Name: מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: חקור שיטת תרבית תלת-ממדית ללא סרום לתאי גזע של בלוטת הדמעות מעכברי BALB/c. הפרוטוקול מאפשר הרחבה לטווח ארוך והתמיינות לתאים אקינריים וצינוריים לשיקום בלוטת הדמעות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '31871413) ושתי תוכניות של מדע וטכנולוגיה של גואנגדונג (2017B020230002 ו- 2016B030231001). אנו אסירי תודה לחוקרים שעזרו לנו במהלך המחקר ולאנשי הצוות העובדים במרכז לבעלי החיים על תמיכתם בטיפול בבעלי חיים.

<ol><li>Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+injection+of+interleukin-1+induces+reversible+aqueous+tear+deficiency%2C+lacrimal+gland+inflammation%2C+and+acinar+and+ductal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation.</a> Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).</li>
<li>Gromova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+repair+using+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland repair using progenitor cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).</li>
<li>Buzhor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+approaches%3A+the+hope+for+incurable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases.</a> Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PLoS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).</li>
<li>Ackermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+investigation+of+presumptive+murine+lacrimal+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lugli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+1+and+noggin+facilitate+expansion+of+resident+stem+cells+from+non-damaged+gallbladders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders.</a> EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1), 324-338 (2015).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B%28ve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Linnemann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regenerative+potential+in+primary+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells.</a> Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+expansion+of+salivary+gland+stem+cells+driven+by+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Xiao, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+long-term+serum-free+culture+for+lacrimal+gland+stem+cells+aiming+at+lacrimal+gland+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).</li>
<li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured%2C+adult+rat+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+side+population+cells+restores+the+function+of+damaged+exocrine+glands+through+clusterin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin.</a> Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).</li>
<li>Aluri, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+improves+tear+production+in+a+mouse+model+of+sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome.</a> Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).</li>
<li>Dietrich, J., Schrader, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+lacrimal+gland+regeneration%3A+current+concepts+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches.</a> Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+matrix+%28BME%29+has+multiple+uses+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

ישנן שיטות מבוססות היטב לבידוד ותרבית חוץ גופית של תאי גזע דמעתיים לתרבית תאי גזע דמעה ותיקון פציעת LG. Shatos et al.17 ו- Ackermannet al. 6 תאי גזע דמע תת-תרבותיים בתרבית ותת-תרבותית של חולדות ועכברים בהצלחה בשיטות תרבית דו-ממדיות, בהתאמה, מה שמאפשר להשתיל תאי גזע דמעות לטיפול ב-ADDED. מחקרים על תאי גזע18 ותאי גזע מזנכימליים 19,20 של LGs בתרבית בתרבית בדו-ממד הראו כי השתלה ...

