזורי רקמה ספציפיים בקטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין.

גישה יעילה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה תוך שימוש באזורי רקמה נבחרים

למד שיטת משקעי חלבון אורגניים מבוססי ממסים לטיהור פרוטאום יעיל לפני ספקטרומטריית מסה. הפרוטוקול ממוטב לביצוע מהיר ומספק שחזור גבוה וטוהר עקבי של חלבונים.

משקעי חלבון אורגניים מבוססי ממסים לטיהור פרוטאום חזק לפני ספקטרומטריית מסה

גלה סרטונים נוספים