לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז

CUT&RUN היא טכניקה רבת עוצמה לקביעת לוקליזציה של חלבונים בכרומטין, וכאן אנו מתארים גרסה חד-תאית של טכניקה זו בפורמט ידני של 96 בארות. רוב טכניקות הלוקליזציה של חלבונים, כמו ChIP-seq, דורשות קלט תא גבוה ולוקח כשלושה ימים להשלים. CUT&RUN, עקב האות הגבוה והרקע הנמוך, עברה אופטימיזציה ליישום של תאים נמוכים ותא יחיד, וניתן להשלים אותה ביום אחד.

אנו מדמיינים כי טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כמעט על כל מדגם ביולוגי והוא יכול להיות חזק במיוחד כדי לקבוע לוקליזציה גורם בדגימות נדירות ושפע נמוך, כגון דגימות חולים יקרות. לפני ביצוע ניסויים בתא יחיד, בדוק את הנוגדן והטכניקה על מספר גבוה של תאים שאינם יקרים. המגבלה העיקרית של ניסוי זה היא התלות בנוגדן חזק.

מדגימה את ההליך היא סנטנה לארדו, מומחית מחקר מנוסה מהמעבדה שלי. לאחר מיון תאים בודדים וגרעינים מחייבים לחרוזים, הנח את הלוח בן 96 הבאר על מתלה מגנטי של 96 בארות ואפשר לחרוזים להיקשר למשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן, להסיר ולהשליך את supernatant.

הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חוצץ חסימה לחרוזים הקשורים לגרעין, ערבבו עם צינורות עדינים ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well ולאפשר supernatant לנקות לפחות של חמש דקות. לאחר מכן, להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.

הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 100 microliters של חוצץ לשטוף לכל תגובה עם צינורות עדינים. מניחים את הצלחת בחזרה על המתלה המגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant. הקדישו מחדש את החרוזים ל-25 מיקרוליטרים של מאגר כביסה לכל תגובה עם צינורות עדינים.

צור תערובת ראשית של אמן נוגדנים על-ידי ציטוט 25 מיקרוליטרים של מאגר כביסה לכל תגובה ולאחר מכן הוסף 0.5 מיקרוליטרים של נוגדנים לכל תגובה. הוסיפו 25.5 מיקרוליטרים של תערובת מאגר שטיפת הנוגדנים, ולאחר מכן צינורות עדינים לכל דגימה המטופלת בנוגדן המכוון לחלבון העניין. דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שוב למקם את הדגימות בחזרה על מתלה מגנטי 96-well. ברגע supernatant הוא ברור, להסיר ולהשליך אותו מבלי להפריע חרוזים. לאחר הסרת הצלחת מן המתלה המגנטי, לשטוף את החרוזים עם 100 microliters של חוצץ לשטוף resuspend על ידי צינורות.

לאחר הנחת הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96-well ולהשליך supernatant כפי שהוכח בעבר, resuspened כל מדגם ב 25 מיקרוליטרים של חוצץ לשטוף. הפוך חלבון תערובת מאסטר MNase על ידי הוספת 25 מיקרוליטר של מאגר לשטוף כמות אופטימלית של חלבון A MNase לכל תגובה. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של חלבון תערובת ראשית של MNase לכל דגימה, כולל דגימות הבקרה.

לדגור על הדגימות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי של 96 בארות. אפשר supernatant לנקות לפחות חמש דקות ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע החרוזים.

לאחר הסרת הצלחת מן המתלה המגנטי, לשטוף את החרוזים עם 100 microliters של חוצץ לשטוף מחדש על ידי צינורות עדינים. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96 היטב ולהשליך את supernatant כפי שהוכח בעבר. לאחר מכן, להסיר את הדגימות מן המתלה המגנטי ואת resuspend החרוזים ב 50 מיקרוליטרים של חיץ לשטוף על ידי צינורות עדינים.

שיווי משקל את הדגימות לאפס מעלות צלזיוס בתערובת מי קרח במשך חמש דקות ולאחר מכן להסיר את הדגימות מאמבט מי הקרח. הוסיפו מיקרוליטר אחד של סידן כלורי 100 מ"מ באמצעות פיפטה רב-ערוצית. מערבבים היטב שלוש עד חמש פעמים עם צינורות עדינים באמצעות פיפטה רב ערוצית בנפח גדול ולאחר מכן להחזיר את הדגימות לאפס מעלות צלזיוס.

