Name: לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: למדו טכניקת CUT&RUN ללוקליזציה של גורמים בכרומטין ברמת תא יחיד בפורמט 96-well ידני. שיטה זו מציעה אות גבוה ורקע נמוך לעומת ChIP-seq, מתאימה לדגימות נדירות ונדירות ביולוגיות וניתנת לביצוע ביום אחד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדת היינר על הקריאה וההערות על גרסה מוקדמת יותר של כתב יד זה. פרויקט זה השתמש NextSeq500 זמין באוניברסיטת פיטסבורג מדעי הבריאות רצף הליבה בבית החולים לילדים UPMC של פיטסבורג עבור ריצוף עם תודה מיוחדת למנהל שלה, ויליאם מקדונלד. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מרכז אוניברסיטת פיטסבורג למחשוב מחקר באמצעות משאבי המחשב שסופקו. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק מספר R35GM133732 (כדי S.J.H.).

<ol><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking%3A+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li>
<li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li>
<li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li>
<li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III%2C+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li>
<li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-tube+linear+DNA+amplification+%28LinDA%29+for+robust+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li>
<li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li>
<li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232(2013).</li>
<li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cChIP-seq%3A+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083(2015).</li>
<li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033(2015).</li>
<li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChlC+and+ChEC%3B+genomic+mapping+of+chromatin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li>
<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733(2015).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856(2017).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314(2019).</li>
<li>Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li>
<li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT%26RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li>
<li>Zheng, X. -Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים הקשורים לפרויקט זה.

CUT&RUN הוא פרוטוקול יעיל לקביעת לוקליזציה של חלבונים בכרומטין. יש לו יתרונות רבים ביחס לפרוטוקולים אחרים, כולל: 1) יחס אות לרעש גבוה, 2) פרוטוקול מהיר, ו-3) כיסוי קריאה ברצף נמוך הנדרש ובכך מוביל לחיסכון בעלויות. השימוש בחלבון A- או חלבון A/G-MNase מאפשר להחיל את CUT&RUN עם כל נוגדן זמין; לכן, יש לו את הפוטנציאל במהירות ובקלות פרופיל חלבונים רבים. עם זאת, הסתגלות לתא יחיד עבור כל פרופיל חלבון על כרומטין היה קשה, במיוחד בהשוואה לתעתיק של תא יחיד (כלומר, scRNA-seq), בשל מספר העותק הנמוך של DNA ביחס ל- RNA (שניים עד ארבעה ...

