Genotyping מהיר של רקמות באמצעות עכבר חלץ-N-Amp רקמות סיגמא של ערכת ה-PCR

היי, שמי לינדה ואני עובדת במעבדה של ד"ר אדווין ניקי באוניברסיטת קליפורניה באירווין. היום אני הולך להראות לכם איך אני משתמש בירוק הסייבר של הסטיגמה, מחלץ ערכת PCR של רקמות כדי לגנוטיפ מהיר או עכברים טרנסגניים. בדרך כלל אני משתמש בערכה הזו כדי לבצע גנוטיפ לעכברים העובריים שלנו כאשר אני מבצע תרביות תאים דיסוציאטיביות חריפות ואני צריך לגלות במהירות את הגנוטיפ של העכבר שלנו.

אבל למטרות של היום, יש לנו זנבות עכברים בוגרים שבהם אנחנו יכולים להראות לכם איך אני משתמש בערכה הזו. פרוטוקול זה כולל עיכול מהיר של בירה ומיצוי DNA, ולאחר מכן שלב נטרול מהיר. ואנחנו משתמשים ב-DNA של התמצית ב-PCR בזמן אמת, שם אנו יכולים לנטר את מגברי ה-PCR שלנו.

אז אם אתה מוכן, בוא נתחיל. אז לפני שנתחיל, אנחנו רוצים לוודא שבלוק החום שלנו מכוון ל-95 מעלות צלזיוס, שהסייבר גרין שלנו מופשר ונשמר על קרח עד שהוא נחוץ ושהריאגנטים האחרים שלנו מפשירים לטמפרטורת החדר. בדלי הקרח שלי, יש לי את שני הפריימרים שלי שנשתמש בהם לגנוטיפ והם תוכננו במיוחד עבור הגן המעניין שלנו ואושרו עבור QPCR.

יש לי גם את השליטה החיובית שלי על הגן המעניין והשליטה השלילית שלי ודגימת רקמה שכבר אספתי מעכבר בוגר. כעת, כאשר אתה אוסף את דגימת הרקמה שלך, חשוב מאוד להיות מחמיר ביותר. כאשר אנו אוספים זנבות עכברים עובריים, אנו תמיד שוטפים את המלקחיים שלנו באתנול 70% לפני ולפני כל איסוף רקמות.

ואנחנו תמיד שוטפים את דגימות הזנב ב-TBS, ראשית עליך להכין תערובת מאסטר של הכנת הרקמה ומיצוי ה-DNA עבור כל זנב, אתה תרצה 100 מיקרוליטר מתמיסת החילוץ ו-25 מיקרוליטר של תמיסת הכנת הרקמות. אני הולך להשתמש בקצות ה-P 200 והסינון שלי כדי למדוד מאה מיקרוליטר של תמיסות המיצוי ו -25 מיקרוליטר של תמיסת הכנת הרקמות לתוך צינור RPH חדש. אתה תרצה לערבב את פתרון המיקס הראשי שלך על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

ולכן תרצה להוסיף 125 מיקרוליטר של תערובת המאסטר שלך לתוך העניין שלך, ולוודא שאם זה זנב עכבר בוגר, שהקצה החתוך שקוע לחלוטין בתמיסת המיקרופון הראשי ואתה יכול מערבולת אותו באצבע ואתה מדגר אותו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. במהלך הדגירה של 10 דקות, אני הולך להכין את תערובת המאסטר הירוקה האהובה עלי, הכוללת את תערובת המאסטר הירוקה של סיידר שהם כוללים בערכה מים בדרגת מילי-Q או PCR, והפריימרים שלנו, קצת מים בדרגת PCR, והפריימרים שלנו קדימה ואחורה. וזהו.

כעת, כשהדגירה של 10 דקות הסתיימה, נצטרך לחמם ולהפעיל את התגובה ב-95 מעלות למשך שלוש דקות. ההשבתה של שלוש הדקות שלנו הסתיימה ועכשיו אנחנו הולכים להוסיף פתרון נטרול שמסופק בערכה ואנחנו הולכים להוסיף מאה מיקרוליטר לכל תגובה ואתה הולך לערבב את זה על ידי מערבולת. לאחר הוספת מאגר הנטרול, ניתן לאחסן את דגימות ה-DNA שלך בארבע מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכן להשתמש בהן.

אנחנו למעשה רוצים את הגנוטיפ שלנו מיד. אז אנחנו נכנסים מיד ל-QPCR, כך שהזנבות שלי מנוטרלים ומוכנים. תערובת ה-PCR הירוקה שלי מוכנה ויש לי את צינורות ה-PCR שלי מוגדרים על בלוק קר.

כל מה שאני הולך לעשות עכשיו הוא להוסיף 16 מיקרוליטר מתערובת המאסטר שלי לכל באר ואז להוסיף ארבעה מיקרוליטר של התמצית ההדדית או ארבעה מיקרוליטר של הבקרה החיובית או השלילית לכל באר. ובכן, כל מה שאני עושה זה להוסיף 16 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לכל אחד מהעושר. לאחר מכן אוסיף ארבעה מיקרוליטר של התמצית המנוטרלת ל-60 מיקרוליטר של תערובת המאסטר בבאר בסך הכל נפח תגובה של 20 מיקרוליטר.

