Name: בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: למדו פרוטוקול מפושט לבידוד תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית מעיני עכברים ראשוניים. שיטה זו מאפשרת חקר מחסום הדם-רשתית החיצוני ומחלות רשתית כגון ניוון מקולרי קשור לגיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לעיניים (NEI), קרן מכון העיניים הלאומי (NEI) R01 EY029751-04

נעשה שימוש בבעלי חיים בהתאם להנחיות פרוטוקול החיות IACUC של אוניברסיטת אוקלנד מספר 21063 וההנחיות של הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים בחקר עיניים וראייה.
1. הכנת פתרון
<ol><li>הכינו את מדיית תרבית תאי ה-RPE המלאה על ידי השלמת תערובת הנשר המתוקן הבינוני/מזין F-12 (DMEM/F12) של דולבקו עם 25% סרום בקר עוברי (FBS), 1.5% פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.02% גנטמיצין.</li>
	<li>הכינו את אנזים A על ידי תוספת של 741 μL של תמיסת המלח המאוזנת (HBSS) של Hank עם 127 μL של תמיסת מלאי קולגן ו-132 μL של תמיסת מלאי היאלורונידאז. זה עושה נפח סופי של 1 מ"ל, אשר יכול לטפל ארבע עיניים.<ol><li>הכינו את תמיסת מלאי הקולגן על ידי המסת 1 מ"ג קולגן מקלוסטרידיום היסטוליטיקום ב-41 מ"ל של HBSS (19.5 יחידות למ"ל).</li>
		<li>הכינו את תמיסת המלאי של היאלורונידאז על ידי המסת 1 מ"ג של היאלורונידאז מאשכי בקר ב-18.4 מ"ל של HBSS (38 יחידות למ"ל).</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו את אנזים B על-ידי הוספת שני חלקים של 0.25% טריפסין-EDTA לשלושה חלקים של HBSS. שים לב שהנפח הכולל תלוי במספר העיניים שנותחו; ניתן להשתמש ב-1 מ"ל של אנזים B לטיפול בארבע עיניים.</li>
</ol>2. אנוקליזציה
<ol><li>המתת עכבר באופן אתי באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני (CO2) בהתאם לתקני IACUC21.<ol><li>בקצרה, מקם את בעלי החיים בתא CO 2 כדי להציג 100% CO 2 עם קצב מילוי של 30%-70% מנפח התא לדקה עם CO 2 כדי להשיג חוסר הכרה תוך2 עד 3 דקות, עם מצוקה מינימלית לעכברים.</li>
		<li>אשר מוות (חוסר נשימה וצבע עיניים דהוי), ולאחר מכן להעביר את העכבר מן הכלוב לאזור כירורגי מעוקר נקי (קרצוף עם אלכוהול) מצויד בציוד כירורגי מעוקר.</li>
	</ol></li>
	<li>הנח את העכבר על משטח תחתון סטרילי.</li>
	<li>נצנום את העיניים על ידי לחיצה על פינצטה בסגנון 5/45 על אזור המסלול כדי לגרום לפרופטוזה, ולאחר מכן הזזת הפינצטה לחלק האחורי של העין. חלץ את העיניים, עם עצב הראייה שלם, על ידי משיכת העיניים בעדינות מחלל המסלול.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, לטבול את העיניים בצינור microcentrifuge 2 מ"ל המכיל 1mL של 5% Povidone-יוד. לדגור את העיניים בטמפרטורת החדר במשך 2-3 דקות.</li>
	<li>הסר את העיניים מתמיסת פובידון-יוד והנח אותן בצלחת פטרי. באמצעות פיפטה העברה סטרילית, לשטוף את העיניים עם HBSS עד צבע כתום של פובידון-יוד נעלם. זה לוקח בערך שתיים או שלוש כביסות.</li>
	<li>הניחו את העיניים בצלחת פטרי חדשה בקוטר 60 מ"מ וטבלו אותן בקור (2-8 מעלות צלזיוס) במדיית תרבית תאי RPE מלאה שהוכנה בשלב 1.1.</li>
</ol>3. דיסקציה
<ol><li>תחת מיקרוסקופ כירורגי, השתמש בפינצטה בסגנון M5S ובמספריים של Vannas כדי להסיר את רקמת החיבור והשרירים החוץ-עיניים. הערה: הדיסקציה נעשית מתחת למכסה המנוע של הרקמה בסביבה סטרילית לחלוטין. עם זאת, למטרות וידאו, המיקרוסקופ המנתח הוצב מחוץ למכסה המנוע כדי להשיג הדגמה/צילום באיכות גבוהה יותר. הנחת פיסת נייר טישו קטנה ללא מוך מתחת לעין משפרת את היציבות במהלך הנתיחה. לאחר מכן ניתן להחזיק את העיניים באופן זמני (לא יותר משעה) במדיה של תרבית תאי RPE קרים. עם זאת, עדיף להמשיך ישירות לשלב הבא מיד לאחר ניקוי העיניים.</li>