חלבונים גרעיניים רבים פועלים על ידי אינטראקציה עם כרומטין כדי לקדם או למנוע פעילויות בתבנית DNA. כדי לקבוע את הפונקציה של חלבונים אלה כרומטין אינטראקציה, חשוב לזהות את המיקומים הגנומיים שבהם חלבונים אלה קשורים. מאז התפתחותו בשנת 1985, אימונופרציפציה כרומטין (ChIP) היה תקן הזהב לזיהוי היכן חלבון נקשר לכרומטין 1,2. לטכניקת ChIP המסורתית יש את זרימת העבודה הבסיסית הבאה: תאים נקצרים ומקושרים (בדרך כלל עם פורמלדהיד), כרומטין הוא גזירה (בדרך כלל עם שיטות sonication קשות, המחייבות crosslinking), החלבון של עניין הוא immunoprecipitated באמצעות נוגדן המכוון החלבון (או חלבון מתויג) ואחריו נוגדן משני (בשילוב אגרוזים או חרוזים מגנטיים), crosslinking הוא הפוך, חלבון ורנ"א מתעכלים כדי לטהר DNA, ו- CHIP מועשר-DNA זה משמש כתבנית לניתוח (באמצעות בדיקות עם תווית רדיו 1,2, qPCR3, מיקרו-אריות 5,6, או רצף4). עם הופעתם של מיקרו-ערים ורצף עמוק מקביל מאסיבי, צ'יפ-צ'יפ-צ'יפ 5,6 ו-ChIP-seq4 פותחו לאחרונה ומאפשרים זיהוי כללי של לוקליזציה של חלבונים בכרומטין. Crosslinking ChIP הייתה טכניקה רבת עוצמה ואמינה מאז הופעתה עם התקדמות משמעותית ברזולוציה על ידי ChIP-exo7 ו ChIP-נקסוס8. במקביל להתפתחות של ChIP-seq, פרוטוקולים מקוריים (ללא crosslinking) עבור ChIP (N-ChIP) הוקמו, אשר משתמשים בעיכול נוקלאז (לעתים קרובות באמצעות נוקלאז מיקרוקוקאלי או MNase) כדי לפצל את הכרומטין, בניגוד sonication המבוצע בטכניקות ChIP crosslinking מסורתיות9. עם זאת, חיסרון מרכזי אחד הן בהצלבה של טכנולוגיות ChIP והן בטכנולוגיות N-ChIP היה הדרישה למספרי תאים גבוהים עקב תפוקת דנ"א נמוכה בעקבות המניפולציה הניסיונית. לכן, בשנים האחרונות, מאמצים רבים היו לקראת אופטימיזציה של טכנולוגיות ChIP עבור קלט תא נמוך. מאמצים אלה הביאו לפיתוח טכנולוגיות רבות עוצמה המבוססות על ChIP המשתנות בדרישות הישימות והקלט שלהן 10,11,12,13,14,15,16,17,18. עם זאת, טכנולוגיות מבוססות ChIP-seq חד-תאיות חסרות, במיוחד עבור חלבונים שאינם histone.
בשנת 2004 פותחה טכנולוגיה חלופית כדי לקבוע את תפוסת החלבון על כרומטין המכונה מחשוף כרומטין אנדוגני (ChEC) ו כרומטין Immunocleavage (ChIC)19. טכניקות לוקוס בודדות אלה משתמשות בהיתוך של MNase לחלבון העניין (ChEC) או לחלבון A (ChIC) לחיתוך ישיר של DNA הסמוך לחלבון העניין. בשנים האחרונות, הן ChEC והן ChIC עברו אופטימיזציה ליצירת פרופיל חלבון רחב גנום על כרומטין (ChEC-seq ו- CUT&RUN, בהתאמה)20,21. בעוד ChEC-seq היא טכניקה רבת עוצמה לקביעת לוקליזציה של גורמים, היא דורשת פיתוח חלבוני MNase-היתוך עבור כל מטרה, ואילו ChIC והווריאציה הרחבה של הגנום שלה, CUT&RUN, מסתמכים על נוגדן המכוון לחלבון העניין (כמו עם ChIP) וחלבון רקומביננטי A-MNase, שבו חלבון A יכול לזהות את האזור הקבוע IgG של הנוגדן. כחלופה, פותח חלבון היתוך A/Protein G-MNase (pA/G-MNase) שיכול לזהות מגוון רחב יותר של אזורים קבועים נוגדנים22. CUT&RUN הפכה במהירות לחלופה פופולרית ל-ChIP-seq לקביעת לוקליזציה של חלבונים בגנום כרומטין בכל רחבי.
CUT&RUN של קלט נמוך במיוחד (uliCUT&RUN), וריאציה של CUT&RUN המאפשרת שימוש בכניסות נמוכות ותא בודד, תוארה בשנת 201923. כאן מתוארת המתודולוגיה עבור יישום ידני של תא יחיד בתבנית 96 well. חשוב לציין כי מאז הפיתוח של uliCUT&RUN, פותחו שתי חלופות ליצירת פרופיל histone, CUT&Tag ו- iACT-seq, המספקות פרופיל חזק ומקביל מאוד של חלבוני הייסטון24,25. יתר על כן, scCUT&Tag עברה אופטימיזציה ליצירת פרופילים של גורמים מרובים בתא יחיד (multiCUT&Tag) וליישום חלבונים שאינם histone26. יחד, CUT&RUN מספקת חלופה אטרקטיבית ל- ChIP-seq עם קלט נמוך שבו ניתן לבצע uliCUT&RUN בכל מעבדה לביולוגיה מולקולרית שיש לה גישה לממיין תאים וציוד סטנדרטי.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרופוגה שקופים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90410</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור מתלה מגנטי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צנטריפוגה קרה תואמת צינור</td><td>Eppendorf</td><td>5404000537</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחות תרבית רקמות סטריליות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>10X T4 DNA Ligase buffer</td><td>חדש אנגליה Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>1X מאגר TE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; צינורות L PCR</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>2X מהיר מאגר ליגאז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M2200</td><td>Ligase Buffer</td></tr><tr><td>5X KAPA HiFi buffer</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td>5X מאגר PCR בנאמנות גבוהה</td></tr><tr><td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BDB559925</td><td></td></tr><tr><td>96-well מתלה מגנטי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12027 או 12331D</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP חרוזים</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td>חרוזי פוליסטירן-מגנטיט; בשל השונות הפוטנציאלית בין חרוזי AMPure XP, מומלץ לכייל את תמיסת חרוזי ה-AMPure שלך. ראה 'יצרן' s הוראות</td></tr><tr><td>נוגדן לחלבון מעניין</td><td>משתנה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>BioMag Plus Concanavalin A חרוזים</td><td>Polysciences</td><td>86057-10</td><td>מיקרוספירות פרמגנטיות מצומדות ConA</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>AAJ62905AP</td><td></td></tr><tr><td>סדרן תאים</td><td>BD FACSAria II סדרן</td><td></td> תאים <td>דורש הכשרה</td></tr><tr><td>מדיה ספציפית לתא לתרבית תאים</td><td>משתנה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C298-500</td><td>כלורופורם הוא מגרה בעור ומזיק בבליעה; לטפל במכסה אדים כימי באמצעות כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן</td></tr><tr><td>מחשב עם מעבד 64 סיביות וגישה לאשכול</td><td></td><td></td> מחשוב על<td>לניתוחים חישוביים של מערכי נתונים של ריצוף שנוצרו</td></tr><tr><td>עמודות ספין DNA</td><td>Epoch Life Sciences</td><td>1920-250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>ציוד אלקטרופורזה</td><td>משתנה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22032601</td><td>100% נפח / נפח אתנול דליק מאוד; ידית במכסה אדים כימי באמצעות כפפות, מעיל מעבדה, ומשקפי מגן</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית&nbsp; (אדטה)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>VWR</td><td>97063-256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td>מוכן מג'ל מקושר, מעוכל MNase וג'ל אגרוז מופק DNA גנומי מטוהר מחלבון/RNA ומדולל ל-10 ננוגרם/מ"ל. אנו ממליצים על DNA גנומי של שמרים, אך ניתן להשתמש באורגניזמים אחרים במידת הצורך.