ואני אעשה את אותו הדבר עבור השליטה החיובית והשלילית. הוספת ארבעה מיקרוליטר ל-16 מיקרוליטר עם תערובת מאסטר PPR. לאחר הוספת כולם, תוכלו לכסות אותם עם רצועת שמונה כובעים שקופה אופטית.

אתה רוצה להיזהר לא לגעת בחלק השקוף אופטית של המכסים שנמצאים מעל הדגימות שלך. אז אני משתמש במגבון קים כדי ללחוץ כלפי מטה על הכובעים כדי לוודא שהם אטומים. אז מערבלתי בעדינות את תערובת ה-PCR וה-DNA שלנו וסובבתי אותם למטה ועכשיו אנחנו מוכנים להכניס אותם למכונת ה-QPCR.

מה שאנחנו הולכים לעשות זה קודם כול, נטען את הדגימות שלנו למכונת ה-Opticon PCR ואני הולך להכין צלחת חדשה, שהבאר הראשונה שלנו תהיה הדגימה שלנו. הבאר השנייה שלנו תהיה הבקרה החיובית שלנו, והבאר השלישית שלנו היא הבקרה השלילית שלנו, מצאו שנפח התגובה שלנו הוא 20 מיקרוליטר בסך הכל. בשלב הבא אני הולך לטעון פרוטוקול שתוכנן עבור האדם היה גנוטיפ מהיר.

פרוטוקול זה כולל שלב דנטורציה של שלוש דקות, מחזור של 15 שניות של דנטורציה, 15 שניות של כריעה ראשונית ולאחר מכן 20 שניות של הארכה ראשונית. כעת מיכל ההארכה הראשי יכול למעשה לרדת לכ-10 שניות, וזה יהיה בסך הכל 40 שניות בלבד. עבור כל מחזור, יש לנו את שלושת השלבים האלה בערך פי 40 כמו PCR רגיל, ואז בסוף זה אנחנו לוקחים עקומת התכה.

אז יש לנו את הצלחת שלנו ויש לנו את הפרוטוקול שלנו טעון. כל מה שאנחנו צריכים לעשות עכשיו זה להריץ את ה-QPCR שלנו וזה מתחיל בשלוש דקות של דנטורציה. מהניסיון שלי, באמצעות הפריימרים שבהם אני משתמש ומשתמש בדגימות הזנב ואתם מחפשים את הגנים שאני מחפש, אני יודע שהחיוביים שלי יתחילו לעלות בסביבות 25 מחזורים שחוצים סף מחזורי של מובהקות.

עכשיו, מתי זה מצלב תלוי מאוד בדגימת הרקמה שלך ומה אתה מחפש וכמה מהדנ"א נמצא בהתחלה. אז אנחנו כבר יכולים לראות שהשליטה החיובית שלנו כבר עלתה ונראה שגם הדגימה שלנו חיובית. כפי שאתם רואים, זה מתחיל לעלות קצת אחרי השליטה החיובית שלנו.

אנחנו עדיין נצטרך לחכות לזה כי זה רק ב-27 מחזורים, אבל אני מקווה שבעוד כמה מחזורים, נוכל להיות בטוחים שהדגימה שלנו חיובית ואז אוכל להמשיך בניסוי שלי. בנקודה זו, אתה יכול לראות את השליטה השלילית רק מתחילה לעלות, וזה בגלל שלקחתי עודף זנב. זה עוזר לך להיות בטוח שכל מה שעולה לפני הזנב השלילי העודף הזה הולך להיות חיובי.

אז בנקודה זו, כל דבר שעולה לפני השלילי, הייתי מחשיב חיובי והייתי ממשיך בניסוי שלי. לאחר סיום הרכיבה על ה-PCR, המכונה מבצעת ניתוח עקומת התכה. זה יעזור לך לקבוע את ההרכב והטוהר של המוצר שלך.

בעזרת זה תוכלו לדעת אם בחרתם נכון את הדגימות החיוביות והשליליות. לדוגמה, לדגימה החיובית יהיה שיא טמפרטורת התכה חד ספציפי, המתאים למוצר PCR ספציפי, מוגבר. לכל דגימות שליליות יהיה שיא טמפרטורת התכה רחב לא ספציפי המתאים ל-DNA לא ספציפי שהוגבר במהלך ה-PCR.

אז זה עתה הראיתי לכם כיצד אנו משתמשים במגבר החילוץ Cyber Green של סיגמא כדי ליצור גנוטיפ מהיר של זנבות עכברים בוגרים. אבל ניתן להשתמש בערכה הזו עם רקמות שונות של בעלי חיים, שיער, רוק, ואני משתמש בה כדי ליצור גנוטיפ, זנבות עובריים של עכברים. אנחנו אוהבים להשתמש בערכה הזו כי היא מהירה.

אני יכול לקבל את הגנוטיפ שלי בחזרה תוך שעה, וזה מאוד נוח ופשוט. אז תודה על הצפייה ובהצלחה.