תאי גזע של בלוטת הדמעות (LGSCs) שומרים על התחדשות תאי בלוטת הדמעות (LG) והם המקור לתאי אצינר ותאים דוקטליים. לכן, השתלת LGSC נחשבת לגישה חלופית לטיפול בנזק דלקתי חמור ובמחלת עיניים יבשות עם מחסור מימי (ADDED)1,2,3. מספר שיטות תרבית יושמו כדי להעשיר את הלהט"בים. Tiwari et al. הפרידו ותרבית תאי LG ראשוניים בתרבית באמצעות קולגן I וג'ל מטריקס בתוספת מספר גורמי גדילה; עם זאת, תאי LG לא יכלו להיות בתרבית רציפה4. באמצעות תרבית דו-ממדית (דו-ממדית), תאי גזע שמקורם בעכבר LG בודדו על ידי You et al.5 ו-Ackermann et al. 6, שנמצא כמבטא את הגנים של סמן תאי גזע/אב, Oct4, Sox2, Nanog ו-nestin, וניתן היה לתת-תרבות. עם זאת, אין אינדיקציה ברורה לכך שתאים אלה יכולים להתמיין לתאי אצינר או צינור, ואין ניסוי השתלה כדי לאמת את פוטנציאל ההתמיינות in vivo.
לאחרונה, תאי c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- בודדו מתאי LGs של עכברים על ידי ציטומטריית זרימה, נמצאו כמבטאים סמני תאי אב LG, כגון Pax6 ו-Runx1, והתמיינו לתעלות ואצ'יני במבחנה. בעכברים עם ADDED, הזרקה אורתוטופית עם תאים אלה יכולה לתקן LGs פגומים ולשחזר את תפקוד ההפרשה של LGs2. עם זאת, מספר תאי הגזע שבודדו בשיטה זו היה קטן, ואין תנאי תרבית מתאימים להרחבת הלהט"בים המבודדים. לסיכום, יש להקים מערכת תרביות מתאימה כדי לבודד ולתרבות ביעילות LGSCs בוגרים עם התרחבות יציבה ומתמשכת לחקר LGSCs בטיפול ב- ADDED.
אורגנואידים המופקים מתאי גזע או מתאי גזע פלוריפוטנטיים הם קבוצה של תאים הדומים מבחינה היסטולוגית לאיברים הקשורים ויכולים לשמור על התחדשות משלהם. לאחר שהאורגנואיד של מעי העכבר תרבית בהצלחה על ידי Sato et al. בשנת 20097, אורגנואידים מאיברים אחרים הועתקו ברצף, בהתבסס על מערכת התרבית של סאטו, כגון כיס המרה8, כבד9, לבלב10, קיבה11, שד12, ריאה13, ערמונית14 ובלוטת הרוק15 . בשל השיעור הגבוה של תאי גזע בוגרים לפני התמיינות תאים בתרבית אורגנואידים, שיטת תרבית האורגנואידים התלת-ממדית (3D) נחשבת אופטימלית לבידוד ולתרבית של תאי גזע בוגרים של LG.
מערכת תרבית LGSC של עכבר בוגר הוקמה במחקר הנוכחי על ידי אופטימיזציה של שיטת התרבות התלת-ממדית, ללא סרום. הוכח כי הלהט"בים שעברו תרבית הן מעכברים רגילים והן מעכברים שנוספו הראו יכולת יציבה של התחדשות עצמית והתפשטות. לאחר השתלה ב-LGs של העכברים הנוספו, LGSCs התיישבו ב-LGs הפגומים ושיפרו את ייצור הקרעים. בנוסף, LGSCs פלואורסצנטיים אדומים בודדו מעכברי ROSA26mT/mG ועברו תרבית. עבודה זו מספקת התייחסות אמינה להעשרת LGSC במבחנה ול- LGSC autograft ביישום קליני לטיפול נוסף.