</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית&nbsp; (HCl)</td>חומצה הידרוכלורית של <td>פישר סיינטיפיק</td><td>A144-212</td><td>היא קורוזיבית מאוד; ידית במכסה אדים כימי באמצעות כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי מגן</td></tr><tr><td>דלי קרח</td><td>משתנה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת ריצוף אילומינה (למשל, NextSeq500)</td> חממת <td>אילומינה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עם בקרת טמפרטורה ואטמוספירה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030284</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart HiFi DNA פולימראז עם 5X KAPA HiFi מאגר</td><td>רוש</td><td>7958889001</td><td>hotstart פולימראז נאמנות</td></tr><tr><td>גבוהה קולט אדים זרימה למינרית</td><td>חברת מאפייה</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>מנגן כלוריד (MnCl2)</td><td></td> <td>סט מיקרופיפטה 244589</td><td></td>סיגמא אולדריץ'</tr><tr><td></td><td>Rainin</td><td>30386597</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>מתאם NEB מתאם</td><td>E6612AVIAL ניו אינגלנד ביולאבס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB פריימר אוניברסלי</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>E6611AVIAL</td><td>פריימר אוניברסלי</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos לערכת Illumina ניו</td><td>אינגלנד Biolabs</td><td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td><td>פריימרים אינדקס</td></tr><tr><td>נוגדנים לבקרה</td><td>שלילית-Online</td><td>ABIN101961</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>New England Biolabs</td><td>B1500S</td><td></td></tr><tr><td>PCR thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>2231000666</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נעילת פאזה</td><td>Qiagen</td><td>129046</td><td></td></tr><tr><td>פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (PCI)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>15593049</td><td>פנול מזיק במקרה של בליעה או מגע עם העור; יש לטפל במכסה אדים כימי באמצעות כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת Phsophate (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>סיוע לפיפטה</td><td>Drummond Scientific</td><td># 4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול (PEG) 4000</td><td>VWR</td><td>A16151</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד (KOH)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P250-1</td><td>זהירות: KOH הוא חומר מגרה לעיניים/לעור כתמיסה מוצקה וקורוזיבית. ידית במכסה אדים כימי באמצעות כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי מגן</td></tr><tr><td>מעכבי פרוטאז</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>ProteinA/G-MNase</td><td>Epicypher</td><td>15-1016</td><td>pA/G-MNase</td></tr><tr><td>ProteinA-MNase, מטוהר מ-pK19pA-MN</td><td>Addgene</td><td>86973</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS ערכת</td> <td>בדיקהThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בדיקת קיוביט</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט פלואורומטר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>ליגאז מהיר עם 2X מאגר ליגאז מהיר</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>T3010</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט&nbsp; (נאו-אק)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5150-1L</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS רעיל בשאיפה; טפל בזהירות בחללים מאווררים היטב באמצעות כפפות, מגן עיניים ומכונת הנשמה בדרגת N95 בעת טיפול</td></tr><tr><td>בנתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td>NaOH הוא חומר מגרה עיניים/עור כתמיסה מוצקה וקורוזיבית. ידית במכסה אדים כימי באמצעות כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי מגן</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור הפוך סטנדרטי</td><td>Leica</td><td>11526213</td><td></td></tr><tr><td>חומרי ג'ל אגרוז מעבדה סטנדרטיים</td><td>משתנה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומרי מעבדה סטנדרטיים כגון פיפטות סרולוגיות וקצות פיפטות</td><td>משתנה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>חדש אנגליה Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת שולחנית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>2215414</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>תרמומיקסר</td><td>אפנדורף</td><td>5384000020</td><td>לחלופיןיכול להשתמש באמבט מים</td></tr> בסיס <tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Triton X-100 הוא מסוכן; השתמש במעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן בעת טיפול</td></tr><tr><td>באנזים Trypsin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25052</td><td></td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>VWR</td><td>10136084</td><td></td></tr><tr><td>USER ניו</td><td>אינגלנד Biolabs</td><td>M5505S</td><td></td></tr></tbody></table>

לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

קביעת המיקומים המחייבים של חלבון על כרומטין חיונית להבנת תפקידו ויעדיו הרגולטוריים הפוטנציאליים. כרומטין אימונופרציפיטציה (ChIP) היה תקן הזהב לקביעת לוקליזציה של חלבון במשך למעלה מ -30 שנה ומוגדר על ידי שימוש בנוגדן כדי לשלוף את חלבון העניין מכרומטין sonicated או מתעכל אנזימטית. לאחרונה, טכניקות קשירת נוגדנים הפכו פופולריות להערכת לוקליזציה של חלבון על כרומטין בשל הרגישות המוגברת שלהם. מחשוף תחת מטרות & שחרור תחת נוקלאז (CUT&RUN) הוא נגזרת רחבת הגנום של Immunocleavage כרומטין (ChIC) ומשתמש חלבון רקומביננטי A קשור לנוקלאז מיקרוקוקאלי (pA-MNase) כדי לזהות את האזור הקבוע IgG של הנוגדן מיקוד חלבון של עניין, ובכך מאפשר מחשוף ספציפי לאתר של ה- DNA מאגף את החלבון של עניין. ניתן להשתמש ב- CUT&RUN כדי ליצור פרופיל לשינויים בהיסטון, גורמי שעתוק וחלבונים מחייבי כרומטין אחרים כגון גורמי שיפוץ נוקלאוזום. חשוב לציין, CUT&RUN יכול לשמש כדי להעריך את הלוקליזציה של חלבונים הקשורים euchromatic או הטרוכרומטיים ושינויים histone. מסיבות אלה, CUT&RUN היא שיטה רבת עוצמה לקביעת פרופילי האיגוד של מגוון רחב של חלבונים. לאחרונה, CUT&RUN עברה אופטימיזציה ליצירת פרופילים של גורמי שעתוק באוכלוסיות נמוכות של תאים ותאים בודדים והפרוטוקול הממוטב נקרא CUT&RUN של קלט נמוך במיוחד (uliCUT&RUN). כאן, פרוטוקול מפורט מוצג עבור פרופיל גורם תא יחיד באמצעות uliCUT&RUN בתבנית ידנית 96-well.

כאן, פרוטוקול מפורט מוצג עבור פרופיל חלבון תא יחיד על כרומטין באמצעות 96-well בפורמט ידני uliCUT&amp;RUN. בעוד התוצאות ישתנו בהתאם לפרופיל החלבון (בשל שפע חלבון ואיכות נוגדנים), סוג התא, וגורמים תורמים אחרים, התוצאות הצפויות עבור טכניקה זו נדונות כאן. יש להעריך את איכות התא (מראה התא ואחוז התאים הקיימים) ואת המיון של תא יחיד לפני או בזמן מיון התא החי למאגר NE. דוגמה למושבות תאים של ES ולמיון תאים מוצגת באיור 2A,B. באופן ספציפי, אין להשתמש בתאים באיכות נמוכה, ואם האיכות היא ב...