	<li>העבירו את העיניים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של תמיסת אנזים A לכל ארבע עיניים. לאחר מכן, לדגור את העיניים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות.</li>
	<li>הסר את העיניים מן האינקובטור ואת צינור microcentrifuge. לאחר מכן, העבירו אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש המכיל 1 מ"ל של תמיסת אנזים B לכל ארבע עיניים. לדגור את הצינור באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות.</li>
	<li>הניחו את העיניים בצלחת תרבית תרחיף חדשה בקוטר 60 מ"מ המכילה 10 מ"ל של מדיית גידול מלאה של תאי RPE. לאחר מכן לדגור את העיניים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.</li>
	<li>מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ כירורגי ומתחילים לנתח.</li>
	<li>הסר את החלק הקדמי של העין (קרנית, איריס ועדשה) מהחלק האחורי של העין (הרשתית האחורית).<ol><li>תפסו את העין עם מלקחיים בסגנון M5S ובצעו חתך בקטע ora serrata (החלק הקדמי ביותר של הרשתית שבו מסתיים התכלת) עם להב #11 או מחט של מזרק.</li>
		<li>תפסו את החלק הפנימי של החתך עם זוג מלקחיים אחד, ותפסו את הקרנית עם זוג מלקחיים נוסף. מתחילים למשוך או לקרוע לאט את הקרנית מהרשתית. הקפידו לקרוע במרווחים קטנים ולרדת מהקרע תוך כדי הסרת הקרנית, כדי להבטיח שה-RPE יישאר ברובו שלם ויגרום לקרע נקי יותר. הערה: לאחר ניתוק מוחלט של הקרנית, ניתן לראות את הקשתית והעדשה.</li>
		<li>מפרידים גם את הקרנית וגם את הקשתית.</li>
	</ol></li>
	<li>הפרד את העדשה מהעין בדחיסה עדינה של החצי האחורי של העין.</li>
	<li>כדי להסיר את הרשתית העצבית משכבת ה-RPE, תפסו את השכבה החיצונית של העין בעזרת זוג פינצטה אחד ומקמו את הזרוע של זוג פינצטה שני בין ה-RPE לשכבות העצביות. משם, משכו בעדינות או הוציאו את הרשתית העצבית הרחק משכבת ה-RPE. יש להשליך את הרשתית העצבית. הערה: בסרטון, הרשתית העצבית והעדשה מוסרות יחד. עם זאת, למתחילים, יהיה קל יותר להסיר כל אחד בנפרד. מה שנותר הוא RPE, כורואיד וסקלרה.</li>
	<li>יש להשליך את הקרנית, הקשתית, העדשה והרשתית העצבית. העבירו את העינית הנותרת לאזור חדש על המנה נקי מפסולת.</li>
	<li>כדי להפריד את ה-RPE מהכורואיד והסקלרה, יש לגרד בעדינות את החלק הפנימי של ה-EYECUP בעזרת פינצטה בסגנון 5/45 כדי להבטיח את הפרדת תאי ה-RPE. תאי ה-RPE נראים מעוננים כאשר הם מושעים במדיית הגדילה המלאה של תאי ה-RPE.</li>
	<li>שאפו את התאים באמצעות פיפטה סטרילית של 3.2 מ"ל והעבירו לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל המכיל מדיית גידול מלאה של תאי RPE.</li>
</ol>4. צנטריפוגה
<ol><li>מניחים את שפופרת הצנטריפוגה 15 מ"ל המכילה תאי RPE ראשוניים בתוך צנטריפוגה וצנטריפוגה את התאים בגודל 300 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שאפו את הסופר-נאטנט והחזירו את הכדור עם 10 מ"ל של מדיית צמיחה מלאה של RPE. מדיית הגידול המלאה של RPE ספציפית יותר לצמיחת RPE מאשר תאים מזהמים אחרים, כגון תאי מולר או תאי אנדותל כורואידים. תאי מולר זקוקים למדיית גלוקוז גבוהה, בעוד שתאי אנדותל כורואידיים זקוקים לגורמי גדילה ספציפיים. על ידי שינוי המדיה והעברת התרבית, רק תאי ה-RPE ימשיכו לגדול.</li>
</ol>5. תרבית תאים
<ol><li>צלחת את תאי ה-RPE הראשוניים שעברו החייאה על צלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ"מ והעבירו אותם לאינקובטור (לאחר אימות הטוהר על-ידי צביעת תאים בסמנים ספציפיים של תאי RPE/Müller, כפי שמצוין באיור 1E-N). דגירה של התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. הערה: הסמנים שבהם נעשה שימוש מוזכרים בטבלת החומרים. שלב זה מבוצע לאחר הקמת התרבות.</li>