<table><tbody><tr><td>Animal (עכבר)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal B/C</td><td>מרכז מחקר בעלי חיים מודל של אוניברסיטת</td><td></td><td></td>נאנג'ינג</tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>מרכז חיות מעבדה של אוניברסיטת</td><td></td><td></td>סון יאט-סן</tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>מרכז מחקר בעלי חיים מודל של אוניברסיטת</td><td></td><td></td>נאנג'ינג</tr><tr><td>ROSA26mT/mG</td><td>מודל המרכז לחקר בעלי חיים של אוניברסיטת</td><td></td><td></td> נאנג'ינג</tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מייבש אוטומטי</td><td></td> תא ספירת דם תרמו <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BLAU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מונה</td><td>תאים CountStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממת CO2 טמפרטורה קבועה</td><td>מערכת</td> הדמיה תרמו <td></td><td></td></tr><tr><td>ECL ג'ל</td> GE <td>healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבטיה חשמלית לאמבטיית מים</td><td>Yiheng טכנולוגיה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורזה</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצנטי מכשיר PCR כמותי</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פורס רקמות קפואות</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה אופקית</td><td>CENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לייזר מיקרוגרף סריקה למלרית</td><td>קרל זייס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיכל חנקן נוזלי</td><td>תרמו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טמפרטורה נמוכה גבוהה מהירות צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תנור מיקרוגל</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ספקטרופוטומטר אולטרה סגול</td><td></td><td>מדד תרמי ריכוז</td><td></td>RNA</tr><tr><td>מכונת חיתוך פרפין</td><td></td> מגבר Thermo <td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בודק ערך pH</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 & deg; C מקרר</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנד תרמוסטטי</td><td>ZHICHENG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר הטמעת פרפין רקמות</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-80&deg; C מקרר בטמפרטורה נמוכה במיוחד</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-20&deg; C מקרר בטמפרטורה נמוכה במיוחד</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת טיהור מים טהורים במיוחד</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>u>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניסוי בבעלי חיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Sigma</td><td>9002-61-3</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>14158-65-7</td><td></td></tr><tr><td>פנטוברביטל נתרן</td><td>סיגמא</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td><תרבית תאים חזקה>חזקה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>גיבקו</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז I</td><td>ג'יבקו</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>BD</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>סיגמא</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D0697</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500895</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050087</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (ג'ל מטריקס)</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>מורין נוגין</td><td>פפרוטק</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>עכברוש Wnt3A</td><td>פפרוטק</td><td>315-20</td><td></td></tr><tr><td>עכברנית EGF</td><td>פפרוטק</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>גיבקו</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>גיבקו</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>פפרוטק</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין (TI)</td><td>סיגמא</td><td>T6522</td><td>נגזר מ-Glycine max; יכול לעכב טריפסין, כימוטריפסין ופלסמינאז במידה פחותה. מ"ג אחד יעכב 1.0-3.0 מ"ג טריפסין.</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>סיגמה</td><td>&nbsp; T4799</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>HE צביעה & צביעה חיסונית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור נגד עכבר IgG</td><td>Thermo</td><td>A-21202</td><td>דילול משומש: IHC) 2 &mu; גרם/מ"ל, (IF) 0.2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנב IgG</td><td>Thermo</td><td>A-21206</td><td>דילול משומש: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 חמור נגד עכבר IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10037</td><td>דילול משומש: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 חמור נגד ארנב IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10042</td><td>דילול משומש: (IHC) 2 &mu; גרם/מ"ל, (אם) 4 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>נוגדן ארנב נגד AQP5</td><td>Abcam</td><td>ab104751</td><td>דילול משומש: (IHC) 1 &mu; גרם/מ"ל, (IF) 0.1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>נוגדן חולדה נגד E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab11512</td><td>דילול משומש: (IF)&nbsp; 5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>אנטי-קרטין14 נוגדן ארנב</td><td>Abcam</td><td>ab181595</td><td>דילול משומש: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>נוגדן ארנב Anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>דילול משומש: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>נוגדן עכבר נגד mCherry</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td>דילול משומש: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>נוגדן ארנב נגד mCherry</td><td>Abcam</td><td>ab167453</td><td>דילול משומש: (IF)&nbsp; 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>C6H8O7</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501702-0500</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>Sangon Biotech</td><td>201-069-1</td><td></td></tr><tr><td>ערכת DAB (20x)</td><td>CWBIO</td><td>CW0125</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>BASO</td><td>68115</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה פלואורסצנטית בינוני</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>פורמלין</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A501912-0500</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן IgG נגד עכבר עיזים (HRP)</td> <td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>דילול משומש: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>נוגדן IgG נגד ארנב עיזים (HRP)</td> <td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>דילול משומש: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>BASO</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>היסטוג'ל (הטמעת הידרוג'ל)</td><td>Thermo</td><td>HG-400-012</td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Guangzhou כימיה</td><td>KD10</td><td></td></tr><tr><td>30% תמיסת מי חמצן</td><td>גואנגג'ואו כימיה</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>גואנגג'ואו כימיה</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Na3C6H5O7.2H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501293-0500</td><td></td></tr><tr><td>בלסם ניטרלי</td><td>SHANGHAI YIYANG</td><td>YY-Neutral Balsam</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים לא מחוסן</td><td>BOSTER</td><td>AR0009</td><td></td></tr><tr><td>פרפין</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A601891-0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>DAMAO</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט tribasic dihydrate</td><td>Sangon Biotech</td><td>200-675-3</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>גואנגג'ואו כימיה</td><td>IB11-AR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.T.C. תרכובת</td><td>SAKURA</td><td>SAKURA.4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>DINGGUO</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>גואנגג'ואו כימיה</td><td>128686-03-3</td><td></td></tr><tr><td><חזק>RT-PCR & qRT-PCR</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>סיגמא</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול</td><td>גואנגג'ואו כימיה</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>גואנגג'ואו כימיה</td><td>865-49-6</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>סנגון ביוטק</td><td>214-984-6</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>גואנגג'ואו כימיה</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td><td>Roche</td><td>488735200H</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO-Taq</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DNA פולימראז</td><td>TAKARA</td><td>R10T1</td><td></td></tr><tr><td>Goldview (חומצת גרעין כתם)</td><td>BioSharp</td><td>BS357A</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Magen</td><td>R4801-02</td><td></td></tr><tr><td><חזק>בנייה וקטורית העברת תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>OXID-Ampicillin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>סיגמא</td><td>56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי פלסמיד ללא אנדוטוקסין</td><td>Thermo</td><td>A36227</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000 פלסמיד ערכת טרנספקציה</td><td>Thermo</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LR ערכת מיצוי</td><td></td> פלסמיד Thermo <td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי פלסמיד</td><td>TIANGEN</td><td>DP103</td><td></td></tr><tr><td>Trans5&alpha; תא מוכשר כימית</td><td>TRANSGEN</td><td>CD201-01</td><td></td></tr><tr><td>טריטון</td><td>OXID-תמצית</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>שמרים</td><td>OXID</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td><חזק>פריימרים ורצף</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>פריימר</חזק>: AQP5 <חזק>רצף</חזק>: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCCCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימר</חזק>: &beta;-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימר</חזק>: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימר</חזק>: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGATGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימר</חזק>: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימר</חזק>: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימר</חזק>: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLX302 lentivirus וקטור ללא עומס</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENRTY-mמעבדת Cherry</td><td>Xiaofeng Qin, אוניברסיטת</td><td></td><td></td> סון יאט-סן</tr></tbody></table>

מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

טיפול מבוסס תאי גזע בבלוטת הדמעות (LG) הוא אסטרטגיה מבטיחה למחלות בלוטות הדמעות. עם זאת, היעדרה של שיטת תרבית אמינה ונטולת סרום להשגת מספר מספיק של תאי גזע LG (LGSCs) הוא מכשול אחד למחקר ויישום נוספים. שיטת התרבות התלת-ממדית (התלת-ממדית) ללא סרום עבור LGSCs של עכברים בוגרים מבוססת היטב ומוצגת כאן. ניתן היה להעביר את ה-LGSCs באופן רציף ולגרום להם להתמיין לתאים דמויי אצינר או דמויי צינור.
עבור התרבות העיקרית של LGSC, LGs מעכברים בני 6-8 שבועות עוכלו עם דיספנס, קולגן I וטריפסין-EDTA. בסך הכל 1 × 104 תאים בודדים נזרעו לתוך 80 μL של מטריצה ג'ל-בלוטת דמעה של מטריצה בלוטת גזע בינונית (LGSCM) בכל באר של צלחת 24 בארות, מצופה מראש עם 20 μL של מטריצה ג'ל-LGSCM מטריצה. התערובת התמצקה לאחר הדגירה במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-600 μL של LGSCM נוספו.
לצורך תחזוקת LGSC, LGSCs בתרבית במשך 7 ימים פורקו לתאים בודדים על ידי פירוק וטריפסין-EDTA. התאים הבודדים הושתלו ותרבית על פי השיטה ששימשה בתרבית הראשונית של LGSC. LGSCs יכולים לעבור למעלה מ-40 פעמים ולבטא באופן רציף סמני תאי גזע/אב Krt14, Krt5, P63 ונסטין. LGSCs בתרבית LGSCM הם בעלי יכולת התחדשות עצמית ויכולים להתמיין לתאים דמויי אצינר או צינור במבחנה וב-in vivo.