CUT&RUN והוריאנטים שלה יכולים לשמש לקביעת תפוסת החלבון בכרומטין. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבוע לוקליזציה של חלבון על כרומטין באמצעות uliCUT&RUN של תא יחיד.

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN היא טכניקה רבת עוצמה לקביעת לוקליזציה של חלבונים בכרומטין, וכאן אנו מתארים גרסה חד-תאית של טכניקה זו בפורמט ידני של 96 בארות. רוב טכניקות הלוקליזציה של חלבונים, כמו ChIP-seq, דורשות קלט תא גבוה ולוקח כשלושה ימים להשלים. CUT&RUN, עקב האות הגבוה והרקע הנמוך, עברה אופטימיזציה ליישום של תאים נמוכים ותא יחיד, וניתן להשלים אותה ביום אחד.אנו מדמיינים כי טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כמעט על כל מדגם ביולוגי והוא יכול להיות חזק במיוחד כדי לקבוע לוקליזציה גורם בדגימות נדירות ושפע נמוך, כגון דגימות חולים יקרות. לפני ביצוע ניסויים בתא יחיד, בדוק את הנוגדן והטכניקה על מספר גבוה של תאים שאינם יקרים. המגבלה העיקרית של ניסוי זה היא התלות בנוגדן חזק.מדגימה את ההליך היא סנטנה לארדו, מומחית מחקר מנוסה מהמעבדה שלי. לאחר מיון תאים בודדים וגרעינים מחייבים לחרוזים, הנח את הלוח בן 96 הבאר על מתלה מגנטי של 96 בארות ואפשר לחרוזים להיקשר למשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן, להסיר ולהשליך את supernatant.הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חוצץ חסימה לחרוזים הקשורים לגרעין, ערבבו עם צינורות עדינים ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well ולאפשר supernatant לנקות לפחות של חמש דקות. לאחר מכן, להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 100 microliters של חוצץ לשטוף לכל תגובה עם צינורות עדינים. מניחים את הצלחת בחזרה על המתלה המגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant. הקדישו מחדש את החרוזים ל-25 מיקרוליטרים של מאגר כביסה לכל תגובה עם צינורות עדינים.צור תערובת ראשית של אמן נוגדנים על-ידי ציטוט 25 מיקרוליטרים של מאגר כביסה לכל תגובה ולאחר מכן הוסף 0.5 מיקרוליטרים של נוגדנים לכל תגובה. הוסיפו 25.5 מיקרוליטרים של תערובת מאגר שטיפת הנוגדנים, ולאחר מכן צינורות עדינים לכל דגימה המטופלת בנוגדן המכוון לחלבון העניין. דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, שוב למקם את הדגימות בחזרה על מתלה מגנטי 96-well. ברגע supernatant הוא ברור, להסיר ולהשליך אותו מבלי להפריע חרוזים. לאחר הסרת הצלחת מן המתלה המגנטי, לשטוף את החרוזים עם 100 microliters של חוצץ לשטוף resuspend על ידי צינורות.לאחר הנחת הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96-well ולהשליך supernatant כפי שהוכח בעבר, resuspened כל מדגם ב 25 מיקרוליטרים של חוצץ לשטוף. הפוך חלבון תערובת מאסטר MNase על ידי הוספת 25 מיקרוליטר של מאגר לשטוף כמות אופטימלית של חלבון A MNase לכל תגובה. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של חלבון תערובת ראשית של MNase לכל דגימה, כולל דגימות הבקרה.לדגור על הדגימות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי של 96 בארות. אפשר supernatant לנקות לפחות חמש דקות ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע החרוזים.לאחר הסרת הצלחת מן המתלה המגנטי, לשטוף את החרוזים עם 100 microliters של חוצץ לשטוף מחדש על ידי צינורות עדינים. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96 היטב ולהשליך את supernatant כפי שהוכח בעבר. לאחר מכן, להסיר את הדגימות מן המתלה המגנטי ואת resuspend החרוזים ב 50 מיקרוליטרים של חיץ לשטוף על ידי צינורות עדינים.