	<li>לדגור על התאים במשך כ -5 ימים כדי לגדול. במהלך תקופה זו, אין לשנות את המדיה, להפריע לתאים, או להזיז את צלחת תרבית התא (זהו שלב קריטי בפרוטוקול; לאחר בידוד, התאים צריכים להיות דגירה ולא להיות מופרע במשך 5 ימים). הערה: מספר התאים תלוי במספר העיניים המשמשות לבידוד. מספר גדול יותר של עיניים מבודדות יניב מספר גדול יותר של תאים. בידוד RPE משתי עיניים יניב ~ 440,000-880,000 תאים, או 5%-10% מצלחת פטרי 100 מ"מ, שיכולה להכיל 8.8 מיליון תאים.</li>
</ol>6. מעבר
<ol><li>שאפו את התקשורת ושטפו עם 2 מ"ל של PBS. לאחר מכן שאפו את ה- PBS.</li>
	<li>מוסיפים 4 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA (1x), או מספיק כדי לכסות את בסיס המנה. דגירה במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הוסף 8 מ"ל של מדיית RPE שחוממה מראש או פי שניים מהנפח של כמות הטריפסין ששימשה בשלב 6.2. לאחר מכן לאסוף את התאים ולמקם אותם בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נאטנט והחזירו את הכדור ב-10 מ"ל של מדיה מלאה של תרבית תאי RPE. צלחת את כל המתלה בצלחת סטרילית 100 מ"מ פטרי. הערה: ניתן להעביר את התאים עד ארבע או חמש פעמים18. עם זאת, תוצאות הניסוי העקביות ביותר נמצאות לאחר שניים או שלושה מעברים. לאחר שניים עד ארבעה מעברים, התאים שינו את צורתם (כפי שניתן לראות באיור 1D) כך שיהיו מוארכים יותר, הצטברו במרכז הצלחת, הפסיקו לגדול והתנתקו.</li>
	<li>השתמש בפרוטוקולים אימונופלואורסצנטיים, בהתאם לשיטות שפורסמו בעבר 8,14,15,16, כדי להכתים ולאמת את הספציפיות של RPE.</li>
</ol>7. אימונופלואורסצנציה
הערה: אימונופלואורסצנציה בוצעה לפי השיטות שפורסמו בעבר 8,14,15,16,17,18 כדי להכתים ולאמת את הספציפיות של RPE. הצביעה של תאי RPE ראשוניים נעשתה בדרך כלל במעברים P1 ו-P2. כאן, סקירה קצרה של פרוטוקול immunofluorescent מוצג.
<ol><li>זרע את התאים על שקופית תא תרבית תאים (30,000 תאים לכל באר עבור שקופית תא 8 בארות).</li>
	<li>תרבית את התאים במדיית תרבית תאי RPE מלאה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24-48 שעות.</li>
	<li>כאשר התאים נפגשים ב-80%-90%, שאפו החוצה את המדיה ושטפו את שקופית התא עם PBS אחד.</li>
	<li>תקן את השקופית עם 4% paraformaldehyde במשך 10-15 דקות.</li>
	<li>שאף החוצה את 4% paraformaldehyde ולאחר מכן לחסום עם פתרון חסימה (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>שאפו את תמיסת החסימה והוסיפו את הנוגדן העיקרי, RPE65, ודגרה במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (עם ריכוז נוגדנים הנע בין 1:200-1:250 במאגר חוסם, בנפח של 150-200 μL/slide). לאחר מכן, יש לכבס שלוש פעמים עם PBS/TX-100 (5-10 דקות כל כביסה).</li>
	<li>שאפו את הנוגדן הראשוני והוסיפו את הנוגדן המשני (עם ריכוז נוגדנים 1:1,000 במאגר חוסם, בנפח של 150-200 μL/slide). דגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שאפו את הנוגדן המשני. יש לכבס שלוש פעמים עם PBS/Trtion X-100 (5-10 דקות כל כביסה).</li>
	<li>הוסף טיפה של מדיום הרכבה DAPI כדי לסמן את הגרעינים והנח כיסוי מעל המגלשה. ודא שאין בועות מתחת לכיסוי.</li>
	<li>לאחר מכן, צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, בליווי מצלמת מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה (HRM) ותוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>