הקמת מערכת תרביות תלת-ממדית, ללא סרום במחקר זה פותח LGSCM המכיל EGF, Wnt3A, FGF10 ו-Y-27632 עבור LGSCs של עכברים, ו-LGSCs בודדו בהצלחה ותורבתו על ידי שיטת תרבית תלת-ממדית (איור 1A). מערכת תרבית תלת-ממדית מוצלחת ללא סרום של LGSCs מעכברי C57BL/6, עכברי NOD/ShiLtJ, עכברי BALB/c ועכברי ROSA26mT/mG הוקמה בשיטה זו16. עבור עכבר זכר, 1.5-2 × 106 תאים התקבלו משני LGs על ידי דיסוציאציה. לאחר שבוע אחד של תרבית, נוצרו 30-60 כדורים בעת זרי...

שיטת התרבית התלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת דמעה בוגרת (LG) מבוססת היטב על אינדוקציה של היווצרות והתמיינות של אורגנואידים LG לתאים דמויי אצינר או צינור.

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה מועילה להעשרת תאי גזע של בלוטת הדמעות לצורך התחדשות ושחזור של בלוטת הדמעות. תאי גזע של בלוטת הדמעות מראים יכולת התרחבות ארוכת טווח ופוטנציאל התמיינות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדיום התרבית לתאי גזע של בלוטת הדמעות הוא נטול סרום, מה שמראה את הערך העצום לתיקון בלוטת הדמעות בגין על ידי קבלת עכבר זכר BALB/c בן שישה עד שמונה שבועות מורדם וחתך העור מאחורי האוזן כדי לחשוף את בלוטת הדמעות ואת רקמת החיבור סביבו.מקלפים את רקמת החיבור על ידי דיסקציה קהה בעזרת פינצטה ומסירים את בלוטת הדמעות. לטבול את בלוטות הדמעות בצלחת של שישה סנטימטרים עם ארבעה מיליליטרים של 75% אתנול למשך 10 שניות ולשטוף מיד עם תמיסת PBS 10 מילימולרית פעמיים. חותכים את בלוטות הדמעות לרסיסים קטנים של כמילימטר אחד.מעבירים אותם לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר ומטפלים ברקמות עם 500 מיקרוליטרים של 25 יחידות למיליליטר דיספוזה ו-500 מיקרוליטרים של 0.1% קולגן I למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. טפל בשברי בלוטת הדמעות עם מיליליטר אחד של 0.05%טריפסין EDTA למשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ונתק את השברים לתאים בודדים על ידי צנרת שוב ושוב. מסננים את ההשעיה דרך מסנן של 70 מיקרומטר, אוספים את המסנן לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב-150 פעמים G למשך חמש דקות.לאחר צנטריפוגה, הסר את

three-dimensional-serum-free-culture-system-for-lacrimal-gland-stem

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תרבית תאים ראשונית באמצעות organoids רקמה שלמה מספקת מערכת מודל המחקה את המיקרו-הסביבה רב-התאית בגוף חי. פיתחנו מודל סרום ללא עיקרי רקמת האפיתל שד תרבות המנציח שושלות מעורבות תרבית תאים ותערוכות מובחנות מורפולוגיה, ללא הפרעה רקמה האנזימטית. organoids השד בר-קיימא ל&gt; 6 חודשים.

אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres

בלוטת הדמעות (LG) היא איבר הסתעפות שמייצר את הרכיבים מימיים של דמעות הכרחיות לשמירה על חזון ועל בריאות העין. כאן אנו מתארים עכברי נתיחת LG ולשעבר טכניקות תרבות vivo לפענח מסלולי איתות מעורבים בפיתוח LG.