שיווי משקל את הדגימות לאפס מעלות צלזיוס בתערובת מי קרח במשך חמש דקות ולאחר מכן להסיר את הדגימות מאמבט מי הקרח. הוסיפו מיקרוליטר אחד של סידן כלורי 100 מ"מ באמצעות פיפטה רב-ערוצית. מערבבים היטב שלוש עד חמש פעמים עם צינורות עדינים באמצעות פיפטה רב ערוצית בנפח גדול ולאחר מכן להחזיר את הדגימות לאפס מעלות צלזיוס.התחל טיימר של 10 דקות ברגע שהצלחת חוזרת לאמבטיית מי הקרח. עצור את התגובה על ידי צנרת 50 מיקרוליטרים של פתרון המכיל ריכוז כפול של RSTOP + ולחוצץ לתוך כל באר באותו סדר כמו סידן כלורי נוספה. לדגור על הדגימות במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לסובב את הצלחת ב 16, 000 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי של 96 בארות. תן לסופר-נרטיב להתפנות לחמש דקות לפחות.לאחר מכן, להעביר supernatants לצלחת 96-well טרי ולהשליך את החרוזים. להפקת דנ"א, הוסיפו מיקרוליטר אחד של 10% SDS ו-0.83 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K לכל דגימה וערבבו את הדגימות על ידי צנרת עדינה. לדגור על הדגימות במשך 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס.מחזירים את הצלחת לטמפרטורת החדר. הוסיפו 46.6 מיקרוליטרים של נתרן כלורי בעל חמישה טוחנים ו-90 מיקרוליטרים של 50%PEG4000 וערבבו באמצעות צינורות עדינים. הוסיפו 33 מיקרוליטרים של חרוזי מגנטיט פוליסטירן לכל דגימה ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי ומניחים לסופר-נרטיב להתפנות למשך כחמש דקות. לאחר מכן, בזהירות להשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים. יש לשטוף פעמיים עם 150 מיקרוליטרים של 80% אתנול מבלי להפריע לחרוזים.לסובב את הצלחת לזמן קצר ב 1000 פעמים G במשך 30 שניות. מניחים את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96-well ולהסיר את כל האתנול שיורית מבלי להפריע לחרוזים. אוויר לייבש את הדגימות במשך כשתיים עד חמש דקות.לפנק מחדש את החרוזים ב 37.5 microliters של 10 מילימולרי TRIS הידרוכלוריד של pH 8 ודגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי ומאפשרים לחרוזים להיקשר במשך חמש דקות. העבירו 36.5 מיקרוליטרים של הסופר-נרטיב ללוחית 96 בארות תואמת תרמוציקלר טרייה והשליכו את החרוזים.לאחר ביצוע הערכת איכות התא, נבדקו מראה התא ואחוז, המוכיחים כי אין להשתמש בתאי גזע עובריים באיכות נמוכה. מיון של תאים בודדים בוצע באמצעות כתם Hoechst 33342, ותאי הבדיקה נספרו כדי להבטיח שאפס או תא אחד נמצא בכל באר. ניתוח ג'ל Agarose גילה סולם משקל מולקולרי נמוך וספריות uliCUT&RUN חד-תאיות בודדות.ניתוח הספרייה התת-אופטימלי והאופטימלי מראה סולם במשקל מולקולרי נמוך, ספרייה תת-אופטימלית עקב עיכול Mnase לא יעיל, וספרייה מוצלחת עם עיכול מתאים. התפלגות מנתח הקטעים מראה שהגודל הצפוי של תא בודד נע בין 150 ל- 500 זוגות בסיסים. עם זאת, בחלבונים גדולים, DNA יהיה סביב 270 זוגות בסיס.תפוסת חלבונים באמצעות דפדפן גנום לוקוס יחיד המתאר מספר תא גבוה או שליטה שלילית ו- CTCF uliCUT&RUN חד-תאי חשף כי תא יחיד ייצג במידה רבה פסגות חזקות, בדומה ל- uliCUT&RUN של תאים גבוהים. מפות חום של CTCF חד-תאי או שליטה שלילית חשפו דפוס ברור של העשרת קריאה ישירות מעל אתרי איגוד CTCF מבוססים בתאים. מפות חום חד-ממדיות מראות צפיפות קריאה גבוהה יותר על פני אתרי איגוד CTCF מבוססים בספריות חד-תאיות ביחס לאזורים הסמוכים ובקרות ללא נוגדנים, ומדגימות העשרה ספציפית לנוגדנים באתרי איגוד מבוססים.חשוב לאזן את הגרעינים הקשורים לחרוזים באמבט מי הקרח ולא לחמם יתר על המידה את הדגימה על תוספת סידן כלוריד כדי למנוע עיכול יתר של הכרומטין.