<ol><li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li>
<li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li>
<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li>
<li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li>
<li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li>
<li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+human+RPE%3A+morphometric+analysis+of+macular%2C+equatorial%2C+and+peripheral+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li>
<li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li>
<li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%3A+review+of+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li>
<li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19%2C+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li>
<li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li>
<li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356(2021).</li>
<li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatric+Disease+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li>
<li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393(2020).</li>
<li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases%3A+role+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259(2021).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997(2018).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li>
<li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020).</li>
<li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE65%3A+role+in+the+visual+cycle%2C+human+retinal+disease%2C+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Genetics%22%5BJournal%5D)">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li>
<li>Pérez-Álvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li>
<li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+%28BRB%29+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119(2020).</li>
<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomethylfumarate+induces+%CE%B3-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+%28RPE%29+and+erythroid+cells%2C+and+in+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר כי הם רלוונטיים לתוכן מאמר זה.

הפרוטוקול הנוכחי הוא הליך מפורט מדווח, שונה ופשוט לבידוד RPE מעיני עכבר. הפרוטוקול כולל אנוקליציה, דיסקציה, איסוף, זריעה, תרבית ואפיון של תאי RPE שבודדו מעיני עכבר.
ישנן כמה מגבלות וצעדים קריטיים שיש למלא לבידוד RPE מוצלח, כגון גיל העכברים, מספר העיניים שנותחו, גודל צלחת תרבית הרקמה או המנה, ואזהרות לאחר זריעה, אחסון והעברה. כדי להיות מסוגלים להעביר את התאים המבודדים עד שלוש או ארבע פעמים, העכברים הטובים ביותר הגילאים הם בין 18-21 ימים. כדי שיהיה מספר סביר של תאים מבודדים המסוגלים לגדול ולהתרב...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