המניפולציה Murine דמעות בלוטת

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לפתח מערכת תלת ממדית (3-D) מתאי גזע של האדם המושרה-פלוריפוטנט (hiPSCs) הנקראת גוף העובר החופשי בסרום (SFEB). מודל זה 3-D ניתן להשתמש כמו תרבות פרוסה organotypic כדי מודל התפתחות קליפת המוח האנושי ועל חקירה פיזיולוגית של פיתוח מעגלים עצביים.

פיתוח HiPSC נגזר סרום חינם גופים embryoid לחקירת 3-D תא תרבויות גזע באמצעות מבחנים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה שני שלבים המבדילים הקרנית תאי גזע limbal אפיתל מתאי גזע pluripotent האנושי בתנאים ללא תא תרבות קסנו - ולא מזין. השיטות התרבות התא המוצג כאן מאפשרים חסכוניים, בקנה מידה גדול ייצור תאי איכות קליניים, החלים על שימוש טיפול תאי הקרנית.

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

פרוטוקול זה מתאר גישה להפקת hepatospheres של תאי גזע האדם בעלי עוצמה באמצעות מערכת התרבות המוגדרת הרכבה עצמית תא. פרוטוקול זה מתוכנת במספר קווי תאים, העלות האפקטיבית ומאפשרת ייצור של כדורי גוף האדם יציבים עבור יישומים ביו-רפואיים.

סרום חינם הפקת מימדים תלת-ממדיים של האדם בתאי גזע חזקים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להקים, לתחזק, לשנות גנטית, להבדיל, לאפיין תפקודית ולהשתיל אורגנואידים של בלוטת הדמעות שמקורם ברקמת עכבר ראשונית ורקמה אנושית.

הקמה, תחזוקה, בידול, מניפולציה גנטית והשתלה של אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המדגים את השימוש בהידרוג'ל כמסגרת תלת ממדית (3D) לתרבית תאי גזע שמקורם בשומן (ADSC) ומציגים פוטוביומודולציה (PBM) כדי להגביר את התפשטות ADSCs במסגרת התרבית התלת-ממדית.

תרבית תאים תלת מימדית של תאי גזע שמקורם בשומן בהידרוג'ל עם הגדלת פוטוביומודולציה

פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית להפרדת בלוטות דמעות עכבר מזדקנות להשגת תאים בודדים ברי-קיימא לריצוף RNA תא יחיד. עיכול אנזימטי רציף וטיפול עדין משמרים על שלמות התא, ומניבים תליות איכותיות המתאימות לבידוד ספציפי לסוג תא ולניתוח טרנסקריפטומי של שינויים הקשורים להזדקנות באוכלוסיות בלוטות דמעות.

פרוטוקול לפירוק תאים בודדים, ריצוף RNA ובידוד תאי מיואפיתל ופיברובלסטים מבלוטות הלמתי והרוק המזדקנות

אנו מתארים פלטפורמת השבבים מבוססי לעיבוד תלת ממדי של תאים מיקרו bioreactors. אחת שבב יכול בית עד 10 Mio. תאים שיכולים להיות מעובדים בתנאים מוגדרים במדויק לגבי זרימת נוזלים, מתח וכו 'חמצן בלולאה, סטרילי במחזור סגור.

שבב מבוסס תלת ממדי נייד תרבות Micro-bioreactors perfused

Lysate טסיות הדם האנושי הוא מקור עשיר של גורמי גדילה תוסף חזק בתרבות התא. פרוטוקול זה מציג את תהליך הכנת מאגר גדול של lysate הטסיות על ידי אנוש החל פלזמה עשירה בטסיות, ביצוע מספר להקפיא להפשיר מחזורים depleting שברי הטסיות.

הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע

חקור שיטת תרבית תלת-ממדית ללא סרום לתאי גזע של בלוטת הדמעות מעכברי BALB/c. הפרוטוקול מאפשר הרחבה לטווח ארוך והתמיינות לתאים אקינריים וצינוריים לשיקום בלוטת הדמעות.

מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות

גלה סרטונים נוספים