single-cell-factor-localization-on-chromatin-using-ultra-low-input

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

שיטה מקבילה מאוד למדידת המחשוף הספציפי לאתר של ה-DNA ברמת מולקולה אחת מתוארת. פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה באמצעות ההגבלה אנדונוקלאז Nde. ניתן לשנות את השיטה בקלות כדי ללמוד כל תהליך שתוצאות מחשוף DNA ספציפי לאתר.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

מחשוף תחת מטרות ותגיות (CUT&amp;Tag) היא אסטרטגיית פרופיל אפיגנומית כרומטין יעילה. פרוטוקול זה מציג אסטרטגיית CUT&amp;Tag מעודנת ליצירת פרופיל של שינויים בהיסטון בצמחים.

יצירת פרופיל של שינוי H3K4me3 בצמחים באמצעות מחשוף תחת מטרות ותגיות

Hi-C 3.0 הוא פרוטוקול Hi-C משופר המשלב פורמלדהיד ודיסוקינימידיל גלוטראט קרוסלינקרים עם קוקטייל של אנזימי הגבלה DpnII ו- DdeI כדי להגדיל את יחס האות לרעש ואת הרזולוציה של זיהוי אינטראקציית כרומטין.

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים על פני סולמות אורך

כאן מוצג פרוטוקול למיפוי ארגון הגנום התלת-ממדי ברזולוציית נוקלאוזומים בשיטת לכידת קונפורמציה כרומוזומים רחבת גנום Micro-C-XL.

מיפוי אינטראקציות גנום תלת-ממדי של יונקים עם Micro-C-XL

מוצג כאן פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים המותאם לחקר ויסות שעתוק בסיבי שריר על ידי שסע מתחת למטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&amp;RUN).

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&amp;RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

ביטוי גנים מוסדר על ידי אינטראקציות של מקדמי גנים עם אלמנטים רגולטוריים דיסטליים. כאן, אנו מסבירים עד כמה קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C) מאפשר לזהות אינטראקציות אלה בסוגי תאים נדירים, שבעבר לא היו ניתנים למדידה.

זרימת עבודה משולבת לחקר ארכיטקטורת הגנום המרחבי-זמני הממוקדת במקדם באוכלוסיות תאים נדירות

פרוטוקול זה מנחה ביואינפורמטיקה מתחילים באמצעות צינור ניתוח CUT&amp;RUN מבוא המאפשר למשתמשים להשלים ניתוח ראשוני ואימות של נתוני רצף CUT&amp;RUN. השלמת שלבי הניתוח המתוארים כאן, בשילוב עם ביאור שיא במורד הזרם, תאפשר למשתמשים להסיק תובנות מכניסטיות לגבי ויסות הכרומטין.

ניתוח מבוא ותיקוף של נתוני רצף CUT&#38;RUN

מתואר פרוטוקול חיתוך אופטימלי תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז ואחריו פרוטוקול רצף מהדור הבא (CUT&amp;RUN-seq) עבור קווי תאי סרטן ריאות נוירואנדוקריניים קטנים. הוא מאפשר מיפוי גנומי רחב של שינויים שונים בהיסטונים ואתרי קישור לפקטור שעתוק (למשל E2F7) כדי לחקור די ויסות אפיגנטי ושעתוק בפתוביולוגיה של SCLC.

מיפוי גנומי רחב של שינויים בהיסטונים ואתרי קישור לפקטורי שעתוק בקווי תאי סרטן ריאות נוירואנדוקריניים קטנים באמצעות CUT&amp;RUN

למדו טכניקת CUT&RUN ללוקליזציה של גורמים בכרומטין ברמת תא יחיד בפורמט 96-well ידני. שיטה זו מציעה אות גבוה ורקע נמוך לעומת ChIP-seq, מתאימה לדגימות נדירות ונדירות ביולוגיות וניתנת לביצוע ביום אחד.

לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז

גלה סרטונים נוספים