תאי אפיתל פיגמנטי רשתית (RPE) ממוקמים בין הכורואיד לרשתית העצבית, ויוצרים שכבה חד-שכבתית פשוטה של תאים קובואידים הנמצאת מאחורי תאי הפוטורצפטור (PR)1. ה-RPE ממלא תפקיד קריטי בשמירה על סביבה בריאה לתאי PR, בעיקר על ידי הפחתת הצטברות מופרזת של מיני חמצן תגובתי (ROS) ונזקי חמצון כתוצאה מכך1. תאי RPE מפקחים על תפקודים רבים, כגון המרה ואחסון של רטינואידים, קליטת אור מפוזר, הובלת נוזלים ויונים, ופאגוציטוזה של קרום המקטע החיצוני PR 2,3. שינויים ב-RPE (מורפולוגיה/תפקוד) יכולים לפגוע בתפקודם ולהוביל לרטינופתיה וזוהי תכונה משותפת להפרעות עיניים רבות4. מחלות עיניים רבות קשורות לשינויים במורפולוגיה ובתפקוד של תאי RPE, כולל מחלות גנטיות מסוימות כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, אמאורוזיס מולד של לבר ולבקנות 4,5,6, כמו גם הפרעות עיניים הקשורות לגיל כגון רטינופתיה סוכרתית (DR) וניוון מקולרי תלוי גיל (AMD)7,8 . תאים אנושיים הם הרצויים ביותר, ולכן זה יהיה אידיאלי לחקור הפרעות RPE בתאי RPE אנושיים ראשוניים ליצירת מונולרים RPE. עם זאת, עניינים אתיים והזמינות המוגבלת של תורמים אנושיים בשל העובדה שרוב ההפרעות הללו מובילות לתחלואה9, אך לא בהכרח לתמותה10, ובכך מונעות בידוד של תאי RPE אנושיים ראשוניים. עובדה זו הופכת את התרבות של תאי RPE מתורמים לא אנושיים של בעלי חיים לחלופה מועדפת. מכרסמים, במיוחד עכברים, נחשבים למודל נהדר לחקר מחלות עיניים שונות מכיוון שטכנולוגיה מהונדסת מבוססת באופן נרחב יותר במינים אלה11. אף על פי שהשימוש בתאי RPE ראשוניים בתרבית מציע יתרונות רבים, היה קשה לשמור על תאים גדלים במשך מעברים רבים, או לאחסן את התאים ולעשות בהם שימוש חוזר. המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא גיל העכברים; עכברים המשמשים לבידוד RPE צריכים להיות בגיל צעיר מאוד (18-21 ימים הוא אופטימלי) מכיוון שהיה קשה לתרבת תאי RPE מעכברים בוגרים11,12,13. ניתן לבודד תאי RPE מעיני עכברים בכל גיל, אולם עד ארבעה מעברי תאים הצליחו רק עם עכברים צעירים (בני 18-21 ימים). בידוד RPE מרשתיות עכברים, תוך שימוש הן בעכברי C57BL6 והן בעכברים מהונדסים עם מחיקת קולטני N-מתיל-D-אספרטט (NMDARs) בתאי ה-RPE, בוצע כדי לחקור את ההשפעה של הומוציסטאין של חומצת אמינו מוגברת על ההתפתחות וההתקדמות של AMD14. בנוסף, תאי RPE ראשוניים מבודדים סייעו בהצעת מטרה טיפולית ל-AMD על ידי עיכוב של NMDARs בתאי RPE14. ישנם כמה חוסמי NMDAR שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) ומשמשים כיום לטיפול בבלבול בינוני עד חמור (דמנציה) הקשור למחלת אלצהיימר (AD), כגון ממנטין16, אשר יכול להיות מטרה טיפולית פוטנציאלית עבור AMD14. יתר על כן, תאי RPE ראשוניים מבודדים של עכברים שימשו לזיהוי סמני דלקת ולאינדוקציה המוצעת של דלקת כמנגנון בסיסי לתכונות הנגרמות על ידי הומוציסטאין של AMD ו- AD באמצעות עכבר מהונדס גנטית (CBS), המציג רמה גבוהה של הומוציסטאין16,17.
פרוטוקול זה שימש לבידוד תאי RPE הן מעכברי C57BL/6 מסוג בר והן מעכברים מהונדסים שפותחו במעבדה שלנו כהתאמה פשוטה של פרוטוקולי בידודאחרים שפורסמו 13,18,19 כדי להגיע לפרוטוקול ישים ואמין בקלות. אין העדפת מין בפרוטוקול זה. בעוד שגילי עכברים הם קריטיים לתהליך הבידוד, עכברים צעירים ומבוגרים יותר (גילאי 18-21 יום) ועכברים מבוגרים יותר בכל גיל (עד 12 חודשים) שימשו לבידוד RPE. עם זאת, שמנו לב שתאי ה-RPE שבודדו מהעכברים בגיל צעיר חיו זמן רב יותר, וניתן היה לבצע עד ארבעה מעברים. ניתן היה להעביר את תאי ה-RPE שבודדו מעכברים מבוגרים פעם או פעמיים, ואז הם יפסיקו לגדול בקצב רגיל וישנו את צורתם כך שיהיו מוארכים יותר (תאים דמויי פיברובלסט). כמו כן נצפה אובדן פיגמנטציה וירידה בהידבקות לצלחת תרבית הרקמה ואחריה ניתוק.

