Genotyping מהיר של רקמות באמצעות עכבר חלץ-N-Amp רקמות סיגמא של ערכת ה-PCR

שלום, שמי לינדה ואני עובדת במעבדתו של ד"ר Edwin Niki באוניברסיטת קליפורניה אירביין. היום אראה לכם כיצד אני משתמשת בערכה לביצוע PCR מרקמות עם Sigma's Cybran Green לצורך טיפוס גנטי מהיר של עכברים טרנסגניים. בדרך כלל אני משתמשת בערכה זו כדי לבצע טיפוס גנטי לעכברים עובריים כאשר אני מבצעת תרביות תאים בדיסוציאציה אקוטית וזקוקה לזיהוי מהיר של הגנוטיפ של העכבר.

אך לצורך המטרה של היום, יש לנו זנבות של עכברים בוגרים שבאמצעותם נוכל להראות לכם כיצד אני משתמש בערכה זו. פרוטוקול זה כולל עיכול מהיר של תאי אללה ומיצוי DNA, ולאחר מכן שלב נטרול מהיר. אנו משתמשים ב-DNA הממוצה ב-real time PCR, שבו נוכל לנטר את ה-PCR Amplicons שלנו.

אם אתם מוכנים, בואו נתחיל. לפני שנתחיל, עלינו לוודא שבלוק החימום מכוון ל-95 °C, שה-SYBR Green הופשר ונשמר על קרח עד לשימושו, וששאר הרכיבים מופשרים לטמפרטורת החדר. בדלי הקרח שלי נמצאים שני הפריימרים שבהם נשתמש לצורך הגנוטיפינג; הם תוכננו ספציפית עבור הגן הנחקר ותוקפו עבור qPCR.

יש לי גם ביקורת חיובית עבור הגן הנחקר, ביקורת שלילית ודגימת רקמה שכבר אספתי מעכבר בוגר. כעת, בעת איסוף דגימת הרקמה, חשוב מאוד להקפיד על סטריליות מחמירה. כאשר אנו אוספים זנבות של עכברים עובריים, אנו תמיד שוטפים את הפינצטות ב-70% ethanol לפני ובמהלך כל איסוף רקמה.

ראשית, תמיד שוטפים את דגימות הזנב ב-TBS; לאחר מכן יש להכין תערובת מאסטר (master mix) של תמיסת הכנת הרקמה ותמיסת מיצוי ה-DNA עבור כל זנב, שבה נשתמש ב-100 µL של תמיסת המיצוי וב-25 µL של תמיסת הכנת הרקמה. אשתמש בפיפט P200 וטיפים עם מסנן כדי למדוד 100 µL של תמיסות המיצוי ו-25 µL של תמיסת הכנת הרקמה לתוך מבחנת eppendorf חדשה. יש לערבב את תמיסת המאסטר באמצעות פיפטור למעלה ולמטה.

כעת יש להוסיף 125 µL מהתמיסה הראשית (master mix) אל הדגימה הרלוונטית, תוך וידוא שבמידה ומדובר בזנב של עכבר בוגר, הקצה החתוך טבול לחלוטין בתמיסת ה-master mix. ניתן לבצע ערבוב קל בעזרת האצבע (finger vortex) ולהדגיר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. במהלך ההדגרה של 10 הדקות, אכין את תמיסת ה-master mix הירוקה המועדפת עליי, הכוללת את ה-cider green master mix המצורף לערכה, מים מסוג milli Q או מים בדרגת PCR, ואת הפריימרים שלנו – מים בדרגת PCR ופריימרים קדמיים (forward) ואחוריים (reverse). וזה הכל.

כעת, לאחר שהסתיימה דגירה של 10 דקות, עלינו לחמם ולהפעיל את התגובה ב-95 °C למשך שלוש דקות. לאחר סיום שלוש הדקות של האינאקטיבציה, נוסיף תמיסת נטרול המסופקת בערכה; נוסיף 100 µL לכל תגובה ונערבב זאת באמצעות וורטקס. לאחר הוספת באפר הנטרול, ניתן לאחסן את דגימות ה-DNA ב-4 °C עד למועד השימוש בהן.

אנחנו מעוניינים לקבל את הגנוטיפ שלנו באופן מיידי. לכן, אנו עוברים ישירות ל-QPCR, כך שהדגימות שלי נוטרלו והן מוכנות. תערובת ה-PCR master mix עם Cyber Green שלי מוכנה, ומבחנות ה-PCR שלי מסודרות על בלוק קירור.

כל שעלי לעשות כעת הוא להוסיף 16 µL של תערובת המאסטר (master mix) לכל באר, ולאחר מכן להוסיף לכל אחת ארבעה µL של התמצית הניטרלית או ארבעה µL של ביקורת חיובית או שלילית. כלומר, אני מוסיף 16 µL של תערובת מאסטר לכל אחת מהבארים. לאחר מכן, אוסיף ארבעה µL של התמצית הניטרלית ל-16 µL של תערובת המאסטר בבאר, לנפח תגובה כולל של 20 µL.