התחל טיימר של 10 דקות ברגע שהצלחת חוזרת לאמבטיית מי הקרח. עצור את התגובה על ידי צנרת 50 מיקרוליטרים של פתרון המכיל ריכוז כפול של RSTOP + ולחוצץ לתוך כל באר באותו סדר כמו סידן כלורי נוספה. לדגור על הדגימות במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

לסובב את הצלחת ב 16, 000 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי של 96 בארות. תן לסופר-נרטיב להתפנות לחמש דקות לפחות.

לאחר מכן, להעביר supernatants לצלחת 96-well טרי ולהשליך את החרוזים. להפקת דנ"א, הוסיפו מיקרוליטר אחד של 10% SDS ו-0.83 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K לכל דגימה וערבבו את הדגימות על ידי צנרת עדינה. לדגור על הדגימות במשך 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס.

מחזירים את הצלחת לטמפרטורת החדר. הוסיפו 46.6 מיקרוליטרים של נתרן כלורי בעל חמישה טוחנים ו-90 מיקרוליטרים של 50%PEG4000 וערבבו באמצעות צינורות עדינים. הוסיפו 33 מיקרוליטרים של חרוזי מגנטיט פוליסטירן לכל דגימה ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי ומניחים לסופר-נרטיב להתפנות למשך כחמש דקות. לאחר מכן, בזהירות להשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים. יש לשטוף פעמיים עם 150 מיקרוליטרים של 80% אתנול מבלי להפריע לחרוזים.

לסובב את הצלחת לזמן קצר ב 1000 פעמים G במשך 30 שניות. מניחים את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96-well ולהסיר את כל האתנול שיורית מבלי להפריע לחרוזים. אוויר לייבש את הדגימות במשך כשתיים עד חמש דקות.

לפנק מחדש את החרוזים ב 37.5 microliters של 10 מילימולרי TRIS הידרוכלוריד של pH 8 ודגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי ומאפשרים לחרוזים להיקשר במשך חמש דקות. העבירו 36.5 מיקרוליטרים של הסופר-נרטיב ללוחית 96 בארות תואמת תרמוציקלר טרייה והשליכו את החרוזים.

לאחר ביצוע הערכת איכות התא, נבדקו מראה התא ואחוז, המוכיחים כי אין להשתמש בתאי גזע עובריים באיכות נמוכה. מיון של תאים בודדים בוצע באמצעות כתם Hoechst 33342, ותאי הבדיקה נספרו כדי להבטיח שאפס או תא אחד נמצא בכל באר. ניתוח ג'ל Agarose גילה סולם משקל מולקולרי נמוך וספריות uliCUT&RUN חד-תאיות בודדות.

ניתוח הספרייה התת-אופטימלי והאופטימלי מראה סולם במשקל מולקולרי נמוך, ספרייה תת-אופטימלית עקב עיכול Mnase לא יעיל, וספרייה מוצלחת עם עיכול מתאים. התפלגות מנתח הקטעים מראה שהגודל הצפוי של תא בודד נע בין 150 ל- 500 זוגות בסיסים. עם זאת, בחלבונים גדולים, DNA יהיה סביב 270 זוגות בסיס.

תפוסת חלבונים באמצעות דפדפן גנום לוקוס יחיד המתאר מספר תא גבוה או שליטה שלילית ו- CTCF uliCUT&RUN חד-תאי חשף כי תא יחיד ייצג במידה רבה פסגות חזקות, בדומה ל- uliCUT&RUN של תאים גבוהים. מפות חום של CTCF חד-תאי או שליטה שלילית חשפו דפוס ברור של העשרת קריאה ישירות מעל אתרי איגוד CTCF מבוססים בתאים. מפות חום חד-ממדיות מראות צפיפות קריאה גבוהה יותר על פני אתרי איגוד CTCF מבוססים בספריות חד-תאיות ביחס לאזורים הסמוכים ובקרות ללא נוגדנים, ומדגימות העשרה ספציפית לנוגדנים באתרי איגוד מבוססים.

חשוב לאזן את הגרעינים הקשורים לחרוזים באמבט מי הקרח ולא לחמם יתר על המידה את הדגימה על תוספת סידן כלוריד כדי למנוע עיכול יתר של הכרומטין.