<table><tbody><tr><td>: 100 מ"ל</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מ- Clostridium histolyticum&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C7657-25MG</td><td>לאנזים עבודה,</td></tr><tr><td>פיפטות העברה חד פעמיות מדורגות: 3.2 מ"ל סטרילי</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>&nbsp; גיבקו&nbsp;</td><td>11330</td><td>מדיה לגידול תאי RPE&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>למדיית תרבית תאים RPE מלאה</td></tr><tr><td>Gentamicin Reagent</td><td>Solution gibco</td><td>15750-060</td><td>למדיה מלאה של תרבית תאים RPE</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>88284</td><td>לאנזימים עובדים (A& ב)&nbsp;</td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 חממה</td><td>תרמו מדעי</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase מאשכי בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506-500MG</td><td>לעבודה אנזים A</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok מזרק עם מחט מחוברת 21 G x 1 1/2 אינץ', סטרילי, לשימוש חד פעמי, 3 מ"ל</td><td>BD</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרו צנטריפוגה: 2 מ"ל</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי נגד RPE65 עכבר&nbsp;</td><td>Abcam, קיימברידג', MA, ארה"ב</td><td>ab78036</td><td>לצביעה IF&nbsp;</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>למדיה שלמה של תרבית תאים RPE</td></tr><tr><td>פינצטה לפעולה חיובית, סגנון 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>מספריים איריס סטנדרטי ישר 11.5 ס"מ</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 צנטריפוגה</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי, #11, נירוסטה</td><td>Bard-Parker</td><td>צלחת</td> תרבית מתלה 371211 <td></td></tr><tr><td>60 מ"מ x 15 מ"מ צלחת</td> תרבית רקמות <td>בסגנון קורנינג</td><td>430589</td><td></td></tr><tr>: צינורות <td>טורנדו</td><td>353003</td><td></td><td>קורנינג בסגנון 100x20 מ"מ</td></tr>: צינורות טורנדו <tr><td>15 מ"ל</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>: 50 מ"ל</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (1x) 0.25% </td><td>gibco</td><td>2186962</td><td>לאנזים עבודה B</td></tr><tr><td>פינצטה 5MS, 8.2 ס"מ, ישר, 0.09x0.05 מ"מ טיפים</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה סגנון פעולה חיובית 5, ביולוגי, Dumostar, גימור מלוטש, 110 מ"מ OAL</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>רפידות תחתונות, בינוניות: 23 אינץ' x 36 אינץ'</td> <td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים קפיצים - 2.5 מ"מ Cutting Edge</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

שכבת האפיתל הפיגמנטי ברשתית (RPE) נמצאת מיד מאחורי הפוטורצפטורים ומכילה מערכת מטבולית מורכבת הממלאת מספר תפקידים קריטיים בשמירה על תפקודם של הפוטורצפטורים. לפיכך, המבנה והתפקוד של RPE חיוניים לשמירה על ראייה תקינה. כתב יד זה מציג פרוטוקול מבוסס לבידוד תאי RPE של עכבר ראשוני. בידוד RPE הוא כלי נהדר לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפתולוגיה של RPE במודלים שונים של עכברים של הפרעות עיניים. יתר על כן, בידוד RPE יכול לסייע בהשוואת תאי RPE ראשוניים של עכברים שבודדו מעכברים מסוג בר ומעכברים מהונדסים גנטית, כמו גם בבדיקת תרופות שיכולות להאיץ את התפתחות הטיפול בהפרעות ראייה. כתב היד מציג פרוטוקול בידוד RPE שלב אחר שלב; ההליך כולו, מן enucleation כדי זריעה, לוקח בערך 4 שעות. אין לשנות את המדיה במשך 5-7 ימים לאחר הזריעה, כדי לאפשר צמיחה של התאים המבודדים ללא הפרעה. תהליך זה מלווה באפיון של מורפולוגיה, פיגמנטציה וסמנים ספציפיים בתאים באמצעות אימונופלואורסצנציה. ניתן להעביר תאים לכל היותר שלוש או ארבע פעמים.

אימות הספציפיות, הטוהר ותפקוד המחסום/היווצרות של תאי RPE מבודדים התאים שבודדו נבדקו תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא את הכדאיות, המורפולוגיה והפיגמנטציה שלהם. תמונות מ-P0 ו-P1 (איור 1A,B) ותמונות מ-P0 ו-P4 צולמו (איור 1C,D) כדי להראות את השינויים בתאים; צורה, גודל ופיגמנטציה ככל שהמעברים התקדמו למעבר הרביעי (חצים שחורים מצביעים על תאי ה-RPE המבודדים ב-P4). נוגדן לחלבון RPE65 שימש לאימות זהותם של התאים המבודדים. צביעה אימונופלואורס...

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט לבידוד תאי אפיתל פיגמנטציה ברשתית (RPE) מעיני עכבר באופן מדורג. הפרוטוקול כולל אנוקליזציה ונתיחה של עיני עכבר, ולאחר מכן בידוד, זריעה והתרבות של תאי RPE.