ואבצע את אותו הדבר עבור הביקורות החיובית והשלילית. אוסיף 4 µL ל-16 µL של תערובת מאסטר PPR. לאחר שכולם נוספו, ניתן לסגור אותם באמצעות רצועת פקקים שמונה שקופה אופטית.

יש להקפיד לא לגעת בחלק השקוף של הפקקים המכסים את הדגימות. לכן, אני משתמש במטפית Kim wipe כדי ללחוץ על הפקקים ולוודא שהם אטומים. לאחר ערבוב עדין ב-vortex של תערובת ה-PCR וה-DNA וספינטר (spin down), אנחנו מוכנים להכניס אותם למכשיר ה-QPCR.

ראשית, נטען את הדגימות למכשיר ה-Opticon PCR ואצור הגדרה חדשה של לוחית, שבה הבאר הראשונה תהיה הדגימה שלנו, הבאר השנייה תהיה הביקורת החיובית והבאר השלישית תהיה הביקורת השלילית; נציין כי נפח התגובה הכולל הוא 20 microliters. לאחר מכן, אטען פרוטוקול שתוכנן עבור genotyping מהיר.

פרוטוקול זה כולל שלב דנטורציה של שלוש דקות, מחזור של 15 שניות דנטורציה, 15 שניות של היסתגלות ראשונית (primary kneeling), ולאחר מכן 20 שניות של הארכה ראשונית (primary extension). כעת, ניתן למעשה להוריד את זמן מיכל ההארכה הראשונית לכ-10 שניות, ובכך יהיה סך הכל של 40 שניות בלבד. עבור כל מחזור, אנו מבצעים את שלושת השלבים הללו כ-40 פעמים, בדומה ל-PCR רגיל, ובסוף התהליך אנו מבצעים ניתוח עקומת התכה (melting curve).

כעת, כאשר הפלטה מוכנה והפרוטוקול טעון, כל שעלינו לעשות הוא להפעיל את ה-QPCR, שמתחיל בשלב הדנטורציה של שלוש דקות. מהניסיון שלי, בשימוש בפריימרים שאני משתמש בהם, בדגימות הזנב ובחיפוש אחר הגנים שאני בוחן, אני יודע שהדגימות החיוביות יתחילו להופיע סביב 25 מחזורים, כאשר הן חוצות את סף המחזור (cycle threshold) המשמעותי.

כעת, מועד החצייה תלוי במידה רבה בדגימת הרקמה שלכם, במה שאתם מחפשים ובכמות ה-DNA שנמצאה בתחילה. ניתן לראות כבר שהביקורת החיובית שלנו עלתה, ונראה שגם הדגימה שלנו חיובית. כפי שניתן לראות, היא מתחילה לעלות מעט אחרי הביקורת החיובית שלנו.

עדיין נצטרך להמתין מכיוון שהגענו רק ל-27 מחזורים, אך אני מקווה שבמספר מחזורים נוספים נוכל להיות בטוחים שהדגימה שלנו חיובית ואז אוכל להמשיך בניסוי. בשלב זה, ניתן לראות שהביקורת השלילית רק מתחילה לעלות, וזאת כיוון שלקחתי כמות עודפת של זנב. הדבר מסייע לוודא שכל מה שיעלה לפני עליית הזנב השלילי העודף הזה יהיה חיובי.

בשלב זה, כל תוצאה שמופיעה לפני הביקורת השלילית תיחשב כחיובית, ואמשיך בניסוי שלי. לאחר סיום מחזורי ה-PCR, המכשיר מבצע ניתוח עקומת המסה (melting curve analysis). פעולה זו תסייע לכם לקבוע את ההרכב ואת טוהר המוצר שלכם.

באמצעות פעולה זו, ניתן לקבוע אם הדגימות החיוביות והשליליות נבחרו נכון. לדוגמה, לדגימה חיובית יהיה שיא טמפרטורת התכה חד וספציפי, התואם לתוצר PCR ספציפי שעבר הגברה. לדגימות שליליות יהיה שיא טמפרטורת התכה רחב ולא ספציפי, התואם ל-DNA לא ספציפי שהוגבר במהלך ה-PCR.

הראיתי לכם כעת כיצד אנו משתמשים בערכה למיצוי ה-Cyber Green של Sigma לצורך ביצוע גנוטיפינג מהיר של זנבות עכברים בוגרים. ניתן להשתמש בערכה זו עם רקמות חיות שונות, שיער, רוק, ואני משתמש בה לביצוע גנוטיפינג של זנבות עכברים עובריים. אנו מעדיפים להשתמש בערכה זו בשל המהירות שבה היא פועלת.

אני יכול לקבל את הגנוטיפ שלי בחזרה תוך שעה, וזה מאוד נוח ופשוט. אז תודה שצפיתם ובהצלחה.