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

פרוטוקול זה יתווה דרך קלה ויעילה לבודד בהצלחה תאי אפיתל פיגמנטים ראשוניים ברשתית של עכברים. תאי אפיתל פיגמנטציה ברשתית ממלאים תפקיד חשוב מאוד בשמירה על תאי הפוטורצפטור ולהבטיח את תפקודה התקין של הרשתית. המעבדה שלנו מבודדת תאי אפיתל פיגמנטיים ראשוניים של עכברים ככלי חשוב לחקר מחסום הדם-רשתית החיצוני ומחלות קשורות כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל.כדי לחלץ את עיני העכבר, יש להרדים את העכבר באופן אתי בהתאם לשיטות המאושרות על ידי המוסד שלך, לאחר מכן להניח את העכבר על משטח תחתון סטרילי ולהניף את העין על ידי לחיצה על פינצטה בסגנון 5/45 על אזור המסלול כדי לגרום לפרופטוזה, ואז להזיז את הפינצטה לחלק האחורי של העין ולמשוך בעדינות כדי להסיר את העין ולוודא שעצב הראייה עדיין שלם. בעת שימוש במלקחיים, טבלו את העיניים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מיליליטר המכיל 5% יוד פובידון. לדגור את העיניים בטמפרטורת החדר במשך 2 עד 3 דקות.הסר את העיניים מן יוד povidone ומניחים אותם בצלחת פטרי. בעת שימוש פיפטה העברה סטרילית, לשטוף את העיניים עם תמיסת מלח מאוזנת של Hanks'Balanced עד הצבע הכתום של יוד פובידון נעלם. זה לוקח בערך 2 עד 3 כביסות.הניחו את העיניים בצלחת פטרי חדשה וטבלו אותן במדיית גדילת תאי RPE מלאה וקרה. משם, אתה יכול להתחיל לנתח תחת מיקרוסקופ לנתח. מתחת למיקרוסקופ, השתמש בפינצטה ו/או במספריים של Vannas כדי למשוך או לחתוך רקמת חיבור בשרירים חוץ-עיניים.לאחר מכן ניתן להחזיק את העיניים במשך שעה במדיה של תרבית תאי RPE קרה. עם זאת, עדיף להמשיך ישירות לשלב הבא לאחר ניקוי גלגל העין. מעבירים את העיניים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מיליליטר המכיל את האנזים A תמיסה, ואז דוגרים את העיניים בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.הסר את העיניים מתמיסת האנזים A והנח אותן בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 2 מיליליטר המכיל את תמיסת האנזים B, ולאחר מכן הנח אותן בתוך אינקובטור ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות. הסר את העיניים מהאנזים B והנח אותן בצלחת פטרי של 60 מילימטר וטבל אותן והשלם את מדיית הצמיחה של תאי RPE, ולאחר מכן דגירה של העיניים ב -4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מניחים את התבשיל מתחת למיקרוסקופ המנתח ומתחילים לנתח.השתמש מלקחיים M5S ומחט של מזרק כדי לבצע חתך בקטע ora seratta. עכשיו עם שני מלקחיים, לתפוס את החלק הפנימי של החתך עם מלקחיים אחד ולתפוס את הקרנית עם הכוח השני. מתחילים לקרוע באיטיות את הקרנית מהרשתית על ידי משיכת הקרנית.הקפידו לקרוע במרווחים קטנים ולעבור במורד הקרע כשאתם מסירים את הקרנית. זה יבטיח כי RPE יישאר בעיקר שלם ואתה תקבל קרע נקי יותר. ברגע שהקרנית מנותקת לחלוטין, אתה אמור להיות מסוגל לראות את הקשתית והעדשה.הסר הן את הקשתית והן את העדשה עם מלקחיים כדי לשמור על טוהר הבידוד. כדי להסיר את הרשתית העצבית משכבת ה-RPE, תפסו את השכבה החיצונית של העין בפינצטה אחת והניחו זרוע של פינצטה שנייה בין ה-RPE לשכבה העצבית. משם, משכו בעדינות או הוציאו את הרשתית העצבית הרחק משכבת ה-RPE, ולאחר מכן השליכו את הרשתית העצבית.הזיזו את שכבת ה-RPE למקום אחר על המנה ללא לכלוך. כדי להפריד את ה-RPE מהכורואיד והסקלרה, יש לגרד בעדינות את החלק הפנימי של ה-EYECUP בעזרת פינצטה בסגנון 5/45 כדי להבטיח את הפרדת תאי ה-RPE. תאי ה-RPE נראים מעוננים כאשר הם מושעים ומדיית הצמיחה המלאה של תאי RPE.שאפו את התאים באמצעות פיפטה סטרילית של 3.2 מיליליטר והעבירו לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר המכיל מדיה מלאה לצמיחת תאי RPE. התאים יכולים להיות צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן תוכל לשאוף החוצה את הסופר-נטנט ולהשהות את הכדור במדיית גידול תאי RPE מחוממת.צלחת את התאים על צלחת פטרי 100 מ"מ ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. תמונות אלה מראות בידוד מוצלח במעבר 0 ובמעבר 1, אשר ניכר על ידי פיגמנטציה של תאי RPE. במעבר 4, התאים הופכים פחות אופייניים ומפגינים פחות פיגמנט, מראים מראה דמוי ציר או הופכים לחזקים יותר עם שטח פנים גדול יותר.אימתנו את תאי ה-RPE באמצעות סמן ספציפי ל-RPE, RPE65 וחלבון ציטוסקטלי F-אקטין. בדקנו גם זיהום פוטנציאלי בתאי מולר על ידי צביעה בסמן ספציפי לתא מולר, וימנטין. פרוטוקול זה הוא התאמה פשוטה של פרוטוקולים קיימים.הפרוטוקול משתמש בחומרים ובציוד נלווה הזמינים ברוב מעבדות המחקר, מה שיסייע לבודד תאי RPE ראשוניים של עכברים בצורה יעילה.

isolation-of-primary-mouse-retinal-pigmented-epithelium-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מראים הליך להשגת תאי אפיתל פיגמנט עיני ממודל ארנב. התאים מסייעים בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למחלות ניווניות ברשתית.

בידוד תאי IPE ו-RPE: טכניקה להשגת תאי אפיתל פיגמנט עיני מעין ארנב

בסרטון זה אנו מתארים טכניקה לבידוד תאי אפיתל קשתית ופיגמנט רשתית מעיני חזירים כדי להשיג את התרביות הראשוניות שלהם למחקרי in vivo ו- ex vivo. תאי פיגמנט אלה יכולים להיות מהונדסים גנטית כדי לחקור גישות רגנרטיביות לטיפול בהפרעות עיניים.

בידוד תאי IPE ו-RPE: טכניקה להשגת תאי אפיתל פיגמנטיים מעין חזירית מבודדת

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי של העין. כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות תאים ראשי נגזר RPE מאתר...

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות העכבר RPE תאים, אשר יוצרים מונולייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על לוחות Transwell. ההליך לוקח בערך 3 שעות.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה לבידוד תאים של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט. הליך זה מאפשר מעקב אחר מחקרי ביולוגיה מולקולרית על RPE המבודד, כולל ניתוח ביטוי גנים.

בידוד תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעיני חזיר גינאה

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להשגה וטיפוח של תאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים (RPE) מעיניים חזיריות ממקור מקומי. תאים אלו מהווים חלופה איכותית לתאי גזע ומתאימים למחקר רשתית במבחנה .

בידוד תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזיריים ראשוניים למידול חוץ גופי

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גליית הרשתית מעיני עכבר. הפרוטוקול מתחיל באינקולציה ודיסקציה של עיני עכבר, ואחריו בידוד, זריעה וטיפוח של תאי מולר.

בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

בסרטון זה נדגים כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן אפיתל ריסי העין העכבר לגדל אותם בתרבית כדי ליצור כדורים רשתית משובט. התחומים כי הם מבודדים להחזיק את המאפיינים העיקריים של בתאי גזע: התחדשות עצמית multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הנתיחה של placentae מהעכבר על ההריון d10.5, ואחרי הבידוד של תאי trophoblast באמצעות שיפוע Percoll. אז אנחנו מדגימים שימוש בתאים המבודדים בassay פלישת matrigel.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

למדו פרוטוקול מפושט לבידוד תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית מעיני עכברים ראשוניים. שיטה זו מאפשרת חקר מחסום הדם-רשתית החיצוני ומחלות רשתית כגון ניוון מקולרי קשור לגיל.

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

גלה סרטונים נוספים